Summary
ייצור של ערוצי microfluidic ויישומן ניסויים לחקר התנהגות ליקוט chemotactic של חיידקים ימיים בתוך נוף ים מזין אחידה והתנהגות שחייה של חיידקים בתוך זרם גזירה מתוארים.
Abstract
המידה שבה planktonic חיידקים יכולים לנצל משאב טלאים microscale יהיו השלכות ניכרות trophodynamics האוקיאנית ושטף biogeochemical. עם זאת, כדי לנצל את תיקוני מזין בים, חיידקים שחייה להתגבר על ההשפעות של כוחות פיזיים כולל דיפוזיה מולקולרית גזירה סוערים, אשר יגבילו את הזמינות של טלאים ואת היכולת של חיידקים כדי לאתר אותם. עד לאחרונה, יש מגבלות מתודולוגיות בדיקות מנועה ישירה של התנהגות של חיידקים בתוך בתי גידול בלתי סדיר ומציאותי בקנה מידה קטן בתנאי זרימה. לפיכך, רוב הידע הנוכחי שלנו לגבי התנהגות של חיידקים בים כבר רכש מהתחזיות התיאורטיות לגביו. כדי להשיג מידע חדש על התנהגות שיחור מזון מיקרוביאלי באוקיינוס יישמנו רך טכניקות ייצור ליתוגרפיות לפתח 2 מכשירים microfluidic, אשר השתמשנו כדי ליצור (i) microscale טלאים מזין עם ממדים ומאפיינים diffusive רלוונטי תהליכים האוקיאנית (ii) microscale מערבולות, עם שיעורי גזירה המקביל לאלה צפוי בים. אלה מכשירים microfluidic התירו בדיקה הישירה הראשונה של השחייה חיידקים וההתנהגות chemotactic בתוך נוף ים הטרוגני ודינמי. השימוש בשילוב של epifluorescence והניגודיות מיקרוסקופיה שלב לאפשר בדיקות ישירה של ממדים פיזיים המאפיינים diffusive טלאים מזין, תוך שמירה על התגובה האוכלוסייה ברמה המצרפית, בנוסף להתנהגות שחייה של חיידקים בודדים. ניסויים אלה גילו כי כמה מינים של פיטופלנקטון, חיידקים heterotrophic ו הפרוטיסטים phagotrophic המיומנים באיתור וניצול לשדר טלאים משאב microscale בתוך מסגרות זמן קצר מאוד. הראינו גם כי עד מתונה בשיעורי גזירה, חיידקים ימיים המסוגלים להילחם זרימה לשחות דרך הסביבה שלהם מרצונם. עם זאת, מעבר לרמת סף גזירה גבוהה, חיידקים מיושרים בזרימת גזירה ומסוגלים פחות שחייה ללא הפרעה מן הזרם. מיקרופלואידיקה מייצג גישה חדשנית וזולה לחקר האקולוגיה של חיידקים ימיים, והן בשל התאמתה במדויק יצירת שדות זרימה מציאותי והדרגות המצע על microscale, הוא החלים באופן אידיאלי בדיקות של התנהגות חיידקים על המאזניים הקטן של אינטראקציה. לפיכך, אנו מציעים כי מיקרופלואידיקה מהווה כלי חשוב להשגת הבנה טובה יותר של האקולוגיה של מיקרואורגניזמים בים.
Protocol
הכנה
1. יצירת מסכה
שימוש בתוכנת תיב"ם, עיצוב הערוץ עבור הדפסה ברזולוציה גבוהה על שקיפות. זה יהיה "מסכה".
בחדר נקי:
2. נקה ואופים רקיק
ראשית, רקיק להשפריץ עם אצטון, אז מהר עם מתנול, ולאחר מכן עם Isopropanol. לבסוף, לייבש את פרוסות סיליקון באמצעות חנקן.
אופים את פרוסות בתנור (130 מעלות צלזיוס) במשך 5 דקות.
3. ציפוי רקיק
מניחים את פרוסות במרכז מכונה ספין הציפוי. יוצקים photoresist (SU-8) מהבקבוק על פרוסות סיליקון. תן את זרימת SU-8 ולהירגע עבור ~ 10 s. הפעל coater הכביסה, כבש את מהירותה עד 0-500 סל"ד מעל 5 s; לשמור על סל"ד 500 עבור s 10, כבש עד מהירות סופית של מעל 10 ולשמור על מהירות סופית 30 s. המהירות הסופית תלויה עובי הציפוי ממוקד SU-8 בשימוש. פרטים ניתן למצוא בכתובת http://www.microchem.com/
4. רכים לאפות
לאחר ציפוי רקיק, לאפות אותו לראשונה בגיל 65 ° C ולאחר מכן ב 95 ° C. זמן האפייה משתנה עם עובי סוג ממוקד של photoresist בשימוש. אז, בואו פרוסות סיליקון בטמפרטורת החדר במשך לפחות 5 דקות.
5. חשיפה
מניחים את המסכה על גבי פרוסות סיליקון ולחשוף את רקיק לאור UV בפעם מומלץ במדריך SU-8.
6. לאחר חשיפה לאפות
אופים את פרוסות סיליקון ב 65 ° C ולאחר מכן 95 ° C בעקבות SU-8 הוראות שימוש.
7. פיתוח רקיק כדי להשיג את "מאסטר" (עובש)
הכינו כוס מלא היזם (PMMA). לטבול את פרוסות לתוך כוס תוך נדנוד בעדינות את הכוס עד שלא נחשפו חלק של photoresist הוא נשטף.
במעבדה שלנו:
8. הכן PDMS ושופכים אותו על פרוסות סיליקון
מערבבים את PDMS עם סוכן ריפוי שלה ביחס 10:01 לתוך כוס. בוחשים ומערבבים homogenously: זה יפיק המון בועות להפוך את התערובת מבט אטום. יוצקים את התערובת על "אמן".
9. דה בועה בחלל ריק קאמרית
כדי להסיר את הבועות, הניח את התערובת אב PDMS כי הוא מכסה אותה לתוך תא ריק עד שכל הבועות נעלמו.
10. אפייה בתנור
אופים במשך לפחות 12 שעות בתנור ב 65 ° C להקשיח את PDMS.
11. פאנץ חורים
קולפים את PDMS מן האדון וחורים אגרוף עבור פתחי הכניסה שקעים של הערוצים.
בכל חדר נקי (לא מוצג)
12. פלזמה מליטה
ערוצי מודבקים לשקופית זכוכית לאחר הטיפול הן את שכבת PDMS ואת שקופיות זכוכית עם פלזמה חמצן דקות 1.
ניסויים:
Exp # 1: לחקור את התגובה chemotactic של חיידקים ימיים כדי מיקרו סולם שכבות תזונה
1) הגדרת הניסוי
- הוסף אורגניזמים מצעים כדי מזרקים זכוכית
- המקום ערוץ microfluidic לבמה מיקרוסקופ ולצרף צינורות אל פתחי הכניסה שקעים המתאים
- חיבור צינורות לבזבז המאגר. ודא צינורות הוא שקוע כולו מאגר פסולת בנוזל, כדי למנוע תנודות בלחץ
- מזרקים מקום על משאבת מזרק להתחבר שסתומים צינורות
- הגדרת מיקרוסקופ: בתנאי אור, הגדלה וכו '
- פוקוס על המיקום המתאים בערוץ
- דה בועה הערוץ באמצעות מזרק גדול מלא במי ים מלאכותי
- הגדר קצב הזרימה המתאים על משאבת מזרק. במקרה זה 2 מ"ל / דקה, אשר תואמים את מהירות זרימה ממוצעת של 220 s -1 מיקרומטר בערוץ
2) הפעלת הניסוי
- הפעל את משאבת מזרק להקים שיפוע מזין בערוץ
- לאחר זרימה התייצב ותזמורת של חומרים מזינים פיתחה, לעצור את הזרימה על המשאבה את המזרק ולהתחיל זמן הקלטה מנקודה זו
- הלהקה מזין מתחיל מפוזר רוחבית
- במרווחי זמן קבועים, שימוש בתוכנות ניתוח תמונה להקליט רצף של מסגרות כדי ליצור "סרטים"
- להפלות אורגניזמים שחייה ידי נטילת זמן ההבדל בין שתי מסגרות לתמונות הבאות, כך שרק אובייקטים נעים כעת דמיינו, מה שמאפשר לנו להבדיל בין תאים ניעתי שאינו זז חלקיקים רעשי רקע
- קח סרטים לקבוע עמדות של תאים בערוץ תוך התייחסות position התיקון מזין
- סרטים שיא במרווחי זמן קבועים במשך 10-20 דקות לנתח את עמדות ודפוסי השחייה של אורגניזמים
- באמצעות תוכנת ניתוח התמונה כדי להניח את העמדות של אורגניזמים במסגרות שונות (הקצאת כל פיקסל בעוצמת האור המרבית נרשמה פיקסל שבמהלך תקופת הסרט), אנו יכולים לקבל מידע על מסלול תאים שחייה
Exp # 2: לחקור את ההשפעות של גזירה על חיידקים ימיים שחייה vortexZ
- שימוש בגיאומטריה ערוצים שונים, אנחנו יכולים לצפות את ההתנהגות של חיידקים שחייה במערבולת בשיעורים גזירה שונים
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הבנה של האופן שבו חיידקים ימיים אינטראקציה עם כימיקל המקומית שלהם הסביבה הפיזית הכרחי עבור תפיסה מלאה ומדויקת יותר של התפקיד של מיקרואורגניזמים planktonic ב מזין האוקיינוסים ופחמן מחזורים (עזאם ו Malfatti 2007). עם זאת, בשל המאזניים קטן (מ"מ <) על אינטראקציות אשר רבים של חיידקים חשובים מתרחשים, מגבלות טכניות מנעו בדיקות מפורטות של התנהגות של חיידקים בתוך הנוף ביו פיסיקלי כימי הטרוגנית חזו להיות מנוסים על ידי חיידקים שחייה בים. התפתחויות אחרונות מיקרופלואידיקה (Whitesides et al. 2001) אפשרו ניתוחים מפורטים של אקולוגיה של חיידקים בתוך microhabitats מורכבות (מאו et al. 2003, פארק et al. 2003, קיימר et al. 2006, מרקוס ו שטקר 2006). מכשירים microfluidic המתואר כאן מאפשר לנו לבחון גם את התגובה chemotactic של חיידקים ימיים תיקון מזין לשדר (Blackburn et al. 1997, 1998) ואת התנהגות שחייה של חיידקים בתוך גזירה סוערים, ברמת תא בודד.
תהליך ייצור רך ליתוגרפיות מעורב בקבלת ערוצי microfluidic מאפשרת הפרטים המורכבים להיווצר בתוך ארכיטקטורת הערוץ, המתיר שליטה מדויקת של תזרימי והדרגות בתוך הערוצים. גמישות המוענקת על ידי טכניקת ייצור מאפשר ערוצי הממדים השונים להיווצר ללימודים השוואתיים. מערכת ניתוח התמונה להחיל כאן מאפשרת ויזואליזציה של תאים בודדים והדרגות מזין, המספקת פלטפורמה לניתוח כמותי מפורט של שחייה חיידקים וההתנהגות chemotactic בתא בודד גם ברמת האוכלוסייה.
יש לנו ליישם את הערוץ הזה microfluidic כמו assay chemotaxis רגיש עבור מגוון רחב של חיידקים ימיים שחייה ו מצאו כי מינים רבים מסוגלים להגיב במהירות טלאי לשדר חומרים מזינים, ויצרו מצבורים צפופים של תאים בתוך ריכוזי מזין גבוה בתוך התיקון. במהלך הצטברות chemotactic של תאים בתוך התיקון מזין, מינים מסוימים יש גם הציג המסומנים משמרות התנהגותיים, לרבות שינויים מהירות השחייה ולהפוך תדר. התצפיות שלנו לספק תמיכה ניסיונית ההשערה כי חיידקים ימיים יכולים לנצל קצרת טלאים מזין בים כמו גידול צמיחה חשוב.
שימוש בגיאומטריה ערוצים שונים, אנו מסוגלים לייצר microvortices יציב על סולמות רלוונטי הדינמיקה של חיידקים בסביבה המימית. התקנה זו מאפשרת לנו לבחון את ההתנהגות של חיידקים שחייה בתגובה שיעורי גזירה שונים. בניגוד להתנהגות שחייה אקראי בתנאי תזרים שקט, תחת השפעה של גזירה חזק, חיידקים גם לעקוב מייעלת של שדה הזרימה מיושרים איתם. ההתקנה זה מציע תובנה חשובה על האינטראקציה הבסיסית בין מיקרואורגניזמים בסביבה דינמיות הנוזלים שלהם.
בכל הניסויים הללו, מיקרופלואידיקה הוכיחה להיות כלי יעיל לחקר התנהגות של חיידקים בתוך microhabitats דינמי. עם ההכרה הגוברת בחשיבות הדינאמיקה של חיידקים בתוך בתי גידול טבעיים, יישומים הרומן של הטכנולוגיה microfluidic, אנו ממליצים כי צימוד נוסף של מיקרופלואידיקה עם אקולוגיה של חיידקים תניב תובנות חדשות חשובות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
ברצוננו להודות מיקרוסיסטמס מעבדות טכנולוגיה ב-MIT עבור ומאפשר לנו חלק בסרט הווידאו הזה במתקן חדר נקי.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| PDMS, Sylgard 184 | Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | http://www.ellsworth.com/sylgard.html | |
| SU8-2100 | Photoresist | MicroChem Corp. | www.microchem.com | |
| Nikon Eclipse TE2000-E inverted microscope | Microscope | Nikon Instruments | ||
| PEEK tubing (0.762 mm ID, 1.59 mm OD) | Tool | Upchurch Scientific | www.upchurch.com | |
| Syringes (Luer-Lok Tip) | Tool | BD Biosciences | ||
| Fitting Part P-704-01 | Tool | Upchurch Scientific | To connect tubing to Luer-Lok Tip Syringes | |
| Syringe Pump (PHD 2000 Programmable) | Equipment | Harvard Apparatus | ||
| CCD Camera (PCO 1600) | Equipment | Cook |
References
- Azam, F., Malfatti, F. Microbial structuring of marine ecosystems. Nature Reviews Microbiology. 5, 782-791 (2007).
- Blackburn, N., Azam, F., Hagstrom, A. Spatially explicit simulations of a microbial food web. Limnology and Oceanography. 42, 613-622 (1997).
- Blackburn, N., Fenchel, T., Mitchell, J. G. Microscale nutrient patches in plankton habitats shown by chemotactic bacteria. Science. 282, 2254-2256 (1998).
- Keymer, J. E., Galajda, P., Muldoon, C., Park, S., Austin, R. H. Bacterial metapopulations in nanofabricated landscapes. Proceedings of the National Academy of Science. 103, 17290-17295 (2006).
- Mao, H., Cremer, P. S., Manson, M. D. A sensitive, versatile microfluidic assay for bacterial chemotaxis. Proceedings of the National Academy of Science. 100, 5449-5454 (2003).
- Marcos,, Stocker, R. Microorganisms in vortices: a microfluidic setup. Limnology and Oceanography: Methods. 4, 392-398 (2006).
- Park, S., Wolanin, P. M., Yuzbahyan, E. A., Lin, H., Darnton, N. C., Stock, J. B., Silberzan, P., Austin, R. Influence of topology on bacterial social interaction. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100, 13910-13915 (2003).
- Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. Soft lithography in biology and biochemistry. Annual Review of Biomedical Engineering. 3, 335-373 (2001).
