Summary
Ofrecemos un método reproducible para el cultivo de las monocapas confluentes de células fetales humanas del epitelio pigmentario de la retina (hfRPE) las células que presentan la morfología, la fisiología, la polaridad, y la proteína y los patrones de expresión génica del tejido nativo adulto. Este trabajo se ha extendido a un modelo animal de enfermedades de los ojos de varios.
Abstract
Hemos desarrollado un método de cultivo de células que pueden producir grandes cantidades de monocapas confluentes de primaria de fetos humanos epitelio pigmentario de la retina (hfRPE) los cultivos con características morfológicas, fisiológicas y genéticas de RPE humana nativa. Estos cultivos celulares hfRPE presentan pigmentación pesados, y la microscopía electrónica muestra amplia microvellosidades membrana apical. Los complejos de unión se identificaron con el etiquetado de inmunofluorescencia de varias proteínas de las uniones estrechas. Polaridad epitelial y función de estos cultivos primarios de fácil reproducción se asemejan estudiado previamente los modelos de mamíferos de RPE nativo, incluidos los humanos. Estos resultados se extendieron por el desarrollo de intervenciones terapéuticas en modelos animales de enfermedad de los ojos humanos. Nos hemos centrado en las estrategias para la eliminación de la acumulación anormal de líquido en la retina o en el espacio subretiniano. El espacio subretiniano extracelular separa los segmentos de los fotorreceptores y externa de la membrana apical del EPR y es fundamental para el mantenimiento de los archivos adjuntos de retina y una gran cantidad de interacciones RPE / retina.
Protocol
1. Tejido fetal humano
Todas las investigaciones relacionadas con el tejido humano sigue los principios de la Declaración de Helsinki y de la junta de revisión institucional del NIH. Los ojos del feto se obtienen por un proxeneta independiente, recursos avanzados de Bioscience (ABR, Alameda, CA), a partir de donantes escogidos al azar entre las 16 y las 22 semanas de gestación, colocado en medio RPMI-1640 que contienen los tubos (proporcionada por la ABR), lleno de hielo, y entregados por un servicio de prioridad de entrega al día siguiente. Tejidos siguen siendo viables hasta 48 horas después de la enucleación.
2. Medio de cultivo celular
MEM-alfa modificado del medio (Sigma-Aldrich) se utiliza como medio base para preparar un 5% y 15% de suero que contienen los medios de comunicación para el cultivo de células del EPR (medio de RPE, Tabla 1).
| Nombre | Sigma | Gibco | Cantidad | Almacenamiento |
| MEM, alfa modificación | M-4526 | 500 ml | 4 ° C | |
| N1 suplemento | N-6530 | 5 ml | 4 ° C | |
| Penicilina-estreptomicina | 15140-148 | 5 ml | -20 ° C | |
| Glutamax - I | 35050 | 5 ml | -20 ° C | |
| Aminoácidos no esenciales | M-7145 | 5 ml | 4 ° C | |
| THT * | -80 ° C | |||
| Taurina | T-0625 | 125 mg | ||
| Hidrocortisona | H-0396 10 | 10 mg | ||
| Triyodo-thyronin | T-5516 | 0,0065 mg | ||
| Fetal bovino ** suero | 5% o 15% | -80 ° C |
Tabla 1. Componentes de fetos humanos RPE medio de Preparación del medio de 500 ml
THT * se obtiene disolviendo la taurina-hidrocortisona-triyodo-thyronin en un 1,5 ml de PBS antes de hacer la media. Alícuotas se realizan múltiples y almacenadas a -80 ° C para simplificar la preparación de cultivo del medio de cultivo.
** Suero bovino fetal no se obtuvieron de Sigma-Aldrich o Gibco.
Suero fetal bovino utilizado en la preparación de los medios de comunicación se obtiene de Atlanta Biológicos (Norcross, GA). Cada frasco del suero es inactivado por calor (56 ° C durante 1 hora) antes de su uso. Para asegurar la consistencia de células de cultivo a gran cantidad de suero de un mismo lote se compran y se almacenan a -20 ° C hasta que se utilizan para la preparación de los medios de comunicación. Células escasamente semillas de un lote específico de las células hfRPE se cultivan en 24 - o 12 - y placas para un par de semanas en los medios de comunicación que contiene 20% de SFB de diferentes lotes. Las células de crecimiento más rápido melanated con la morfología RPE más clásico (adoquines), indican una gran cantidad apropiada de suero que se pueden utilizar para el cultivo celular.
Medio de cultivo celular también contiene: N1 suplemento (Sigma-Aldrich) 1:100 ml / ml, Glutamax / penicilina-estreptomicina 1:100 ml / ml (Gibco), y la solución de aminoácidos no esenciales (Sigma-Aldrich) 1:100 ml / mL. Además, la hidrocortisona (20 mg / L), taurina (250 mg / L), y triyodo-thyronin (0,013 mg / L) (THT) está preparado con anticipación por la disolución de estos tres componentes en PBS a una concentración final de 1:500 (ml / ml). Alícuotas de THT se almacenan a 80 ° C hasta que añadido al medio de RPE.
3. Cultivo de células
En la recepción, globos intactos se lavan en una solución de antibióticos antimicóticos (diluido 10 veces;.. Gato no 15240-096, Invitrogen) y gentamicina (1 mg / ml) durante 3 a 5 minutos (Figura 1). 
Figura 1. Después de los antibióticos de incubación se enjuagan dos veces con medio como HBSS o PBS. Un globo ocular en el momento de la transferencia de 10 cm con una placa de Petri recubiertas con Sylgard-184 (IPM) y se fija con agujas 27G. Usando un cuchillo Corta a puerto lateral (Alcon) se hace una incisión en la esclerótica por debajo del cuerpo ciliar (1 / 3 de la distancia desde el ecuador del ojo de la cara anterior). Esta incisión se utiliza para iniciar un corte circular para la eliminación de la parte anterior del ojo. Este corte se realiza mediante un carburo de tungsteno-tijeras iris curvas recubierto con una hoja de sierra (FST). Antes de la eliminación de la parte anterior del ojo, se hace una incisión a través del cuerpo vítreo de evitar de separar la retina de la RPE en el polo posterior. Después de la parte anterior del ojo es removido, el polo posterior se incuba con dispasa-I solución (2 U / mL, el gato no 04942086001;.. Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) en el 5% de suero que contiene medio durante 40-60 minutos en 37 ° C-CO 2 al 5%. Después del tratamiento dispasa, los polos posterior se transfieren a un HBSS en placas de Petri con silicona relleno (Sylgard 184, Dow Corning, Midland, MI) y se diseca en cuadrantes o trozos más grandes para aplanar suficientemente los tejidos. A continuación, la retina se quita suavemente con unas pinzas. Una sola célula capas RPE se desprendió en las hojas y se recoge directamente en frío de tripsina-EDTA (Gibco, 25200-056 #) solución. Después de que el EPR se recogen, los tubos con los tejidos de la tripsina-EDTA se cierran y se transfieren a baño maría durante 10-15 minutos a 37 ° C. Después de 10 minutos de incubación, los tubos se agita vigorosamente para separar RPE en pequeños grupos. Si la separación no es completa, los tubos se colocan de nuevo en baño de agua durante otros 5 minutos. Después de tripsina-EDTA de incubación, los tubos son inspeccionados para posibles sin disolver grupos de células mixtas. Cualquier grupos observados se eliminan mediante vidrio de punta fina pipeta Pasteur. Después de girar hacia abajo (1,4 rpm en centrífuga clínica durante 4 minutos), las células hfRPE se volvió a suspender en los medios de comunicación del EPR el 15% y se coloca en frascos de Primaria (ejemplo: cat 08-772-45; Fisher Scientific, Pittsburgh, PA.. ). Este medio se reemplaza después de un día con el medio de RPE 5% de suero que contienen, y los cambios que se hicieron cada 2 ó 3 días. Después de 3 a 4 semanas, las células se confluentes y pigmentadas de manera uniforme. Luego se trypsinized en el 0,25% de tripsina-EDTA durante 10 a 15 minutos, volvió a suspender en un 15% de suero que contienen células RPE medio de cultivo, y sembradas en claro insertos de cultivo celular de 150 a 200 mil células por pocillo (Transwell, Corning Costar, Corning, NY), con 12 mm de diámetro se inserta, los poros de 0,4 um, las membranas de poliéster (por ejemplo: gato no 07-200-161, Fisher Scientific)... Antes de la siembra, los pozos fueron recubiertos con matriz extracelular humanos (10 mg en 150 HBSS por pocillo, el gato no 354.237,.. BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ) y se cura con la luz UV en el capó durante 2 horas. En algunos casos, el procedimiento se repitió tripsinización por segunda vez, para recoger las células que no se haya desprendido después de la tripsina en primer lugar. El mismo protocolo (sin recubrimiento con ECM) se utilizó para cultivo de células en los frascos para generar la población P1 de las células. Estas células fueron utilizados en experimentos cuando tenían una resistencia del tejido total de ≥ 200 Ω • cm 2 y fueron uniformemente pigmentados.
Por favor, haga clic aquí para obtener una cifra mayor 1 .
4. Paso a paso los procedimientos
- Prepare 12 y placa con múltiples soluciones (para cada ojo cuatro pozos necesarios):
- añadir 10x solución de antibióticos antimicóticos - 1 y / ojo
- añadir PBS / HBSS solución de enjuague - 2 pozos / ojo
- agregar la solución de dispasa - 1 y / ojo
- Prepare la disección de una placa de Petri de desembalaje 5 agujas de fijación y llenado con HBSS
- Desempaquetar los ojos y los situará en antibiótico-antimicótico solución durante 3-5 minutos (preparado en el paso 1)
- Lavar los ojos en dos pozos (preparado en el paso 1) con PBS / HBSS, y luego los transferirá a la disección plato.
- Recorte excesivo del músculo y los tejidos conectivos que rodean el ojo
- Usando agujas 27G de seguridad (pin de silicio hasta la base) los ojos en la disección de la alineación de los platos de una manera en la córnea hacia arriba.
- Usando un cuchillo puerto lateral hacer incisión por debajo de la córnea, donde corte circular se iniciará
- El uso de tijeras iris que cortar alrededor de los ojos, y luego con unas tijeras misma corte a través del vítreo y levantar la parte anterior del ojo de distancia.
Nota: en los pasos 3-8 evitar cualquier exceso de presión mecánica a cara. - La transferencia de los ojos abiertos en la solución dispasa (preparado en el paso 1)
- Incubar ocular durante 40-60 minutos a 37 º C con CO2 al 5%
- Reemplace la solución HBSS en la disección de plato con uno nuevo.
- La transferencia de los ojos de la solución a dispasa plato de disección.
- La posición del ojo en una placa Petri (taza del globo ocular hacia arriba) y seguro con dos agujas de 27G.
- Con cuidado, levante la retina separado parcialmente y con unas tijeras corte la retina retina se desprenda de el nervio óptico. Deseche retina.
- El uso de tijeras iris hacer una incisión de la periferia del ojo hacia el nervio óptico.
- Usando los cinco agujas 27G aplanar los ojos lo que la capa de RPE bien estirado.
- Con la tijera que corta la retina circular alrededor del nervio óptico que separa la capa de RPE del apego al nervio óptico.
Nota: los pasos 13-17 se puede hacer con o sin aumento bajo microscopio estereoscópico - Ajuste estereomicroscopio a la ampliación de 250xo más y encontrar el borde de la hoja de RPE cerca del nervio óptico a lo largo del corte realizado con tijeras iris.
- El uso de dos pinzas de membrana separado RPE-Bruch de la capa de tejido coroideo. Se puede requerir varios intentos para encontrar la zona a lo largo de la orilla, donde la conexión del EPR y la coroides es más débil.
- Hojas de RPE en lugar frío tripsina-EDTA solución en el tubo de 15 ml
- Después de que el EPR se recogen, los tubos de tapa y transfiera con los tejidos de la tripsina-EDTA en baño de agua durante 15 minutos de 10 a 37 ° C.
- Después de 10 minutos de incubación, agite vigorosamente tubos de 15 ml para separar RPE en pequeños grupos. Si la separación no es completa, coloque los tubos de nuevo en baño de agua durante otros 5 minutos.
- Inspeccionar los tubos para posibles sin disolver grupos de células mixtas. Cualquier grupos observados se deben eliminar con punta fina pipeta Pasteur de vidrio.
- Girar hacia abajo (1,4 rpm en centrífuga clínica de 4 minutos), las células hfRPE, eliminar el sobrenadante y resuspender las células en un 15% los medios de comunicación del EPR (9 ml en total)
- Colocar 3 ml de suspensión celular en frascos Primaria agregar 2 ml de agua dulce un 15% los medios de comunicación del EPR, un frasco lugar en la incubadora hasta el día siguiente (37 ° C, 5% de CO 2)
5. Resultados representante
Validación funcional de cultivo celular hfRPE
En experimentos anteriores que han utilizado estos cultivos primarios para determinar la expresión, la polarización y la función de las proteínas plasmáticas de transporte de membrana e identificar las vías de señalización específicas que regulan la función del EPR 1.11 Estas características a medida que se acumulan proporcionar un conjunto de validación de las propiedades que se pueden aplicar a cada generación de células. Los experimentos se resumen a continuación identificar las proteínas que determinan el transporte de fluidos transepitelial y la integridad de la vía paracelular. Estos experimentos in vitro han sido validados en un modelo animal de la retina de nuevo reinserción 6.
Figura 2. Localización de CFTR en las células hfRPE panel superior izquierdo:. CFTR se detectó en las células utilizando hfRPE enriquecido membrana extractos. M, marcador de peso molecular, carril 1, mayor madurez (banda C) e inmaduros (bandas A y B) del panel inferior central: la localización de inmunofluorescencia de CFTR (etiqueta verde) El panel superior derecho: vista ampliada sección transversal a través del plano z muestra.. de máxima intensidad de proyección a través del eje z. ZO-1 (etiquetado como rojo) sirve como un marcador apretado nudo de delinear las partes apical y basolateral de la RPE. DAPI (azul) etiquetas de los núcleos situados cerca de la membrana basal. ZO-1 aparece como amarillo / naranja, ya que la fluorescencia se superpone con etiqueta roja verde de CFTR.
Figura 3. IFN-inducida por los cambios fisiológicos en hfRPE A:. Adición de IFN al baño basal aumentado el transporte de fluidos transepitelial (J v) a través de la monocapa de células primarias, hfRPE cultivadas J v se representa como una función del tiempo en el seguimiento de la parte superior y de líquido. absorción (apical de baño basal) se indica con valores positivos, de potencial transepitelial (TEP) y la resistencia del tejido total (R T) se representa como una función del tiempo en las huellas del fondo. B: La adición de CFTRinh-172 (5 M) en el baño basal inhibe el IFN-estimulado J aumento v.
A continuación se muestra un ejemplo de experimentos realizados con modelos animales que confirma hfRPE hallazgos in vitro. En este experimento, el desprendimiento de retina artificial creada se redujo significativamente después de la adición de IFNg a la superficie del ojo exterior (Figura 4 A, B). Este efecto puede ser parcialmente bloqueada por: (1) Además de bloqueador de AMPc (Figura 4), (2) completamente bloqueada después de la adición de bloqueadores de JAK AMPc +. Las imágenes a continuación se han obtenido utilizando escáner octubre
Figura 4. En experimentos in vivo desprendimiento de retina. Los procedimientos de estos experimentos in vivo han sido descritas previamente en detalle 6. En estos experimentos, los desprendimientos de retina se han creado en los ojos de ratas mediante la inyección de 0,5 a 3 l de solución de PBS modificado en el espacio subretinal (SRS), solo o con una combinación de JAK-STAT y los inhibidores de la PKA. Cada experimento tuvo un período de control inicial de 40-70 minutos después de la creación del desprendimiento de retina. Durante este tiempo, la tasa de variación del volumen de la ampolla se midió para asegurar la estabilidad de la ampolla. Tomografía de coherencia óptica de imagen (Instituto de Física Aplicada de la Academia Rusa de Ciencias, Nizhniy Novgorod, Rusia) se utilizó para medir la evolución en el tiempo del cambio de volumen en el SRS.
El tiempo de la re-unión volcambio de volumen se midió por tomografía de coherencia óptica (OCT). Octubre las imágenes de cuatro experimentos diferentes (paneles de la izquierda, AD), que muestran un cambio en el tamaño de desprendimiento (flechas en A, B y D) después de la adición de IFN a la superficie anterior de 40 a 70 min. Los grupos A y B muestran que IFN Jv mayor de su tipo de control (≈ 2 l • cm 2 • h -1) a 14 y de 12 l • cm 2 • h-1, respectivamente. Tras la adición de JAK-STAT y los inhibidores de PKA (C y D), el IFN - las tasas de absorción inducido se redujo significativamente de 0,2 y 7,9 l • cm 2 • h-1, respectivamente. Las flechas indican el límite de la ampolla para la comparación con el área comprendida dentro de la línea de puntos, (volumen inicial). Lado derecho de la figura: top-panel de resumen de medir las tasas de Jv de varios experimentos, panel central, la película ( clic aquí ), el panel inferior-3D secciones del experimento se resumen en B. Pseudocolor en azul indica la extensión espacial de la separación en t = 0 y 40 minutos después de la adición de INFγ.
Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con la Asociación para la Investigación en Visión y Oftalmología declaración. El protocolo fue aprobado por el Cuidado de Animales y el empleo de los Institutos Nacionales de Salud.
Discussion
En los experimentos actuales, se describen las modificaciones adicionales de nuestras técnicas previamente publicado 3 diseñado para agilizar los pasos necesarios para producir múltiples culturas consistente hfRPE primaria con un número mayor de células disponibles en cada ojo. Cada cambio en el procedimiento original fue rigurosamente probado en la fisiología de múltiples experimentos de biología molecular para asegurar que los cambios no introducir artefactos y ser probado continuamente por muchos otros laboratorios con estas células. Por último, otros experimentos se llevaron a cabo para comparar los resultados in vitro a las perturbaciones similares en modelos animales.
Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Damos las gracias al laboratorio de Jeffrey Adijanto, Banzon Tina, Li Rong, Wan Qin, Zhang Congxiao, Zhao Jing, Zhi Connie, Zia Awais,, Strunnikova Natalia miembros para ayudar en la caracterización de estos cultivos celulares. Un agradecimiento especial a Jing Zhao, Zhi Connie, y Tina Banzon por su ayuda en el mantenimiento de grandes cantidades de cultivos de células.
Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de la Salud Programa de Investigación Intramural.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instruments needed for dissection protocol | |||
| Stereo Microscope - any available with working magnification x250 needed for dissection | |||
| Dissecting dish - e.g. Kimble 100 x 20mm #23062 (one per dissection) any source | |||
| Sylgard 184 - WPI Cat. #SYLG184* | |||
| * To prepare dissecting dish follow Sylgard 184 included mixing instructions, pour mixed liquid elastomer into Petri dish to form 5-8mm layer. Allow elastomer to cure for at least 24hrs. Dish with cured elastomer can be sterilized using 70% ethanol and reused multiple times (~100 times) | |||
| 27 G needles from B-D PrecissionGlide 1¼ length (5 per dissection) any source | |||
| HBSS 1X Solution containing Ca and Mg salts - GIBCO Cat.#14025 500ml (good for multiple dissections) | |||
| Iris scissors carbide serrated blade, curved - FST Cat.# 14559-11 (one) | |||
| Retinal scissors - Katena Cat.#K4-5300 (one) | |||
| Forceps - e.g. Dumont Tweezers #5 with polished tips from WPI Cat.#500085 (2 pieces) | |||
| Sideport knife - Alcon, ClearCut 1mm, Dual Bevel, angled Cat.#8065921540 | |||
| Centrifuge tube 15ml - (one per eye) any source | |||
| Pasteur glass pipette - (one per dissection) any source | |||
| Plate 12 well (one per dissection) any source | |||
| Primaria 25cm2 flask - (2-3 per eye) any source | |||
References
- Bharti, K., Miller, S. S., Arnheiter, H. The new paradigm: Retinal pigment epithelium cells generated from embryonic stem cells or induced pluripotent cells. Pigment Cell & Melanoma Research. , Forthcoming Forthcoming.
- Strunnikova, N. V., Maminishkis, A., Barb, J. J., Wang, F., Zhi, C., Sergeev, Y., Chen, W., Edwards, A. O., Stambolian, D., Abecasis, G., Swaroop, A., Munson, P. J., Miller, S. S., S, S. Transcriptome analysis and molecular signature of human retinal pigment epithelium. Hum Mol Genet. 19 (12), 2468-2486 (2010).
- Miller, S. S., Maminishkis, A., Li, R., Adijanto, J. Chapter 184: Phototransduction: RPE transport Retina Phototransduction: RPE transport. Encyclopedia of the Eye. , Elsevier. 2540-2540 (2010).
- Bryant, D. M., Mostov, K. E. From cells to organs: Building polarized tissue. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 9 (11), 887-901 (2008).
- Maminishkis, A., Chen, S., Jalickee, S., Banzon, T., Shi, G., Wang, F. E., Ehalt, T., Hammer, J. A., Miller, S. S. Confluent monolayers of cultured human fetal retinal pigment epithelium exhibit morphology and physiology of native tissue. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47, 3612-3624 (2006).
- Shi, G., Maminishkis, A., Banzon, T., Jalickee, S., Li, R., Hammer, J., Miller, S. S. Control of chemokine gradients by the retinal pigment epithelium. Invest Ophthalmol Vis Sci. 49, 4620-4630 (2008).
- Economopoulou, M., Hammer, J., Wang, F. E., Fariss, R., Maminishkis, A., Miller, S. S. Expression, localization, and function of junctional adhesion molecule-C (JAM-C) in human retinal pigment epithelium. Invest Ophthalmol Vis Sci. 50 (3), 1454-1463 (2008).
- Li, R., Maminishkis, A., Banzon, T., Wan, Q., Jalickee, S., Chen, S., Miller, S. S. IFN{gamma} Regulates Retinal Pigment Epithelial Fluid Transport. Am J Physiol Cell Physiol. 297, C1452-C1465 (2009).
- Li, R., Maminishkis, A., Wang, F. E., Miller, S. S. PDGF-C and -D induced proliferation/migration of human RPE is abolished by inflammatory cytokines. Invest Ophthalmol Vis Sci. 48, 5722-5732 (2007).
- Maminishkis, A., Jalickee, S., Blaug, S. A., Rymer, J., Yerxa, B. R., Peterson, W. M., Miller, S. S. The P2Y(2) receptor agonist INS37217 stimulates RPE fluid transport in vitro and retinal reattachment in rat. Invest Ophthalmol Vis Sci. 43, 3555-3566 (2002).
- Wang, F. E., Zhang, C., Maminishkis, A., Dong, L., Zhi, C., Li, R., Zhao, J., Majerciak, V., Gaur, A. B., Chen, S. MicroRNA-204/211 alters epithelial physiology. FASEB J. 24, (2010).
- Adijanto, J., Banzon, T., Jalickee, S., Wang, N. S., Miller, S. S. CO2-induced ion and fluid transport in human retinal pigment epithelium. J Gen Physiol. 133, 603-622 (2009).
- Li, R., Maminishkis, A., Zahn, G., Vossmeyer, D., Miller, S. S. Integrin alpha5beta1 mediates attachment, migration, and proliferation in human retinal pigment epithelium: relevance for proliferative retinal disease. Invest Ophthalmol Vis Sci. 50, 5988-5996 (2009).
- Peterson, W. M., Meggyesy, C., Yu, K., Miller, S. S. Extracellular ATP activates calcium signaling, ion, and fluid transport in retinal pigment epithelium. J Neurosci. 17, 2324-2337 (1997).
- Voloboueva, L. A., Liu, J., Suh, J. H., Ames, B. N., Miller, S. S. R)-alpha-lipoic acid protects retinal pigment epithelial cells from oxidative damage. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46, 4302-4310 (2005).
