Summary
우리는 형태, 생리, 극성, 그리고 성인 기본 조직의 단백질과 유전자 발현 패턴을 전시 인간 태아의 망막 색소 상피 세포 (hfRPE) 세포의 culturing 합류 monolayers에 대한 재현성 방법을 제공합니다. 이 작품은 여러 가지 안과 질환의 동물 모델로 확장되었습니다.
Abstract
우리는 인간의 기본 RPE의 형태학의, 생리 및 유전 특성과 기본 인간 태아의 망막 안료 상피 (hfRPE) 문화의 합류 monolayers의 대량 생산 수있는 세포 배양 절차를 개발했습니다. 이러한 hfRPE 세포 문화는 무거운 착색을 전시하고, 전자 현미경은 광범위한 혀끝의 멤브레인 microvilli을 보여줍니다. junctional 단지는 다양한 꽉 접합 단백질의 immunofluorescence 라벨로 확인되었습니다. 이 쉽게 재현할 주요 문화 상피 극성과 기능은 밀접하게 이전에 인간을 포함하여 기본 RPE의 포유 동물 모델을 공부 유사. 이러한 결과는 인간의 안구 질환의 여러 동물 모델에 치료 개입의 발달에 의해 확장되었다. 우리는 망막이나 subretinal 공간에서 이상 유체 축적을 제거하기위한 전략에 초점을했습니다. 세포외 subretinal 공간 photoreceptor 외부 세그먼트와 RPE의 혀끝의 막을 분리 및 망막 첨부 파일의 유지 보수 및 RPE / 망막 상호 작용의 전체 호스트에 대한 중요합니다.
Protocol
1. 인간 태아 조직
모든 인체 조직 관련 연구가 헬싱키 선언문과 NIH 기관 검토 보드의 신조를 따릅니다. 태아 눈은 얼음 포장 튜브 (ABR에 의해 제공)가 포함된 RPMI - 1640 미디어에 배치 태동의 16~22주에서 무작위 기증자,에서, 독립 획득자, 고급 Bioscience 자원 (ABR, 알라 메다, CA)에 의해 얻어, 그리고 하룻밤 우선 배달 서비스 제공. 조직은 핵의 제거 후 가능한 최대 48 시간 남아 있습니다.
2. 세포 배양 매체
멤 - 알파 변경 중간 (시그마 - 알드리치)는 5 %를 준비하는 기본 매체로 사용하고 RPE 세포의 culturing (RPE 매체, 아래 표 1) 15% 혈청 함유 미디어입니다.
| 이름 | 시그마 | Gibco | 양 | 저장 |
| 멤, 알파 수정 | M - 4526 | 500 ML | 4는 ° C | |
| N1 보충 | N - 6530 | 5 ML | 4는 ° C | |
| 페니실린 - 스트렙토 마이신 | 15140-148 | 5 ML | -20 ° C | |
| GlutaMax - I | 35,050 | 5 ML | -20 ° C | |
| 비 필수 아미노산 | M - 7145 | 5 ML | 4는 ° C | |
| THT의 * | -80 ° C이 | |||
| 타우린 | T - 0625 | 125 MG | ||
| 하이드로코티손 | H - 0396 10 | 10 μg | ||
| Triiodo - thyronin | T - 5516 | 0.0065 μg | ||
| 태아 소 혈청 ** | 5% 또는 15% | -80 ° C이 |
표 1. 500 ML 매체의 작성에 대한 인간 태아 RPE 매체 구성 요소
* THT는 매체를하기 전에 한 1.5 ML PBS에서 타우린 - 하이드로코티손 - triiodo - thyronin을 용해하여 이루어집니다. 여러 aliquots는 -80에서 만든 저장됩니다 ° C는 문화 매체 culturing 준비를 단순화합니다.
** 태아 소 혈청은 시그마 - 알드리치 또는 Gibco로부터 얻은되지 않습니다.
미디어 준비에 사용되는 태아 소 혈청은 애틀란타 체액 (노르, GA)에서 얻은 것입니다. 혈청의 각 병 사용하기 전에 (56 ° C 1 시간)을 inactivated 열 수 있습니다. 그들은 미디어 준비에 사용되기 전까지는 같은 많은에서 혈청 세포 배양의 일관성 대량을 보장하기 위해 구입 및 -20 ° C에 저장됩니다. 다른 많은의 20 % FBS를 포함한 미디어에 몇 주 동안 잘 접시 - 또는 12 - hfRPE 세포의 특정 배치에서 띄엄띄엄 씨앗 세포를 24에서 재배하고 있습니다. 가장 고전적인 RPE의 형태 (조약돌)로 가장 빠르게 성장하고 melanated 세포는 세포 배양에 사용할 수있는 적절한 혈청을 많이 나타냅니다.
세포 배양 매체도 포함 N1 보완 (시그마 - 알드리치) 1:100 ML / ML, GlutaMax / 페니실린 - 스트렙토 마이신 1:100 ML / ML (Gibco), 그리고 불필요한 아미노산 솔루션 (시그마 - 알드리치) 1:100 ML /을 ML. 또한, 하이드로코티손 (20 μg / L), 타우린 (250 MG / L) 및 triiodo - thyronin (0.013 μg / L)은 (THT) 1:500의 최종 농도로 PBS에이 세 가지 구성 요소를 해소하여 미리 준비가되어 있습니다 (ML / ML). THT의 Aliquots 80에 저장됩니다 ° C까지 RPE 매체에 추가됩니다.
3. 세포 배양
영수증에, 손상 글로브는 항생제 antimycotic 용액에 씻어서 아르 (10X로 희석,.. 고양이도없는 15240-096, Invitrogen) 플러스 gentamicin (1 MG / ML) 3~5분 위해 (아래 그림 1). 
그림 1. 배양 항생제는 HBSS 또는 PBS와 같은 매체에서 두 번 씻어서 후. 한 번에 하나의 눈 세계는 Sylgard - 184 (WPI)와 코팅과 10cm 페트리 접시에 전송하고 27G 바늘로 보안이됩니다. ClearCut sideport 나이프 (알콘)를 사용하여 절개는 모양체 (앞쪽에 표면에 눈 적도에서 거리의 1 / 3) 아래의 공막엔를 통해 이루어집니다. 이것은 절개는 앞쪽에 눈 부분의 제거를위한 원형 절단을 시작하는 데 사용됩니다. 이 상처는 한 블레이드 톱니 (FST)와 텅스텐 - 카바이드 코팅 곡선 이리스 가위를 사용하여 이루어집니다. 눈 앞의 부분 제거하기 전에, 상처는 R을 분리 피하기 위해 유리 몸을 통해 이루어집니다뒷부분 극에서 RPE에서 etina. 5 % 40~60분에 대한 혈청이 포함된 매체를하며 눈 앞의 부분이 제거되면 사후 극은 dispase - I 솔루션 (로체 진단, 인디애나 폴리스, IN.. 2 U / ML, 고양이도없는 04,942,086,001)와 incubated입니다 37 ° C - 5 % CO 2. dispase 치료 후 사후 극지는 실리콘 패딩 (Sylgard 184, 다우 코닝, 미들랜드, MI)와 페트리 접시에 HBSS로 전송하고 quadrants 또는 충분한 조직을 버리고 더 큰 조각에 해부 했어요. 그러면 망막은 부드럽게 집게로 제거됩니다. 단일 셀 RPE 레이어가 시트에서 떨어져 벗겨 차가운 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) (Gibco # 25200-056) 솔루션에 직접 수집했다. RPE를 수집 후, 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)의 조직과 튜브는 37 봉인하고 10-15 분에 대한 물 목욕으로 전송됩니다 ° C.는 부화 10 분 후, 튜브가 적극적으로 작은 클러스터로 RPE를 분리 흔들리고 있습니다. 분리가 완료되지 않은 경우 튜브가 다른 5 분 물 욕조에 다시 배치됩니다. 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)의 부화 후, 튜브가 가능한 해제 용해 혼합 세포 클러스터에 대한 검사입니다. 모든 관찰 클러스터는 잘 밀고 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 제거됩니다. (4 분에 대한 임상 원심 분리기에서 1.4 RPM) 아래로 회전 후, hfRPE 세포는 15 % RPE 미디어에서 다시 중단되고 다음 Primaria flasks (예 투입 : 고양이도없는 08-772-45; 피셔 과학, 피츠버그, PA.. ). 이 매체 5 % 혈청 함유 RPE 매체로 1 일 교체되며, 이후 변경 사항은 2~3일 모든되었다. 3-4주 후, 세포가 합류하고 균일하게 색소되었다. 코닝 코스타, 그들은 다음 15% 혈청 함유 RPE 세포 배양 매체에서 다시 중단하고, 잘 당 150 200K 세포 (트랜 스웰에서 명확한 세포 배양 삽입에 씨앗을 품고, 0.25 % 10 ~ 15 분 정도 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)에 trypsinized 아르 고양이도없는 07-200-161, 피셔 사이 언티픽) :.. 12 - mm 직경 삽입, 0.4 - 음 모공, 폴리에스터 세포막 (예 : 사용 코닝, NY). 시딩 전에 우물은 인간의 세포외 기질 (.. 당 150 μL 잘 HBSS 10 μg, 고양이 노 354237; BD Biosciences, 프랭클린 레이크스, NJ)로 코팅되었고 2 시간 모자 자외선과 치유. 어떤 경우에는 trypsinization 절차는 첫 번째 trypsinization 후 분리하지 않은 세포를 수집하는 두 번째 시간을 반복했다. 동일한 프로토콜 (ECM과 코팅은 제외) 세포의 P1 인구를 생성하는 flasks에 문화 전지에 사용되었습니다. 그들은 ≥ 200 Ω • cm 2의 총 조직 저항을했고 균일하게 색소 때 이러한 세포 실험에 사용되었다.
4. 단계 절차에 의해 단계
- 여러 솔루션 (4 우물에 필요한 각각의 눈)와 함께 12 잘 접시를 준비 :
- 일 잘 / 눈 - 10X 항생제 antimycotic 솔루션을 추가
- 린스에 대한 PBS / HBSS 용액을 추가 - 2 우물 / 눈
- dispase 솔루션을 추가 - 1 잘 / 눈
- 5 고정 바늘을 풀고하고 HBSS로 작성하여 페트리 접시를 해부 준비
- 풀고 눈과 3-5 분 (1 단계에서 준비)에 대한 항생제 - antimycotic 솔루션으로 그들을 장소
- PBS / HBSS 두 개의 우물 (1 단계에서 준비)에 눈을 씻어 후, 요리를 해부에게 전송할 수 있습니다.
- 트림 과도한 근육과 눈 주위 결합 조직
- 각막가 얼굴 방식으로 그들을 정렬 요리를 해부에 보안 27G 바늘 (실리콘베이스로 핀) 눈을 사용합니다.
- 원형 절단이 시작됨 sideport 나이프를 사용하면, 아래의 각막 절개를
- 사용 이리스 가위 그런 다음 유리를 통해 잘라 거리에 안구의 앞쪽에 부분을 리프트 같은 가위를 사용하여 눈 주위를 잘라합니다.
참고 : 단계 3-8은 안구 어떤 과도한 기계적 압력을 피하십시오. - (1 단계에서 준비) dispase 솔루션으로 열려 시선을 전송
- 37 40-60분 눈을 컵을 품어 ° C와 5 % CO 2
- 신선 한 사람과 요리를 해부의 HBSS 용액을 교체하십시오.
- dispase 솔루션에서 해부 접시에 눈을 전송.
- 위치 페트리 접시에 눈 (안구 컵가 직면하고) 두 27G 바늘로 보안.
- 부드럽게 부분적으로 분리된 망막를 일으키고 망막 가위를 사용하면 시신경 떨어져 망막 잘라. 망막 폐기하십시오.
- 이리스 가위를 사용하면 시신경으로 눈 주변에서 한 절개합니다.
- 모두 다섯 27G 바늘을 사용하면 멋지게 뻗어 안구 만들기 RPE 계층을 평평하게.
- 망막 가위를 사용하면 시신경에 첨부 파일에서 RPE 계층을 분리 시신경 주위에 원형 절개를합니다.
참고 : 단계 13-17은 낮은 배율로 또는 스테레오 현미경없이 할 수 있습니다 - 250x 배율로 stereomicroscope를 조정이상과 홍채 가위로 잘라 만든 따라 시신경 주변 RPE 시트의 가장자리를 찾으십시오.
- 이 포셉 choroidal 조직 계층에서 별도의 RPE - Bruch의 막이를 사용하여. 그것은 RPE와 맥락막의 연결이 약한있는 가장자리 영역을 찾기 위해 몇 가지 시도를 요구할 수 있습니다.
- 15 ML 튜브에서 추위 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 솔루션으로 자리 RPE 시트
- RPE는 37 10 15mins를위한 물 욕조에 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)의 조직과 모자 및 전송 튜브를 수집 후 ° C.
- 부화 10 분 후, 적극적으로 작은 클러스터로 RPE 분리 15 ML 튜브를 흔들. 분리가 완료되지 않은 경우, 또 다른 5 분 물 목욕으로 다시 튜브를 놓으십시오.
- 가능한 해제 용해 혼합 셀 클러스터를위한 튜브를 검사합니다. 모든 관찰 클러스터는 잘 밀고 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 삭제해야합니다.
- (4 분에 대한 임상 원심 분리기에서 1.4 RPM) hfRPE 세포를 스핀 다운 15 % RPE 미디어 (9 ML 합계)에 뜨는 제거하고 다시 정지 전지
- Primaria의 flasks 신선 15% RPE 미디어 2 ML, 다음날 (37 ° C, 5 % CO 2)까지 보육로 자리 플라스크를 추가로 세포 현탁액 3 ML 놔
5. 대표 결과
hfRPE 세포 배양의 기능 검증
이전 실험에서는 플라즈마 막 수송 단백질의 표현, 편광과 기능을 파악하고 그들이 적용될 수있는 속성의 집합 유효성 검사를 제공 축적되면서 RPE 기능을 할 1-11 이러한 특성을 조절 특정 신호 경로를 확인하기 위해 이러한 기본 문화를 사용해야 각각의 세포 생성합니다. 실험 transepithelial 유체 수송 및 paracellular 경로의 무결성을 결정하는 단백질을 확인 아래에 요약. 체외 실험에서 이러한 망막 재 reattachment 6 동물 모델에서 검증되었습니다.
그림 2. hfRPE 세포에서 CFTR의 현지화 왼쪽 상단 패널 :. CFTR는 멤브레인 - 농축 추출물을 사용하여 hfRPE 세포에서 발견되었다. M, 분자량 마커, 레인 1, 센터 낮은 패널의 주요 성숙 (밴드 C) 및 미숙 (A와 B 밴드) : CFTR의 immunofluorescence 지방화 (녹색 라벨) 오른쪽 상단 패널 : 보여주는 Z 평면을 통해 확대 단면보기.. Z - 축 통해 최고 강도의 투영. 조 - 1 (빨간색으로 표시) RPE의 혀끝의과 basolateral 측면을 delineating 긴밀한 연결 마커 역할을합니다. DAPI (파란색)은 핵 가까이 기저 막에있는 레이블. 조 - 1 CFTR에서 붉은 라벨 중복 녹색 형광 이후로 황색 / 오렌지 나타납니다.
그림 3. hfRPE에서 IFNγ 유발 생리적 변화 :. 기저 목욕 IFNγ의 또한 기본, 교양 hfRPE 세포 monolayer 전체 transepithelial 유체 수송 (J V)를 증가 J V는 상단 추적에 시간을 기능과 네트워크 유체로 꾸몄다 있습니다. 흡수 (기초 목욕 꼭대기의)는 긍정적인 가치로 표시되며 transepithelial 가능성 (TEP) 및 전체 조직 저항 (R T) 아래쪽의 흔적을 시간의 함수로 꾸몄다 있습니다. B : 기초 목욕 CFTRinh - 172 (5 μm의)의 추가가 IFNγ 자극 J V 증가를 저해.
다음은 체외의 결과에 hfRPE를 확인 동물 모델 실험의 예입니다. 본 실험에서는 인위적으로 만들어진 망막 분리는 크게 (그림 4 A, B) 외부 안구 표면에 IFNg를 추가 후 감소되었습니다. 이 효과는 부분에 의해 차단된 수 있습니다 캠프 차단기 (그림 4D) (1) 또한, (2) 완전히 JAK + 캠프 차단제를 추가 후 차단했습니다. 아래 이미지는 OCT 스캐너를 사용하여 얻을 수 있습니다.
그림 4. 생체내 망막 분리 실험에서. 생체내 실험에서 이러한 수속은 이전에 자세하게 6 설명했습니다. 이 실험에서 망막 detachments은 subretinal 공간 (SRS), 혼자로 또는 JAK - STAT와 PKA 경로 억제제의 조합과 함께 수정된 PBS 솔루션의 0.5-3 μL의 주사로 쥐 안구에 만들어졌습니다. 각 실험은 망막 손상이 생성 후 40-70 분 초기 관리 기간을했다. 이 기간 동안 물집 볼륨의 변화의 속도는 물집 안정성을 확보하기 위해 측정되었다. 광학 일관성 tomography 이미징은 (응용 물리 연구소, 과학 러시아 아카데미 니주니 노브 고 로트, 러시아) SRS의 볼륨 변화의 시간 과정을 측정하는 데 사용되었다.
다시 첨부 권의 시간 코스매화의 변화는 광학 일관성 tomography (-10 월)에 의해 측정되었다. 초연의 크기에 변화 표시 (A, B의 화살표를하고, D) 40-70 분 앞쪽에 표면의 IFNγ 추가에 따라, 4 가지 실험 (AD 왼쪽에있는 패널)에서 OCT 이미지. 패널 A와 IFNγ는 제어 속도에서 JV 증가되는 B 쇼 (≈ 2 μl • cm 2 • 시간 -1) 각각 14, 12 μl • cm 2 • HR - 1. JAK - STAT 경로와 PKA 억제제 (C 및 D), IFNγ의 또한 다음 - 유도 흡수 속도가 크게 0.2과 7.9로 감소했습니다 μl • cm 2 • HR - 1, 각각. 화살표 점선 안에 동봉 영역 (시작 볼륨)과 비교에 대한 물집의 경계를 나타냅니다. 그림의 오른쪽 : 여러 실험에서 측정한 JV 요금의 상단 패널 - 요약, 중간 패널 동영상 ( 여기를 클릭하세요 ), 낮은 패널 3D 파란색 B. Pseudocolor에 요약 실험의 섹션 공간적 t = 0에서 초연의 범위와를 나타냅니다 INFγ를 추가 후 40 분.
모든 동물 실험은 비전 연구 및 안과 문을 협회 준수 실시했다. 프로토콜은 국립 보건원의 동물 의료 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다.
Discussion
현재 실험에서, 우리는 눈을 당 사용 가능한 세포의 높은 숫자와 일치하는 hfRPE 주 문화를 생산하는 데 필요한 여러 단계를 간소화하기위한 우리의 이전에 게시된 기술 3 추가 수정을 설명합니다. 원래 프로 시저에서 각각의 변화는 엄격하게 변화가 유물을 소개하지 않았고 지속적으로 이러한 세포를 사용하는 다른 많은 실험실에서 테스트되고 있는지 확인하기 위해 여러 생리학 및 분자 생물학 실험에서 테스트되었습니다. 마지막으로, 추가 실험 동물 모델에서 유사한 perturbations에 체외 결과를 비교하기 위해 실시되었다.
Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
우리는이 세포 문화를 특성화에 대한 도움 연구소는 회원 제프리 Adijanto, 티나 Banzon, 롱 리, 진 완, Congxiao 장, 징 조, 코니 다우 Awais 지아, 나탈리아 Strunnikova 감사합니다. 징 조, 코니 다우 및 세포 문화 큰 주식을 유지하는 그들의 도움 티나 Banzon 특별 감사드립니다.
이 작품은 건강 교내 연구 프로그램의 국립 연구소에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instruments needed for dissection protocol | |||
| Stereo Microscope - any available with working magnification x250 needed for dissection | |||
| Dissecting dish - e.g. Kimble 100 x 20mm #23062 (one per dissection) any source | |||
| Sylgard 184 - WPI Cat. #SYLG184* | |||
| * To prepare dissecting dish follow Sylgard 184 included mixing instructions, pour mixed liquid elastomer into Petri dish to form 5-8mm layer. Allow elastomer to cure for at least 24hrs. Dish with cured elastomer can be sterilized using 70% ethanol and reused multiple times (~100 times) | |||
| 27 G needles from B-D PrecissionGlide 1¼ length (5 per dissection) any source | |||
| HBSS 1X Solution containing Ca and Mg salts - GIBCO Cat.#14025 500ml (good for multiple dissections) | |||
| Iris scissors carbide serrated blade, curved - FST Cat.# 14559-11 (one) | |||
| Retinal scissors - Katena Cat.#K4-5300 (one) | |||
| Forceps - e.g. Dumont Tweezers #5 with polished tips from WPI Cat.#500085 (2 pieces) | |||
| Sideport knife - Alcon, ClearCut 1mm, Dual Bevel, angled Cat.#8065921540 | |||
| Centrifuge tube 15ml - (one per eye) any source | |||
| Pasteur glass pipette - (one per dissection) any source | |||
| Plate 12 well (one per dissection) any source | |||
| Primaria 25cm2 flask - (2-3 per eye) any source | |||
References
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