Summary
マイクロ流体チャネルおよび斑状の栄養の海の風景とせん断流内細菌の遊泳行動の中で海洋微生物の化学走性採食行動を研究するための実験で、その実装の製造が記載されている。
Abstract
浮遊微生物は、マイクロリソースのパッチを利用できる程度は、海洋trophodynamicsと生物地球化学的フラックスにかなりの影響を持つことになります。しかし、海洋における栄養のパッチを利用するために、水泳の微生物は、パッチの可用性と、それらを検索する細菌の能力を制限する分子拡散と乱流せん断、を含む物理的な力の影響を克服する必要があります。最近まで、方法論的限界は、斑状の生息地と現実的な小さなスケールの流れの条件の中で微生物の挙動の直接検査を排除している。したがって、はるかに海の微生物の挙動に関する我々の現在の知識の多くは、理論的な予測から調達されています。我々は海洋プロセスに関連する寸法と拡散性の特性を持つ我々が作成するために使用されている2マイクロ流体デバイスは、（i）マイクロ栄養素のパッチを開発するためのソフトリソグラフィ加工技術を適用している海の微生物の餌行動に新しい情報を取得するには、および（ii）マイクロスケール海で予想されるものに相当するせん断速度と渦、。これらのマイクロ流体デバイスは、異種と動的な海の風景の中の微生物水泳と走化性行動の最初の直接検査を認めている。個々の微生物の遊泳行動に加えて、人口レベルの集合反応を観察しながら落射蛍光、位相差顕微鏡の併用は、物理的な寸法や栄養素のパッチの拡散特性の直接検査を可能にする。これらの実験は、植物プランクトン、従属栄養細菌とphagotrophic原生生物のいくつかの種が非常に短い時間枠内に拡散マイクロリソースのパッチを見つけて悪用することに熟達していることを明らかにした。我々はまた、せん断速度を緩和することを示している、海洋細菌は、自発的にその環境を経由して流れ、スイムを戦うことができます。しかし、しきい値高せん断レベルを超えて、細菌はせん断流れに整列し、フローからの外乱なし水泳の少ない能力がありますされています。マイクロフルイディクスは、水生微生物の生態を研究するための新規かつ安価なアプローチを表し、かつ正確にマイクロスケールでの現実的な流れ場と基板のグラデーションを作成するための適性のために、相互作用の最小スケールでの微生物の挙動の試験に理想的に適用可能です。そこで、マイクロフルイディクスは、海の微生物の生態の理解を得るための貴重なツールを表すことを示唆している。
Protocol
準備
1。マスクを作成する
CADソフトウェアを使用して、透明で高解像度印刷用のチャネルを設計する。これは、"マスク"になります。
クリーンルーム内で：
2。ウェハをクリーニングして焼く
アセトンと、その後すぐにメタノールで、その後、イソプロパノールで最初に、噴出ウェハ。最後に、窒素を用いてウェハを乾燥させる。
5分間、オーブン（130℃）でウエハを焼く。
3。コーティングウェハー
スピンコーティングマシンの中心にウェハを置きます。ウェハ上に瓶から注ぐフォトレジスト（SU - 8）。 SU - 8の流れを聞かせて〜10秒間リラックススピンコーターをオンにして、5秒かけて0から500 rpmにその速度を増加させる、10秒間、500rpmで維持、10秒以上の最終的な速度まで上昇し、30秒のために最終的な速度で維持する最終速度は、使用されるターゲットコーティングの厚さとSU - 8によります。詳細はで見ることができますhttp://www.microchem.com/
4。ソフトベーク
コーティング後のウェーハは、° C、その後95℃65℃最初にそれを焼く℃に焼成時間は、ターゲットの厚さと使用されるフォトレジストの種類によって異なります。その後、ウェーハは、少なくとも5分間室温で放置します。
5。露出
ウェハの上にマスクを配置し、SU - 8のマニュアルで推奨されている時間のために紫外線にウェハを公開。
6。露光後ベーク
65でウエハを焼くその後° Cおよび95 ° C以下のSU - 8のマニュアルの指示に従ってください。
7。 "マスター"（金型）を取得するためにウェーハを開発
開発者（PMMA）で満たされたビーカーを準備します。フォトレジストの未露光部分は洗い流されるまで、非常に静かにビーカーを発振しながらビーカーにウェハを浸し。
私たちの研究室で：
8。 PDMSを準備して、ウェハ上に注ぐ
カップに10:1の比では硬化剤とPDMSを混ぜる。かき混ぜ、それが均質に混合する：これは、気泡をたくさん生成し、混合物が不透明に見えるようになります。 "マスター"の混合物を注ぐ。
9。真空チャンバー内の脱泡
気泡を除去するため、すべての泡がなくなるまで真空チャンバ内にそれをカバーしているマスターとPDMS混合物を置く。
10。オーブンでベーキング
65℃硬化PDMSのオーブンで少なくとも12時間焼く。
11。パンチ穴
チャンネルのインレットとアウトレットのためのマスターとパンチ穴からPDMS剥離。
クリーンルーム内（図示せず）
12。プラズマボンディング
チャネルは、PDMS層と1分間の酸素プラズマによるガラスのスライドの両方を処理した後、スライドガラスに接着されている。
実験：
EXP＃1：マイクロスケールの栄養素層への海洋微生物の走化性応答の調査
1）実験のセットアップ
- ガラスシリンジに生物と基板を追加します。
- 顕微鏡ステージ上にマイクロ流体チャネルを置き、適切なインレットとアウトレットにチューブを取り付け
- 貯水池を無駄にチューブを接続します。チューブが完全に圧力の振動を避けるために、廃液溜めに流体に浸漬されていることを確認します
- シリンジポンプにシリンジを配置し、バルブとチューブに接続
- 光条件、倍率等：顕微鏡を設定する
- チャンネル内の適切な位置に焦点を当てる
- 人工海水で満たされた大きな注射器を使用してデバブルチャネル
- シリンジポンプの適切な流量を設定します。この場合のチャネルで220μmのs -1の平均流速に対応し2ml /分、
2）実験の実行
- チャンネル内の栄養勾配を確立するためにシリンジポンプを起動します。
- 流れが安定していると栄養素のバンドが開発されると、シリンジポンプにフローを停止し、この時点から時間の録音を開始
- 栄養バンドは、横方向に拡散し始めます
- 定期的な時間間隔で、"ムービー"を作成するフレームのシーケンスを記録するために画像解析ソフトウェアを使用
- 私たちは動いていない粒子とバックグラウンドノイズから運動性の細胞を区別できるように、これだけ移動するオブジェクトが現在可視であることを、2つの後続のフレーム間の時間差画像を取ることによって泳ぐ生物を区別する
- Pへの参照を使用して、チャネル内のセルの位置を決定するために映画を取る栄養パッチのosition
- 10-20分のための定期的な間隔で記録映画は、位置と生物の遊泳パターンを分析する
- 別のフレーム（各ピクセルに映画の期間にわたってそのピクセルで記録された最大光強度を割り当てる）で生物の位置を重ね合わせ画像解析ソフトを使用することにより、我々は、水泳の細胞のための軌道情報を取得することができます
EXP＃2：vortexZで泳いでいる海洋細菌に対する剪断の影響を調査
- 別のチャネル形状を使用して、我々は異なるせん断速度でボルテックスで泳いで細菌の挙動を観察することができます
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Discussion
海洋微生物は、その局所的な化学および物理的環境との対話方法を理解することは海洋の栄養と炭素循環（アザムとマルファッティ2007）におけるプランクトンの微生物の役割のより完全で正確な認識のために不可欠です。しかし、多くの重要な微生物の相互作用が行われる以上の小スケール（<MM）のために、技術的な限界は、異種生物物理化学的風景の中で微生物の挙動の詳細な検査を妨げている海で泳いで微生物によって経験されると予測。マイクロフルイディクスの最近の進歩（ホワイトサイズら2001）（真央ら、2003、Parkら、2003、キーマーほか2006、マルコスとストッカー2006）複雑な微細環境内微生物生態学の詳細な分析を有効にしている。マイクロ流体デバイスは、私たちは、単一細胞レベルで、乱流せん断中に拡散する栄養パッチ（ブラックバーンら。1997年、1998年）と微生物の遊泳行動への海洋微生物の走化性応答の両方をチェックすることが許容さここで説明する。
マイクロ流体チャネルを作成するためには、ソフトリソグラフィ製造プロセスは、チャネル内の流れと勾配の正確な制御を可能にして、チャネルのアーキテクチャ内で作成される複雑な詳細を可能にする。製造技術によってもたらされる柔軟性は、比較研究のために作成される様々な次元のチャンネルが可能になります。画像解析システムは、ここに適用単一セルと集団レベルの両方で、微生物の水泳と走化性行動の詳細な定量分析のためのプラットフォームを提供し、個々の細胞や栄養勾配の可視化を可能にします。
我々は、海洋微生物の水泳の様々な敏感な走化性アッセイとしてこのマイクロ流体チャネルを適用しており、多くの種が急速にパッチ内部の高い栄養濃度内での細胞の密な集合体を形成し、栄養素の拡散パッチへの対応が可能であることを発見した。栄養パッチ内の細胞の走化性の蓄積の間に、いくつかの種でもスピードを泳ぐと周波数を回すの変化などマークの行動変化を、展示している。我々の観察では、海洋微生物が重要な成長の生息地として海に短命の栄養素のパッチを利用することができるという仮説の実験的なサポートを提供しています。
異なるチャネルのジオメトリを使用して、我々は、水生環境における微生物の動態に関連する尺度の安定microvorticesを生成することができます。このセットアップでは、私たちは異なるせん断速度に対応して泳いで細菌の挙動を観察することができます。静止フロー条件下でランダムな遊泳行動とは対照的に、強いせん断の影響の下で、細菌は、両方の流れ場の流線とそれらの位置が合っているに従ってください。このセットアップでは、微生物とその流体力学的環境との間の基本的な相互作用に関する貴重な洞察を提供しています。
これらの実験のそれぞれにおいて、マイクロフルイディクスは、動的な微細環境内微生物の挙動を研究するための有効なツールであることが証明されている。自然の生息地内の微生物の動態、およびマイクロ流体技術の新たなアプリケーションの重要性の増加の認識で、我々は微生物生態学とマイクロ流体のさらなる結合が重要な新しい洞察をもたらすことを示唆している。
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Acknowledgments
私たちは、クリーンルーム施設内のこのビデオのフィルムの部分に私たちを可能にするため、MITのマイクロ技術研究所に感謝したいと思います。
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| PDMS, Sylgard 184 | Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | http://www.ellsworth.com/sylgard.html | |
| SU8-2100 | Photoresist | MicroChem Corp. | www.microchem.com | |
| Nikon Eclipse TE2000-E inverted microscope | Microscope | Nikon Instruments | ||
| PEEK tubing (0.762 mm ID, 1.59 mm OD) | Tool | Upchurch Scientific | www.upchurch.com | |
| Syringes (Luer-Lok Tip) | Tool | BD Biosciences | ||
| Fitting Part P-704-01 | Tool | Upchurch Scientific | To connect tubing to Luer-Lok Tip Syringes | |
| Syringe Pump (PHD 2000 Programmable) | Equipment | Harvard Apparatus | ||
| CCD Camera (PCO 1600) | Equipment | Cook |
References
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