Summary
Forniamo un metodo riproducibile per la coltura monostrati confluenti di cellule fetali dell'epitelio pigmentato retinico (hfRPE), le cellule che presentano morfologia, fisiologia, polarità e proteine e schemi di espressione genica dei tessuti adulti nativi. Questo lavoro è stato esteso ad un modello animale di malattie degli occhi diversi.
Abstract
Abbiamo sviluppato un procedimento di coltura cellulare in grado di produrre grandi quantità di monostrati confluenti di primaria umano fetale epitelio pigmentato retinico (hfRPE) culture morfologiche, fisiologiche e genetiche autoctone di RPE umano. Queste colture cellulari hfRPE mostra pigmentazione pesante, e la microscopia elettronica mostrano ampie microvilli della membrana apicale. I complessi giunzionali sono stati identificati con etichettatura immunofluorescenza di varie proteine di giunzione stretta. Polarità epiteliale e la funzione di queste culture facilmente riproducibile primarie sono molto simili precedentemente studiato i modelli di RPE mammiferi nativi, compresi gli esseri umani. Questi risultati sono stati estesi con lo sviluppo di interventi terapeutici in diversi modelli animali di malattie dell'occhio umano. Ci siamo concentrati sulle strategie per la rimozione di anomalo accumulo di liquido nella retina o spazio sottoretinico. Lo spazio extracellulare subretinico separa i segmenti esterni dei fotorecettori e la membrana apicale del RPE ed è fondamentale per il mantenimento degli allegati della retina e tutta una serie di RPE / retina interazioni.
Protocol
1. Tessuto fetale umano
Tutte le ricerche tessuti umani legati segue i principi della Dichiarazione di Helsinki e il comitato di revisione istituzionale NIH. Gli occhi del feto sono ottenuti da un lenone indipendente, avanzata Risorse Bioscience (ABR, Alameda, CA), da donatori random a 16 a 22 settimane di gestazione, posto in RPMI-1640 supporti contenenti tubi (forniti da ABR), imballati su ghiaccio, e consegnati da un servizio notturno di consegna prioritaria. I tessuti rimangono vitali fino a 48 ore dopo l'enucleazione.
2. Colture Cellulari Media
MEM-alfa modificato medio (Sigma-Aldrich) è usato come mezzo di base per la preparazione del 5% e il 15% di siero contenenti supporti per la coltura di cellule dell'epitelio pigmentato retinico (RPE medio; tabella 1).
| Nome | Sigma | Gibco | Quantità | Immagazzinamento |
| MEM, alfa modifica | M-4526 | 500 ml | +4 ° C | |
| N1 supplemento | N-6530 | 5 ml | +4 ° C | |
| Penicillina-streptomicina | 15140-148 | 5 ml | -20 ° C | |
| GlutaMax - I | 35050 | 5 ml | -20 ° C | |
| Non amminoacidi essenziali | M-7145 | 5 ml | +4 ° C | |
| THT * | -80 ° C | |||
| La taurina | T-0625 | 125 mg | ||
| Idrocortisone | H-0396 10 | 10 mcg | ||
| Triiodo-thyronin | T-5516 | 0,0065 mg | ||
| ** Siero fetale bovino | 5% o 15% | -80 ° C |
Tabella 1. Fetale umano RPE medio dei componenti per la preparazione di 500 ml di mezzo
THT * è preparata sciogliendo taurina-idrocortisone-triiodo-thyronin in 1 1,5 ml di PBS prima di effettuare il mezzo. Diverse aliquote sono realizzati e conservati a -80 ° C per semplificare la preparazione coltura del terreno di coltura.
** Siero fetale bovino non è ottenuta da Sigma-Aldrich o Gibco.
Siero fetale bovino utilizzato nella preparazione dei media è ottenuta da Atlanta Biologicals (Norcross, GA). Ogni bottiglia del siero è inattivato con il calore (56 ° C per 1 ora) prima dell'uso. Per garantire coerenza grandi quantità di cellule cultura di siero prelevati dallo stesso lotto vengono acquistati e conservati in -20 ° C fino a quando non sono utilizzati per la preparazione dei media. Cellule scarsamente seminate da un lotto specifico di cellule hfRPE sono cresciute in 24 - o 12 - piastre per alcune settimane in un mezzo contenente 20% FBS di lotti diversi. Le cellule in più rapida crescita melanated con la morfologia RPE più classico (ciottoli) indicano un lotto appropriato siero che può essere utilizzato per la coltura cellulare.
Terreno di coltura cellulare contenente anche: N1 supplemento (Sigma-Aldrich) 1:100 mL / mL, GlutaMax / penicillina-streptomicina 1:100 mL / mL (Gibco), e la soluzione di aminoacidi non essenziali (Sigma-Aldrich) 1:100 ml / mL. Inoltre, idrocortisone (20 mg / L), taurina (250 mg / L), e triiodo-thyronin (0,013 mg / L) (THT) è preparato in anticipo, sciogliendo questi tre componenti in PBS alla concentrazione finale di 1:500 (ml / ml). Aliquote di THT sono conservati a 80 ° C fino a quando in un terreno di RPE.
3. Colture Cellulari
Al ricevimento, globi intatti sono sciacquato in soluzione antibiotica antimicotico (diluito a 10 volte;.. Gatto non 15240-096; Invitrogen) più gentamicina (1 mg / ml) per 3 a 5 minuti (figura 1). 
Figura 1. Dopo l'incubazione antibiotici sono risciacquato due volte con medium come HBSS o PBS. Un globo oculare al momento è trasferito al piatto cm 10 Petri con rivestito con Sylgard-184 (WPI) e fissato con aghi 27G. Utilizzando netta SidePort coltello (Alcon) un'incisione è fatta attraverso la sclera sotto il corpo ciliare (1 / 3 della distanza dall'equatore occhio sulla superficie anteriore). Questa incisione viene utilizzato per avviare un taglio circolare per la rimozione della porzione anteriore dell'occhio. Questo taglio è realizzato con un carburo di tungsteno rivestiti forbici curve iride con una lama seghettata (FST). Prima della rimozione della parte anteriore dell'occhio, un taglio è fatto attraverso il corpo vitreo per evitare di staccare il retina dal RPE al polo posteriore. Dopo la parte anteriore dell'occhio viene rimosso, il polo posteriore è incubato con dispasi-I soluzione (2 U / mL, cat non 04942086001;.. Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) nel 5% siero supporto contenente per 40-60 minuti a 37 ° C-5% di CO 2. Dopo il trattamento dispasi, i poli posteriori sono trasferiti ad un HBSS in piastre di Petri con imbottiture in silicone (Sylgard 184; Dow Corning, Midland, MI) e sezionato in quadranti o pezzi più grandi a sufficienza per appiattire tessuti. Poi la retina è delicatamente rimosso con una pinza. Cella singola strati RPE sono stati staccata in fogli e raccolti direttamente nel freddo tripsina-EDTA (Gibco, # 25200-056) soluzione. Dopo l'RPE sono raccolti, tubi con tessuti in tripsina-EDTA sono sigillate e trasferiti in bagnomaria per 10-15 minuti a 37 ° C. Dopo 10 minuti di incubazione, i tubi sono vigorosamente scossi per separare RPE in piccoli gruppi. Se la separazione non è completa, i tubi sono posti di nuovo in bagno d'acqua per altri 5 minuti. Dopo tripsina-EDTA incubazione, le provette vengono ispezionati per un eventuale non-disciolti gruppi di cellule miste. Ogni cluster osservati sono rimossi con punta sottile vetro pipetta Pasteur. Dopo riducendo la velocità (1,4 giri a centrifuga clinica per 4 min), le cellule hfRPE sono risospese in media RPE 15% e poi messo in Primaria palloni (esempio: Cat. 08-772-45, Fisher Scientific, Pittsburgh, PA.. ). Questo mezzo è sostituito dopo 1 giorno con 5% di siero contenente medio RPE, e successive modifiche sono state fatte ogni 2 o 3 giorni. Dopo 3 o 4 settimane, le cellule si confluenti e uniformemente pigmentate. Vengono poi trypsinized a 0,25% tripsina-EDTA per 10 a 15 minuti, risospese nel 15% di siero contenente cellule RPE media cultura, e seminate su inserti chiari colture cellulari da 150 a 200K cellule per pozzetto (Transwell; Corning Costar, Corning, NY), con 12 mm di diametro inserti, pori 0,4 um, membrane in poliestere (esempio: Cat. 07-200-161, Fisher Scientific)... Prima della semina, i pozzi sono stati rivestiti con umana matrice extracellulare (10 mg in 150 microlitri HBSS per pozzetto, Cat. 354237;.. BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ) e curata con luce UV nella cappa per 2 ore. In alcuni casi, la procedura tripsinizzazione è stata ripetuta per la seconda volta, per raccogliere le cellule che non si sia staccata dopo il tripsinizzazione prima. Lo stesso protocollo (ad esclusione di rivestimento con ECM) è stato utilizzato per le cellule in coltura i flaconi per generare la popolazione di cellule P1. Queste cellule sono stati utilizzati in esperimenti, quando avevano una resistenza totale dei tessuti di ≥ 200 Ω • cm 2 e sono stati uniformemente pigmentate.
Fare clic qui per una cifra più grande 1 .
4. Procedure passo-passo
- Preparare 12-pozzetti con soluzioni multiple (per ogni occhio 4 pozzi necessari):
- aggiungere 10x soluzione antibiotica antimicotico - 1 e / occhio
- aggiungere PBS / HBSS soluzione per lavare - 2 pozzi / occhio
- aggiungere soluzione dispasi - 1 e / occhio
- Preparare dissezione Petri da spacchettamento 5 aghi di fissaggio e lo riempie di HBSS
- Disimballare occhi e metterli in antibiotico-antimicotico soluzione per 3-5 minuti (preparata al punto 1)
- Lavare gli occhi in due pozzi (preparata al punto 1) con PBS / HBSS, poi trasferirli dissezione piatto.
- Assetto muscolare eccessivo e tessuto connettivo attorno agli occhi
- 27G utilizzando aghi sicuro (da definire a base di silicio) gli occhi a sezionare piatto di allineamento in un modo in cui cornea rivolto verso l'alto.
- Utilizzando coltello fare un'incisione sotto porta laterale della cornea, dove taglio circolare inizierà
- Utilizzando le forbici iris fanno tagliare intorno all'occhio, poi con le forbici tagliare vitreo stesso e sollevare porzione anteriore dell'occhio distanza.
Nota: in passi 3-8 evitare una pressione eccessiva meccanica bulbo oculare. - Trasferimento occhio aperto in soluzione dispasi (preparata al punto 1)
- Incubare oculare per 40-60 minuti a 37 ° C con 5% di CO 2
- Sostituire la soluzione HBSS a sezionare piatto con uno fresco.
- Trasferimento occhio dalla soluzione dispasi al piatto dissezione.
- Occhio posizione nella capsula di Petri (coppa bulbo oculare verso l'alto) e fissarlo con due aghi 27G.
- Sollevare delicatamente retina parzialmente separata e con le forbici taglio della retina retina lontano dal nervo ottico. Scartare retina.
- Utilizzando le forbici iris fare una incisione dalla periferia degli occhi verso nervo ottico.
- Utilizzando tutti e cinque gli aghi 27G appiattire strato RPE occhio facendo ben teso.
- Utilizzando le forbici taglio della retina fare circolare intorno nervo ottico Strato di separazione RPE dall'attaccamento al nervo ottico.
Nota: i passaggi 13-17 può essere fatto con bassi ingrandimenti o senza microscopio stereo - Regolare stereomicroscopio di ingrandimento 250xo più e trovare margini del foglio RPE vicino al nervo ottico lungo il taglio effettuato da forbici iris.
- Utilizzando due pinze membrana separata RPE-Bruch dallo strato di tessuto coroide. Si può richiedere alcuni tentativi per trovare spazio lungo il bordo dove la connessione di RPE e coroide è più debole.
- RPE fogli in luogo freddo tripsina-EDTA in 15 ml tubo
- Dopo l'RPE sono raccolti, tubi cappuccio e trasferimento con tessuti in tripsina-EDTA in bagnomaria per 10-15min a 37 ° C.
- Dopo 10 minuti di incubazione, scuotere vigorosamente provette da 15 ml per separare RPE in piccoli gruppi. Se la separazione non è completa, luogo tubi di nuovo in bagno d'acqua per altri 5 minuti.
- Ispezionare i tubi per un eventuale non-disciolti gruppi di cellule miste. Ogni cluster osservato deve essere rimosso utilizzando vetro sottile a punta della pipetta Pasteur.
- Spin down (1,4 rpm centrifuga clinica per 4 min), le cellule hfRPE, rimuovere il surnatante e risospendere le cellule nel 15% RPE dei media (9 totali ml)
- Mettere 3 ml di sospensione cellulare in fiasche Primaria aggiungere 2 ml di fresca dei media il 15% RPE, borraccia posto in incubatrice fino al giorno successivo (37 ° C, 5% CO 2)
5. Rappresentante Risultati
Validazione funzionale di colture cellulari hfRPE
In esperimenti precedenti abbiamo usato queste colture primarie per determinare l', polarizzazione espressione e la funzione delle proteine di membrana plasmatica di trasporto e di individuare specifiche vie di segnalazione che regolano la funzione RPE 1-11 Queste caratteristiche così come sono accumulati fornire una validazione insieme di proprietà che possono essere applicate ad ogni generazione cellulare. Gli esperimenti sono riassunte qui di seguito identificare le proteine che determinano il trasporto transepiteliale fluido e l'integrità del percorso paracellulare. Questi esperimenti in vitro sono stati validati in un modello animale di ri-riattacco della retina 6.
Figura 2. Localizzazione di CFTR nelle cellule hfRPE Sinistra pannello superiore:. CFTR è stata rilevata nelle cellule hfRPE con membrana arricchiti estratti. M, marcatore di peso molecolare, corsia 1, grandi maturi (fascia C) e immaturi (fasce A e B) pannello centrale inferiore: la localizzazione di immunofluorescenza CFTR (etichetta verde) In alto a destra del pannello: allargata vista in sezione trasversale attraverso il piano z che mostra.. massima intensità di proiezione con l'asse z. ZO-1 (etichettato come rosso) serve come un marcatore nodo stretto delineando i lati apicale e basolaterale della RPE. DAPI (blu) le etichette dei nuclei situato vicino alla membrana basale. ZO-1 appare come giallo / arancio, dal momento che la sua fluorescenza verde sovrapposizioni etichetta rossa CFTR.
Figura 3. Cambiamenti fisiologici IFNγ-indotta in hfRPE A:. Aggiunta di IFNγ al bagno basale maggiore di trasporto transepiteliale fluido (J v) in monostrato di primario, le cellule in coltura hfRPE J v è un grafico in funzione del tempo nella traccia superiore e fluido rete. assorbimento (apicale a bagno basale) è indicato da valori positivi; potenziale transepiteliale (TEP) e la resistenza dei tessuti totale (R T) vengono riportati in funzione del tempo nelle tracce fondo. B: L'aggiunta di CFTRinh-172 (5 micron) al bagno basale inibito l'IFNγ-stimolata J aumentare v.
Di seguito è riportato un esempio di esperimenti modello animale confermando hfRPE risultati in vitro. In questo esperimento, create artificialmente distacco di retina è risultata significativamente ridotta dopo l'aggiunta di IFNg alla superficie esterna dell'occhio (Figura 4 A, B). Questo effetto può essere parzialmente bloccata da: (1) aggiunta del bloccante cAMP (fig. 4D), (2) completamente bloccato dopo l'aggiunta di JAK bloccanti cAMP +. Le immagini di seguito sono ottenuti utilizzando lo scanner ottobre
Figura 4. Esperimenti in vivo distacco di retina. Le procedure per tali esperimenti in vivo sono stati precedentemente descritti in dettaglio 6. In questi esperimenti, distacco della retina dell'occhio sono stati creati nel ratto mediante iniezione di 0,5-3 ml di soluzione PBS modificato nello spazio sottoretinico (SRS), da soli o con una combinazione di JAK-STAT e di inibitori della via di PKA. Ogni esperimento ha avuto un periodo iniziale di controllo di 40-70 minuti dopo la creazione del distacco di retina. Durante questo periodo, il tasso di variazione del volume bleb è stata misurata per assicurare la stabilità vescichetta. Tomografia a coerenza ottica per immagini (Istituto di Fisica Applicata, Accademia Russa delle Scienze, Nizhniy Novgorod, Russia) è stato utilizzato per misurare i tempi del cambiamento volume in SRS.
La durata di ri-attaccamento volcambiare UME è stata misurata mediante tomografia a coerenza ottica (OCT). Immagini dal 4 ottobre esperimenti diversi (pannelli a sinistra; dC) che mostrano un cambiamento della dimensione distacco (frecce in A, B e D) dopo l'aggiunta di IFNγ sulla superficie anteriore per 40-70 min. Pannelli A e B mostrano che IFNγ aumentato Jv dal suo tasso di controllo (≈ 2 microlitri • cm 2 • h -1) a 14 e 12 microlitri • cm 2 • h-1, rispettivamente. In seguito all'aggiunta di JAK-STAT e di inibitori della PKA (C e D), l'IFNγ - tasso di assorbimento indotti erano significativamente ridotti a 0,2 e 7,9 microlitri • cm 2 • h-1, rispettivamente. Le frecce indicano il confine della vescichetta per il confronto con l'area racchiusa tra la linea tratteggiata, (volume di partenza). Lato destro della figura: il pannello superiore in-sintesi delle misurati i tassi di Jv da diversi esperimenti; mezzo pannello-film ( clicca qui ), inferiore del pannello 3D-sezioni di esperimenti riassunti in B. PseudoColor in blu indica l'estensione spaziale, di distacco a t = 0 e 40 minuti dopo l'aggiunta di INFγ.
Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati condotti in conformità con l'Associazione per la Ricerca in Oftalmologia Visione e dichiarazione. Il protocollo è stato approvato dalla cura degli animali e del Comitato utilizzo del National Institutes of Health.
Discussion
Negli esperimenti attuali, si descrivono ulteriori modifiche delle nostre tecniche precedentemente pubblicato 3, intesa a semplificare il più passaggi necessari a produrre coerente culture hfRPE primaria con un numero maggiore di cellule disponibili per occhio. Ogni modifica della procedura originale è stato rigorosamente testato in fisiologia e più esperimenti di biologia molecolare per garantire che le modifiche non introdurre artefatti e di essere continuamente testati da molti altri laboratori usando queste cellule. Infine, ulteriori esperimenti sono stati condotti per confrontare i risultati in vitro a perturbazioni simili in modelli animali.
Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Ringraziamo Lab membri Jeffrey Adijanto, Tina Banzon, Li Rong, Qin Wan, Congxiao Zhang Jing Zhao, Connie Zhi, Awais Zia, Natalia Strunnikova aiuto per caratterizzare queste colture cellulari. Un ringraziamento speciale a Zhao Jing, Connie Zhi, e Tina Banzon per il loro aiuto nel mantenere grandi scorte di colture cellulari.
Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health Research Programma Intramural.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instruments needed for dissection protocol | |||
| Stereo Microscope - any available with working magnification x250 needed for dissection | |||
| Dissecting dish - e.g. Kimble 100 x 20mm #23062 (one per dissection) any source | |||
| Sylgard 184 - WPI Cat. #SYLG184* | |||
| * To prepare dissecting dish follow Sylgard 184 included mixing instructions, pour mixed liquid elastomer into Petri dish to form 5-8mm layer. Allow elastomer to cure for at least 24hrs. Dish with cured elastomer can be sterilized using 70% ethanol and reused multiple times (~100 times) | |||
| 27 G needles from B-D PrecissionGlide 1¼ length (5 per dissection) any source | |||
| HBSS 1X Solution containing Ca and Mg salts - GIBCO Cat.#14025 500ml (good for multiple dissections) | |||
| Iris scissors carbide serrated blade, curved - FST Cat.# 14559-11 (one) | |||
| Retinal scissors - Katena Cat.#K4-5300 (one) | |||
| Forceps - e.g. Dumont Tweezers #5 with polished tips from WPI Cat.#500085 (2 pieces) | |||
| Sideport knife - Alcon, ClearCut 1mm, Dual Bevel, angled Cat.#8065921540 | |||
| Centrifuge tube 15ml - (one per eye) any source | |||
| Pasteur glass pipette - (one per dissection) any source | |||
| Plate 12 well (one per dissection) any source | |||
| Primaria 25cm2 flask - (2-3 per eye) any source | |||
References
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