Summary
Vi erbjuder en reproducerbar metod för odling konfluenta monolager av mänskliga foster näthinnans pigment epitelceller (hfRPE) celler som uppvisar morfologi, fysiologi, polaritet, och protein och gen mönster uttryck av vuxna infödda vävnad. Detta arbete har utvidgats till en djurmodell av flera ögonsjukdomar.
Abstract
Vi har utvecklat ett förfarande för cellodling som kan producera stora mängder konfluenta monolager av primära mänskliga foster retinal (hfRPE) pigmentepitel kulturer med morfologiska, fysiologiska och genetiska egenskaper som naturligt humant RPE. Dessa hfRPE cellkulturer uppvisar tunga pigmentering och elektronmikroskopi visar omfattande apikala membran mikrovilli. Den Junktional komplex identifierades med immunofluorescens märkning av olika tight junction proteiner. Epitelial polaritet och funktion av dessa lätt reproducerbar primära kulturer liknar tidigare studerat däggdjur modeller av infödda RPE, inklusive människa. Dessa resultat förlängas genom utveckling av terapeutiska ingrepp i flera djurmodeller för mänskliga ögat sjukdom. Vi har fokuserat på strategier för borttagning av onormal ansamling av vätska i näthinnan eller subretinal utrymme. Den extracellulära subretinal utrymme separerar ljusmätare yttre segment och den apikala membranet i RPE och är avgörande för underhåll av retinal bilagor och en mängd RPE / näthinnan interaktioner.
Protocol
1. Mänskliga fostervävnad
All mänsklig vävnad forskning följer principerna i Helsingforsdeklarationen och NIH granskningsnämnder. Fostrets ögon erhålls av en oberoende beställare, Advanced Bioscience Resources (ABR, Alameda, Kalifornien), från slumpmässigt givare vid 16 till 22 veckor av graviditeten, placeras i RPMI-1640 medier innehåller rör (tillhandahålls av ABR), packade på is, och levereras av en övernattning prioritet leveransservice. Vävnader förbli livskraftig upp till 48 timmar efter enucleation.
2. Cellodlingsmedium
MEM-alfa modifierad medium (Sigma-Aldrich) används som bas medel för att förbereda 5% och 15% serum innehållande media för odling av RPE celler (RPE medium; tabell 1 nedan).
| Namn | Sigma | Gibco | Belopp | Förvaring |
| MEM, alfa modifiering | M-4526 | 500 ml | +4 ° C | |
| N1 komplettera | N-6530 | 5 ml | +4 ° C | |
| Penicillin-streptomycin | 15140-148 | 5 ml | -20 ° C | |
| GlutaMax - Jag | 35.050 | 5 ml | -20 ° C | |
| Icke essentiella aminosyror | M-7145 | 5 ml | +4 ° C | |
| THT * | -80 ° C | |||
| Taurin | T-0625 | 125 mg | ||
| Hydrokortison | H-0396 10 | 10 mikrogram | ||
| Triiodo-thyronin | T-5516 | 0,0065 mikrogram | ||
| Fostrets bovint serum ** | 5% eller 15% | -80 ° C |
Tabell 1. Mänskliga Fostrets RPE Medium Komponenter för beredning av 500 ml Medium
* THT görs genom att lösa taurin-hydrokortison-triiodo-thyronin i en 1,5 mL PBS innan mediet. Flera alikvoter görs och förvaras vid -80 ° C för att förenkla odling beredningen av odlingsmedium.
** Fostrets bovint serum är inte från Sigma-Aldrich eller Gibco.
Fostrets bovint serum som används i media beredning erhålls från Atlanta Biologicals (Atlanta, GA). Varje flaska av serum värmeinaktiverad (56 ° C i 1 timme) före användning. För att säkerställa cellodling konsekvens stora mängder av serum från samma parti köps och förvaras i -20 ° C tills de används för media beredning. Glest seedade celler från ett specifikt parti hfRPE celler odlas i 24 - eller 12 - bra plattor under några veckor i media som innehåller 20% FBS från olika partier. Den snabbast växande melanated celler med den mest klassiska RPE morfologi (kullersten) indikerar en lämplig serum hel del som kan användas för cellodling.
Cellodlingsmedium innehåller också: N1 komplettera (Sigma-Aldrich) 1:100 ml / ml, GlutaMax / penicillin-streptomycin 1:100 ml / ml (Gibco) och onödiga aminosyra-lösning (Sigma-Aldrich) 1:100 ml / ml. Dessutom (THT) hydrokortison (20 mikrogram / l), taurin (250 mg / l), och triiodo-thyronin (0,013 mikrogram / l) bereds vidare genom att lösa dessa tre komponenter i PBS för att en slutlig koncentration av 1:500 (ml / ml). Lika delar av THT lagras vid 80 ° C tills läggs till RPE medium.
3. Cell Culture
Vid mottagandet är obruten klot sköljas i antibiotika antimykotika lösning (utspädd till 10X,.. Katten inte 15.240-096, Invitrogen) plus gentamicin (1 mg / ml) i 3 till 5 minuter (figur 1 nedan). 
Figur 1. Efter inkubation antibiotika är sköljas bort två gånger med medium såsom HBSS eller PBS. Ett ögongloben vid tidpunkten överförs till 10 cm petriskål med belagda med Sylgard-184 (WPI) och säkras med 27G nålar. Använda entydiga sideport kniv (Alcon) ett snitt görs genom sklera under ciliarkroppen (1 / 3 av avståndet från ögat ekvatorn till den främre ytan). Detta snitt används för att starta ett cirkulär skuren för borttagning av främre ögat delen. Denna nedskärning görs med en volfram-karbid belagd böjd iris sax med en kniv räfflad (FST). Före avlägsnandet av den främre delen av ögat, görs vissa neddragningar genom glaskroppen för att undvika loss retina från RPE vid den bakre stolpen. Efter den främre delen av ögat tas bort, är den bakre stolpen inkuberas med dispase-I-lösning (2 U / ml, katt ingen 04942086001,.. Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) hos 5% serum som innehåller medium för 40-60 minuter i 37 ° C-5% CO 2. Efter dispase behandlingen, är bakre stolparna överförs till en HBSS i petriskålar med kisel stoppning (Sylgard 184, Dow Corning, Midland, MI) och dissekeras in i kvadranter eller större bitar för att tillräckligt plana vävnader. Då näthinnan är försiktigt bort med pincett. Encelliga RPE lager var skalas av i ark och samlas in direkt i kallt trypsin-EDTA (Gibco, # 25.200-056) lösning. Efter RPE samlas, är rör med vävnader i trypsin-EDTA förseglas och överföras till vattenbad i 10-15 minuter vid 37 ° C. Efter 10 minuter av inkubation, är rören skakas kraftigt att separera RPE i små kluster. Om avståndet inte är fullständig, är rören läggs tillbaka i vattenbad i ytterligare 5 min. Efter trypsin-EDTA inkubation, är rören inspekteras för eventuell FN-upplöst blandad cell kluster. Alla observerade kluster bort med fin spets glas pasteurpipett. Efter spinning ner (1,4 rpm på kliniska centrifug för 4 min), är hfRPE celler resuspenderas i 15% RPE media och läggs sedan i primaria kolvar (exempel: katt inte 08-772-45, Fisher Scientific, Pittsburgh, PA.. ). Detta medium ersätts efter en dag med 5% serum innehållande RPE medium, och efterföljande ändringar gjordes var 2 till 3 dagar. Efter 3 till 4 veckor, blev cellerna konfluenta och jämnt pigmenterade. De är sedan trypsinized på 0,25% trypsin-EDTA i 10 till 15 minuter, resuspenderas i 15% serum innehållande RPE cellodling medium, och seedad på tydliga insatser cellkultur 150 till 200K celler per brunn (Transwell, Corning Costar, Corning, NY), med 12-mm skär, 0,4-um porer, membran polyester (exempel: cat ingen 07-200-161, Fisher Scientific)... Före sådd var brunnar belagda med humant extracellulärt matrix (10 mikrogram i 150 mikroliter HBSS per brunn, katt inga 354.237,.. BD Biosciences, Franklin Lakes, New Jersey) och botas med UV-ljus i luvan i 2 timmar. I vissa fall var trypsinization upprepas en andra gång, för att samla in de celler som inte lossnar efter första trypsinization. Samma protokoll (exkl. beläggning med ECM) användes till kultur celler på flaskor för att skapa P1 befolkning celler. Dessa celler har använts i experiment när de hade ett totalt vävnad motstånd på ≥ 200 Ω • cm 2 och var jämnt pigmenterade.
Klicka här för större bild 1 .
4. Steg för steg-anvisningar
- Förbered 12-brunnar med flera lösningar (för varje öga fyra brunnar behövs):
- lägga 10x antibiotika antimykotika lösning - en bra / öga
- lägga till PBS / HBSS lösning för sköljning - 2 brunnar / öga
- lägga dispase lösning - en bra / öga
- Förbered dissekera petriskål med att packa 5 fixering nålar och fylla det med HBSS
- Packa upp ögonen och placera dem i antibiotika-antimykotika lösning för 3-5 minuter (utarbetad i steg 1)
- Skölj ögonen i två brunnar (utarbetad i steg 1) med PBS / HBSS och sedan överföra dem till dissekera maträtt.
- Trim överdrivna muskler och bindväv runt ögat
- Använda 27G nålar säkra (stift ner till kisel bas) ögon i dissekera maträtt anpassa dem på ett sätt där hornhinnan är vänd uppåt.
- Använda sideport kniv göra snitt under hornhinnan, där cirkulära snitt kommer att börja
- Använda iris sax att klippa runt ögonen, sedan med samma sax skär genom glaskroppen och lyfta främre delen av ögat borta.
OBS: I steg 3 tom 8 undvika alltför mekaniskt tryck på ögongloben. - Överför öppet öga i dispase lösningen (beredd enligt steg 1)
- Inkubera öga kopp för 40-60 minuter vid 37 ° C med 5% CO 2
- Byt HBSS lösning i dissekera skålen med nytt.
- Överföring ögat från dispase lösning dissekera maträtt.
- Position öga petriskål (ögongloben kopp uppåt) och säkra med två 27G nålar.
- Lyft försiktigt delvis separeras näthinnan och med hjälp av retinal sax klippa näthinnan från synnerven. Släng näthinnan.
- Använda iris sax gör ett snitt från utkanten av ögat mot synnerven.
- Använda alla fem 27G nålar plattar ögat gör RPE lager fint utsträckt.
- Använda näthinnan sax göra runda skär runt synnerven separera RPE lager från bilaga till synnerven.
Obs: steg 13-17 göras med låg förstoring eller utan lupp - Justera stereomikroskop till 250X förstoringeller mer och hitta kanten av RPE plåt nära synnerven längs snittet gjorts av iris sax.
- Med hjälp av två pincett separata RPE-Bruch membran från koroidal vävnaden skikt. Det kan kräva ett par försök att hitta området längs kanten där anslutning av RPE och åderhinnan är som svagast.
- Placera RPE ark i kallt trypsin-EDTA-lösning i 15 ml tub
- Efter RPE samlas in, mössa och överföra rör med vävnader i trypsin-EDTA i vattenbad i 10-15 min vid 37 ° C.
- Efter 10 minuter inkubering Skaka 15 ml rör för att skilja RPE i små kluster. Om avståndet inte är komplett, placera rören tillbaka i vattenbad i ytterligare 5 min.
- Inspektera rör för eventuell FN-upplöst blandad cell kluster. Alla observerade kluster bör tas bort med fin spets glas pasteurpipett.
- Spinn ner (1,4 rpm på kliniska centrifug för 4 minuter) hfRPE celler, avlägsna supernatanten och återsuspendera celler i 15% RPE medier (9 ml totalt)
- Sätt 3 ml cellsuspension i primaria flaskor tillsätt 2 ml rent 15% RPE medier, placera kolven i inkubatorn förrän nästa dag (37 ° C, 5% CO 2)
5. Representativa resultat
Funktionell validering av hfRPE cellodling
I tidigare experiment har vi använt dessa primära kulturer att bestämma uttryck, polarisering och funktion plasmaproteiner membrantransport och identifiera specifika signalvägar som reglerar RPE funktionen 1-11 Dessa egenskaper som de ackumulerade ge en validering uppsättning egenskaper som kan tillämpas till varje cell generation. Experimenten sammanfattas nedan identifiera de proteiner som bestämmer transepithelial vätska transporter och integritet paracellular väg. Dessa in vitro-försök har validerats i en djurmodell av näthinnan åter återfastsättning 6.
Figur 2. Lokalisering av CFTR i hfRPE celler Vänster övre panelen:. CFTR upptäcktes i hfRPE celler med membran-berikad extrakt. M, molekylviktsmarkör, bana 1, stora mogna (band C) och omogna (band A och B) Center undre panelen: immunofluorescens lokalisering av CFTR (grön etikett) Överst till höger panel: förstorad tvärsnitt utsikt genom z-planet visar.. maximal intensitet projektion genom z-axeln. ZO-1 (märkt som röd) fungerar som en tight junction markör avgränsa apikala och basolateral sidor av RPE. DAPI (blå) etiketter kärnan ligger nära basalmembran. ZO-1 visas som gul / orange, sedan röd etikett överlappar grön fluorescens från CFTR.
Figur 3. IFNγ-inducerad fysiologiska förändringar i hfRPE A:. Tillägg av IFNγ till basala badet ökat transepithelial vätsketransporten (J v) över monolager av primär, odlade hfRPE celler ritas som en funktion av tiden i övre spåra och netto vätska J v. absorption (apikala till basala bad) är markerad med positiva värden, transepithelial potential (TEP) och total vävnad motstånd (R T) plottas som en funktion av tiden i botten spår. B: Tillägg av CFTRinh-172 (5 M) till basala badet hämmade IFNγ-stimulerad J v öka.
Nedan är ett exempel på experiment djurmodell bekräftar hfRPE in vitro-fynd. I detta experiment var artificiellt skapade näthinneavlossning minskade signifikant efter tillsats av IFNg till det yttre ögats yta (Figur 4 A, B). Denna effekt kan delvis blockeras av: (1) tillägg av cAMP-blockerare (Figur 4D), (2) helt blockerad efter tillsättning av JAK + cAMP blockerare. Bilderna nedan är erhålls med oktober skanner.
Figur 4. In vivo näthinneavlossning experiment. Har förfarandena för dessa in vivo-experiment har tidigare beskrivits i detalj 6. I dessa försök var retinal avdelningar skapats i råtta ögat genom injektion av 0,5 till 3 mikroliter av modifierade PBS lösning i subretinal rymden (SRS), ensam eller med en kombination av JAK-STAT och PKA-hämmare väg. Varje experiment hade en första kontroll period av 40-70 minuter efter skapandet av näthinneavlossning. Under denna tid var förändringstakten i Bleb mätt att försäkra Bleb stabilitet. Optisk koherens tomografi avbildning (Institutet för tillämpad fysik, Ryska Vetenskapsakademin, Nizhniy Novgorod, Ryssland) användes för att mäta tiden under volymförändringen i SRS.
Tiden under re-bilaga volvolym förändras mättes genom optisk koherens tomografi (OCT). Oktober bilder från 4 olika experiment (paneler till vänster, AD) som visar en förändring i avdelning storlekar (pilar i A, B och D) med tillägg av IFNγ den främre ytan för 40-70 min. Paneler A och B visar att IFNγ ökat JV från dess kontroll ränta (≈ 2 l • cm 2 • h -1) till 14 och 12 l • cm 2 • h-1, respektive. Efter tillägg av JAK-STAT vägen och PKA-hämmare (C och D), IFNγ - inducerad utnyttjandegrad var signifikant minskat till 0,2 och 7,9 l • cm 2 • h-1, respektive. Pilarna anger gränsen för den Bleb för jämförelse med det område som avgränsas inom den streckade linjen, (börjar volym). Höger sida av figuren: toppanelen-sammanställning av uppmätta JV priser från flera experiment, mitt panel-film ( klicka här ), undre panelen-3D avsnitt av experiment sammanfattas i B. pseudofärger i blått indikerar geografiska omfattningen av avskildhet vid t = 0 och 40 minuter efter tillsats av INFγ.
Alla djurförsök har utförts i enlighet med Föreningen för forskning i Vision och Ögon uttalande. Protokollet godkändes av Djurens skötsel och användning kommitté av National Institutes of Health.
Discussion
I det aktuella experimenten beskriver vi ytterligare ändringar av våra tidigare publicerade metoder 3 för att effektivisera flera steg som behövs för att producera konsekventa hfRPE primära kulturer med ett högre nummer av tillgängliga celler per öga. Varje förändring i det ursprungliga förfarandet var rigoröst testade i flera fysiologi och molekylär experiment biologi för att säkerställa att förändringarna inte införde artefakter och som ständigt testas av många andra labb med hjälp av dessa celler. Slutligen togs ytterligare experiment som genomförs för att jämföra in vitro-resultat till liknande störningar i djurmodeller.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Vi tackar Lab medlemmar Jeffrey Adijanto, Tina Banzon, Rong Li Qin Wan, Congxiao Zhang, Jing Zhao, Connie Zhi, Awais Zia, Natalia Strunnikova om hjälp med att karakterisera dessa cellkulturer. Speciellt tack till Jing Zhao, Connie Zhi, och Tina Banzon för deras hjälp att upprätthålla stora lager av cellkulturer.
Detta arbete stöddes av National Institutes of Health Interna forskningsprogram.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instruments needed for dissection protocol | |||
| Stereo Microscope - any available with working magnification x250 needed for dissection | |||
| Dissecting dish - e.g. Kimble 100 x 20mm #23062 (one per dissection) any source | |||
| Sylgard 184 - WPI Cat. #SYLG184* | |||
| * To prepare dissecting dish follow Sylgard 184 included mixing instructions, pour mixed liquid elastomer into Petri dish to form 5-8mm layer. Allow elastomer to cure for at least 24hrs. Dish with cured elastomer can be sterilized using 70% ethanol and reused multiple times (~100 times) | |||
| 27 G needles from B-D PrecissionGlide 1¼ length (5 per dissection) any source | |||
| HBSS 1X Solution containing Ca and Mg salts - GIBCO Cat.#14025 500ml (good for multiple dissections) | |||
| Iris scissors carbide serrated blade, curved - FST Cat.# 14559-11 (one) | |||
| Retinal scissors - Katena Cat.#K4-5300 (one) | |||
| Forceps - e.g. Dumont Tweezers #5 with polished tips from WPI Cat.#500085 (2 pieces) | |||
| Sideport knife - Alcon, ClearCut 1mm, Dual Bevel, angled Cat.#8065921540 | |||
| Centrifuge tube 15ml - (one per eye) any source | |||
| Pasteur glass pipette - (one per dissection) any source | |||
| Plate 12 well (one per dissection) any source | |||
| Primaria 25cm2 flask - (2-3 per eye) any source | |||
References
- Bharti, K., Miller, S. S., Arnheiter, H. The new paradigm: Retinal pigment epithelium cells generated from embryonic stem cells or induced pluripotent cells. Pigment Cell & Melanoma Research. , Forthcoming Forthcoming.
- Strunnikova, N. V., Maminishkis, A., Barb, J. J., Wang, F., Zhi, C., Sergeev, Y., Chen, W., Edwards, A. O., Stambolian, D., Abecasis, G., Swaroop, A., Munson, P. J., Miller, S. S., S, S. Transcriptome analysis and molecular signature of human retinal pigment epithelium. Hum Mol Genet. 19 (12), 2468-2486 (2010).
- Miller, S. S., Maminishkis, A., Li, R., Adijanto, J. Chapter 184: Phototransduction: RPE transport Retina Phototransduction: RPE transport. Encyclopedia of the Eye. , Elsevier. 2540-2540 (2010).
- Bryant, D. M., Mostov, K. E. From cells to organs: Building polarized tissue. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 9 (11), 887-901 (2008).
- Maminishkis, A., Chen, S., Jalickee, S., Banzon, T., Shi, G., Wang, F. E., Ehalt, T., Hammer, J. A., Miller, S. S. Confluent monolayers of cultured human fetal retinal pigment epithelium exhibit morphology and physiology of native tissue. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47, 3612-3624 (2006).
- Shi, G., Maminishkis, A., Banzon, T., Jalickee, S., Li, R., Hammer, J., Miller, S. S. Control of chemokine gradients by the retinal pigment epithelium. Invest Ophthalmol Vis Sci. 49, 4620-4630 (2008).
- Economopoulou, M., Hammer, J., Wang, F. E., Fariss, R., Maminishkis, A., Miller, S. S. Expression, localization, and function of junctional adhesion molecule-C (JAM-C) in human retinal pigment epithelium. Invest Ophthalmol Vis Sci. 50 (3), 1454-1463 (2008).
- Li, R., Maminishkis, A., Banzon, T., Wan, Q., Jalickee, S., Chen, S., Miller, S. S. IFN{gamma} Regulates Retinal Pigment Epithelial Fluid Transport. Am J Physiol Cell Physiol. 297, C1452-C1465 (2009).
- Li, R., Maminishkis, A., Wang, F. E., Miller, S. S. PDGF-C and -D induced proliferation/migration of human RPE is abolished by inflammatory cytokines. Invest Ophthalmol Vis Sci. 48, 5722-5732 (2007).
- Maminishkis, A., Jalickee, S., Blaug, S. A., Rymer, J., Yerxa, B. R., Peterson, W. M., Miller, S. S. The P2Y(2) receptor agonist INS37217 stimulates RPE fluid transport in vitro and retinal reattachment in rat. Invest Ophthalmol Vis Sci. 43, 3555-3566 (2002).
- Wang, F. E., Zhang, C., Maminishkis, A., Dong, L., Zhi, C., Li, R., Zhao, J., Majerciak, V., Gaur, A. B., Chen, S. MicroRNA-204/211 alters epithelial physiology. FASEB J. 24, (2010).
- Adijanto, J., Banzon, T., Jalickee, S., Wang, N. S., Miller, S. S. CO2-induced ion and fluid transport in human retinal pigment epithelium. J Gen Physiol. 133, 603-622 (2009).
- Li, R., Maminishkis, A., Zahn, G., Vossmeyer, D., Miller, S. S. Integrin alpha5beta1 mediates attachment, migration, and proliferation in human retinal pigment epithelium: relevance for proliferative retinal disease. Invest Ophthalmol Vis Sci. 50, 5988-5996 (2009).
- Peterson, W. M., Meggyesy, C., Yu, K., Miller, S. S. Extracellular ATP activates calcium signaling, ion, and fluid transport in retinal pigment epithelium. J Neurosci. 17, 2324-2337 (1997).
- Voloboueva, L. A., Liu, J., Suh, J. H., Ames, B. N., Miller, S. S. R)-alpha-lipoic acid protects retinal pigment epithelial cells from oxidative damage. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46, 4302-4310 (2005).
