Summary
A fabricação de canais microfluídicos ea sua aplicação em experimentos para estudar o comportamento de forrageamento quimiotática de micróbios marinhos de uma seascape irregular de nutrientes eo comportamento de natação de bactérias dentro do fluxo de cisalhamento são descritos.
Abstract
O grau em que os micróbios podem explorar planktonic manchas de recursos microescala terá implicações consideráveis para trophodynamics oceânicas e de fluxo biogeoquímicos. No entanto, para tirar proveito de patches de nutrientes no oceano, os micróbios natação deve superar as influências de forças físicas incluindo a difusão molecular e turbulenta de cisalhamento, o que limitará a disponibilidade de patches e a capacidade das bactérias para localizá-los. Até recentemente, as limitações metodológicas têm impedido exames direta do comportamento microbiano dentro de habitats irregular e condições realistas de pequena escala de fluxo. Assim, muito do nosso conhecimento atual em relação ao comportamento microbiano no oceano foi obtida a partir de previsões teóricas. Para obter novas informações sobre o comportamento de forrageamento microbiana no oceano temos aplicado suave técnicas de fabricação litográfica para desenvolver dois dispositivos microfluídicos, que temos usado para criar (i) micro nutrientes manchas com dimensões e características difusivos relevantes para processos oceânicos e (ii) microescala vórtices, com taxas de cisalhamento correspondente aos esperados no oceano. Estes dispositivos microfluídicos têm permitido um primeiro exame direto de natação microbiana e comportamento quimiotáticos dentro de um seascape heterogêneo e dinâmico. O uso combinado de epifluorescência e microscopia de contraste de fase permitem exames diretos das dimensões físicas e as características difusivo de patches de nutrientes, enquanto observa a resposta agregativa em nível de população, além do comportamento de natação de micróbios individuais. Esses experimentos revelaram que algumas espécies de fitoplâncton, bactérias heterotróficas e protistas phagotrophic são peritos em localizar e explorar difusão manchas de recursos microescala em prazos muito curtos. Também mostramos que até moderada taxas de cisalhamento, bactérias marinhas são capazes de lutar contra o fluxo e nadar através de seu ambiente de sua própria vontade. No entanto, além de um nível de cisalhamento alto limiar, bactérias estão alinhados no fluxo de cisalhamento e são menos capazes de nadar sem perturbação do fluxo. Microfluídica representa uma nova abordagem e barato para estudar a ecologia microbiana aquática, e devido a sua aptidão para a criação de campos de fluxo com precisão realista e gradientes de substrato em microescala, é idealmente aplicável aos exames de comportamento microbiana nas menores escalas de interação. Assim, sugerimos que a microfluídica representa uma valiosa ferramenta para a obtenção de uma melhor compreensão da ecologia de microrganismos no oceano.
Protocol
Preparação
1. Crie uma Máscara
Usando um software CAD, design do canal de alta resolução de impressão em uma transparência. Esta será a "máscara".
Na sala limpa:
2. Limpe e coza a bolacha
Primeiro, o wafer esguicho com acetona, em seguida, rapidamente, com metanol, em seguida, com Isopropanol. Por fim, seque o wafer usando nitrogênio.
Asse o wafer no forno (130 ° C) por 5 min.
3. Revestimento do wafer
Coloque a bolacha no centro da máquina de spin-coating. Despeje fotorresiste (SU-8) da garrafa para o wafer. Permitir o fluxo de SU-8 e relaxar por ~ 10 s. Ligue o spin-coater e rampa a sua velocidade até 0-500 rpm por 5 s; manter a 500 rpm por 10 s; rampa até a velocidade final de mais de 10 s e manter a velocidade final de 30 s. A velocidade final depende da espessura do revestimento alvo e os SU-8 usada. Os detalhes podem ser encontrados em http://www.microchem.com/
4. Soft-bake
Após o revestimento do wafer, cozê-lo primeiro em 65 ° C e depois a 95 ° C. O tempo de cozimento varia de acordo com a espessura alvo e tipo de fotorresiste utilizado. Então, deixe o wafer sentar-se à temperatura ambiente por pelo menos 5 min.
5. Exposição
Colocar a máscara em cima do wafer e expor a hóstia à luz UV durante o tempo recomendado no manual do SU-8.
6. Pós-exposição bake
Asse o wafer de 65 ° C e 95 ° C, em seguida, após o SU-8 manual de instruções.
7. Desenvolvimento do wafer para obter o "master" (molde)
Prepare um copo cheio do desenvolvedor (PMMA). Mergulhar a bolacha no copo, enquanto muito gentilmente oscilando o copo até que a parte não exposta do fotorresiste é lavado.
Em nosso laboratório:
8. Prepare PDMS e derramá-lo sobre o wafer
Misture o PDMS com seu agente de cura em razão de 10:1 em um copo. Mexa e misture de forma homogênea: isso vai gerar muitas bolhas e fazer a mistura olhar opaco. Despeje a mistura sobre o "mestre".
9. De-bolha no vácuo da câmara
Para remover as bolhas, colocou a mistura mestre e PDMS que está cobrindo-o em uma câmara de vácuo até que todas as bolhas se foram.
10. Assando no forno
Leve ao forno por, pelo menos, 12 horas em estufa a 65 ° C para endurecer o PDMS.
11. Furos
Retire a PDMS do mestre e furos para entradas e saídas dos canais.
Em salas limpas (não mostrado)
12. Plasma de ligação
Canais são ligados a uma lâmina de vidro após o tratamento tanto a camada de PDMS e lâmina de vidro com plasma de oxigênio por 1 min.
Experimentos:
Exp # 1: Investigar a resposta quimiotática de micróbios marinhos para micro-escala camadas de nutrientes
1) Configurando o experimento
- Adicionar organismos e substratos para seringas de vidro
- Lugar canal microfluídicos para o palco microscópio e anexar tubulação para entradas e saídas apropriadas
- Conecte a tubulação de resíduos do reservatório. Certifique-se de tubulação é totalmente submersos no fluido no reservatório de resíduos para evitar oscilações de pressão
- Seringas lugar em bomba de seringa e conecte-se válvulas e tubulação
- Configurar microscópio: condições de iluminação, ampliação, etc
- Concentre-se em posição apropriada no canal
- De-bolha canal usando seringa maior cheia com água do mar artificial
- Defina a taxa de fluxo apropriado em bomba de seringa. Neste caso, 2 ml / min, que corresponde a uma velocidade de fluxo médio de 220 mm s -1 no canal
2) A execução do experimento
- Iniciar bomba de seringa para estabelecer um gradiente de nutrientes no canal
- Quando o fluxo se estabilizou, e uma banda de nutrientes tem desenvolvido, interromper o fluxo da bomba de seringa e começar a gravar o tempo a partir deste ponto
- Banda de nutrientes começa a se difundir lateralmente
- Em intervalos regulares de tempo, use o software de análise de imagem para gravar sequências de frames para criar "filmes"
- Discriminar os organismos de natação, tendo tempo de diferença entre duas imagens quadros subseqüentes, de modo que somente objetos em movimento agora são visualizadas, permitindo-nos diferenciar células móveis de não-movimento de partículas e de ruído de fundo
- Fazer filmes para determinar posições de células do canal com referência ao pOSIÇÃO do patch de nutrientes
- Gravar filmes em intervalos regulares por 10-20 min para analisar as posições e padrões de natação de organismos
- Usando o software de análise de imagem para sobrepor as posições de organismos em diferentes quadros (atribuindo a cada pixel a intensidade de luz máxima registrada naquele pixel ao longo da duração do filme), podemos obter informações trajetória para as células de natação
Exp # 2: Investigar os efeitos de cisalhamento em bactérias marinhas nadando em um vortexZ
- Usando a geometria canal diferente, podemos observar o comportamento das bactérias nadando em um vórtice em diferentes taxas de cisalhamento
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Discussion
Uma compreensão de como micróbios marinhos interagem com seus química local e ambiente físico é imprescindível para uma percepção mais completa e precisa do papel de microorganismos planctônicos na nutrientes e carbono oceanos ciclos (Azam e Malfatti 2007). No entanto, devido à pequena escala (mm <) sobre o qual muitas interações microbiana importante ter lugar, as limitações técnicas impediram exames detalhados do comportamento microbiano na paisagem bio-físico-químicas heterogêneas previsto para ser experimentado por micróbios nadar no oceano. Os recentes avanços na microfluídica (Whitesides et al. 2001) permitiram uma análise detalhada da ecologia microbiana dentro microhabitats complexos (Mao et al. 2003, Park et al. 2003, Keymer et al. 2006, Marcos e Stocker 2006). Os dispositivos microfluídicos descritas aqui nos permitiu analisar tanto a resposta quimiotática de micróbios marinhos para um patch de nutrientes de difusão (Blackburn et al. 1997, 1998) eo comportamento de natação de micróbios dentro de cisalhamento turbulenta, em um nível única célula.
O processo de fabricação litográfica moles envolvidos na realização do canais microfluídicos permite intrincados detalhes para ser criado dentro da arquitetura do canal, permitindo o controle preciso dos fluxos e gradientes dentro dos canais. Flexibilidade proporcionada pela técnica de fabricação permite a canais de várias dimensões a ser criado para estudos comparativos. O sistema de análise de imagens aplicado aqui permite a visualização de células individuais e gradientes de nutrientes, proporcionando uma plataforma para a análise quantitativa detalhada da natação microbiana e comportamento em ambos quimiotático única célula-a e nível de população.
Nós aplicamos este canal microfluídicos como um ensaio de quimiotaxia sensível para uma variedade de micróbios marinhos de natação e descobriram que muitas espécies são capazes de responder rapidamente a um trajeto de difusão de nutrientes, formando agregações densas de células dentro da alta concentração de nutrientes dentro do patch. Durante a acumulação quimiotáticos de células dentro do patch de nutrientes, algumas espécies têm também exibiu marcada mudanças comportamentais, incluindo mudanças na natação de velocidade e giro de freqüência. Nossas observações fornecem suporte experimental para a hipótese de que micróbios marinhos pode utilizar curta manchas de nutrientes no oceano como habitats de crescimento importante.
Usando a geometria canal diferente, somos capazes de gerar microvortices estável em escalas relevantes para a dinâmica microbiana no ambiente aquático. Esta configuração permite-nos observar o comportamento das bactérias nadar em resposta a diferentes taxas de cisalhamento. Em contraste com o comportamento de natação aleatória sob condição de fluxo em repouso, sob a influência de uma forte cisalhamento, as bactérias ambos seguem agiliza do campo de fluxo e estão alinhados com eles. Esta configuração oferece uma visão valiosa sobre a interação fundamental entre microorganismos e seu ambiente fluido dinâmico.
Em cada um desses experimentos, microfluídica tem provado ser uma ferramenta eficaz para estudar o comportamento microbiano dentro microhabitats dinâmico. Com um crescente reconhecimento da importância da dinâmica microbiana dentro de habitats naturais, e novas aplicações de tecnologia microfluídica, sugerimos que o acoplamento adicional de microfluídica com a ecologia microbiana trará novos insights importantes.
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Acknowledgments
Gostaríamos de agradecer Microsystems Technology Laboratories no MIT por nos permitir filme parte deste vídeo na instalação de sala limpa.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| PDMS, Sylgard 184 | Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | http://www.ellsworth.com/sylgard.html | |
| SU8-2100 | Photoresist | MicroChem Corp. | www.microchem.com | |
| Nikon Eclipse TE2000-E inverted microscope | Microscope | Nikon Instruments | ||
| PEEK tubing (0.762 mm ID, 1.59 mm OD) | Tool | Upchurch Scientific | www.upchurch.com | |
| Syringes (Luer-Lok Tip) | Tool | BD Biosciences | ||
| Fitting Part P-704-01 | Tool | Upchurch Scientific | To connect tubing to Luer-Lok Tip Syringes | |
| Syringe Pump (PHD 2000 Programmable) | Equipment | Harvard Apparatus | ||
| CCD Camera (PCO 1600) | Equipment | Cook |
References
- Azam, F., Malfatti, F. Microbial structuring of marine ecosystems. Nature Reviews Microbiology. 5, 782-791 (2007).
- Blackburn, N., Azam, F., Hagstrom, A. Spatially explicit simulations of a microbial food web. Limnology and Oceanography. 42, 613-622 (1997).
- Blackburn, N., Fenchel, T., Mitchell, J. G. Microscale nutrient patches in plankton habitats shown by chemotactic bacteria. Science. 282, 2254-2256 (1998).
- Keymer, J. E., Galajda, P., Muldoon, C., Park, S., Austin, R. H. Bacterial metapopulations in nanofabricated landscapes. Proceedings of the National Academy of Science. 103, 17290-17295 (2006).
- Mao, H., Cremer, P. S., Manson, M. D. A sensitive, versatile microfluidic assay for bacterial chemotaxis. Proceedings of the National Academy of Science. 100, 5449-5454 (2003).
- Marcos,, Stocker, R. Microorganisms in vortices: a microfluidic setup. Limnology and Oceanography: Methods. 4, 392-398 (2006).
- Park, S., Wolanin, P. M., Yuzbahyan, E. A., Lin, H., Darnton, N. C., Stock, J. B., Silberzan, P., Austin, R. Influence of topology on bacterial social interaction. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100, 13910-13915 (2003).
- Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. Soft lithography in biology and biochemistry. Annual Review of Biomedical Engineering. 3, 335-373 (2001).
