Biology

कृन्तकों से प्राथमिक वयस्क fibroblast संस्कृतियों की स्थापना

Published: October 5, 2010 doi: 10.3791/2033

Andrei Seluanov¹, Amita Vaidya¹, Vera Gorbunova¹

¹Department of Biology, University of Rochester

Summary

इस लेख अलगाव और त्वचा और जंगली कृन्तकों के फेफड़े के ऊतकों से प्राथमिक fibroblast संस्कृतियों के रखरखाव के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करता है.

Abstract

जैविक अध्ययन के लिए प्राथमिक कोशिकाओं के बजाय कैंसर कोशिका लाइनों का उपयोग करने के महत्व को व्यापक रूप से मान्यता प्राप्त हो रहा है. प्राथमिक कोशिकाओं कोशिका चक्र नियंत्रण, apoptosis के अध्ययन में पसंद कर रहे हैं, और डीएनए की मरम्मत, कैंसर की कोशिकाओं के रूप में इन प्रक्रियाओं में शामिल जीनों में परिवर्तन ले. प्राथमिक कोशिकाओं replicative senescence या aneuploidization की शुरुआत के कारण अनिश्चित काल के सभ्य नहीं कर सकते हैं. इसलिए, नए संस्कृतियों के लिए नियमित रूप से स्थापित करने की आवश्यकता है. कृंतक भ्रूण fibroblasts के अलगाव की प्रक्रिया को अच्छी तरह से स्थापित है, लेकिन अक्सर एक चुनौती प्रस्तुत वयस्क fibroblast संस्कृतियों अलग. वयस्क कृंतक मानव रोग के माउस मॉडल से अलग fibroblasts एक पसंदीदा नियंत्रण हो सकता है जब उन्हें मानव रोगियों से fibroblasts की तुलना कर सकते हैं. इसके अलावा, वयस्क fibroblasts केवल उपलब्ध सामग्री जब जंगली कृन्तकों जहां गर्भवती महिलाओं को आसानी से नहीं प्राप्त कर सकते हैं के साथ काम कर रहे हैं. यहाँ हम अलगाव और कृंतक त्वचा और फेफड़ों से वयस्क fibroblasts की संस्कृति के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं. हम इस प्रक्रिया को सफलतापूर्वक इस्तेमाल बीस कृंतक प्रजातियों भर से fibroblasts प्रयोगशाला चूहों और चूहों से Beaver, साही, गिलहरी और जैसे जंगली कृन्तकों को अलग.

Protocol

1. शुरू करने से पहले

70% इथेनॉल के साथ कैंची और संदंश जीवाणुरहित.
30 एमएल बीकर अंदर छोटे चुंबकीय उत्तेजक प्लेस, पन्नी की दो परतों, और आटोक्लेव के साथ कवर.
बाँझ पानी में एक 28 Wunsch इकाइयों / एमएल Liberase Blendzyme 3 के शेयर समाधान तैयार करें. -20 डिग्री सेल्सियस में 0.5 एमएल aliquots और फ्रीज हर का उपयोग करने से पहले एक नई विभाज्य पहले गला लें. समाधान विगलन के बाद बादल दिखाई दे सकता है. समाधान भंवर जब तक यह स्पष्ट हो जाता है.
सेल संस्कृति मीडिया गर्म.

2. पशु नमूना तैयार

चेतावनी: जंगली जानवरों के एक रेबीज वायरस जैसे रोगज़नक़ों हो सकता है. हमेशा खुला sharps के बारे में पता होना.

पशु euthanize लोथ और 4 में जगह डिग्री सेल्सियस लोथ को तुरंत उपयोग यह सबसे अच्छा है, लेकिन, अगर यह व्यावहारिक नहीं है के रूप में यदि जानवरों क्षेत्र में एकत्र कर रहे हैं, शवों को 24 घंटे के भीतर इस्तेमाल किया जा सकता है. 24 घंटे सेल उपज में गिरावट आती है के बाद.
पशु शल्य सूट में या रासायनिक हुड में काटना (नहीं टिशू कल्चर हुड में).
Underarm क्षेत्र त्वचा के नमूनों को इकट्ठा करने के लिए एक सुविधाजनक साइट underarm त्वचा के रूप में पतली है, कम वसा होता है, और फर कम घना है. 70% इथेनॉल के साथ साफ चीरा साइट. सुनिश्चित करें कि फर इथेनॉल के साथ भिगो है.
चारों ओर एक तेज स्केलपेल के साथ चीरा साइट फर दाढ़ी. वांछित चीरा साइट की तुलना में एक बड़े क्षेत्र दाढ़ी. त्वचा के लिए कटौती कम से कम कोशिश करो. 70% इथेनॉल के साथ क्षेत्र में स्प्रे और इसे सूखा.
एक त्वचा नमूना आबकारी लगभग 1 ² सेमी का एक टुकड़ा इकट्ठा. ऊतक संदंश के साथ त्वचा की चुटकी, और कैंची से काट. त्वचा के साथ मोटी परत में कटौती नहीं है, के रूप में वसा collagenase पाचन के साथ हस्तक्षेप करने की कोशिश करो. फेफड़ों के नमूने एकत्र करने के लिए, 70% इथेनॉल के साथ छाती क्षेत्र धोने, और कैंची के साथ छाती पर एक टी आकार चीरा बनाने और त्वचा के अलावा खींच फ्लैप द्वारा त्वचा खोलने. 70% इथेनॉल के साथ खोला मांसपेशियों क्षेत्र धो और सूखी. कट रिब पिंजरे बाँझ संदंश और कैंची (बड़े जानवरों के लिए अस्थि कटर का उपयोग) का उपयोग. बाँझ तकनीक का उपयोग करने के लिए आंतरिक अंगों contaminating से बचने. यंत्र जानवर फर छुआ साथ आंतरिक अंगों को मत छुओ. लगभग 1 ² सेमी बाँझ संदंश और कैंची का उपयोग करने के फेफड़ों के टुकड़े काटें.
प्लेस ऊतक टुकड़े बाँझ पीबीएस के साथ 50 एमएल ट्यूबों में सुखाने से बचने के लिए.
इथेनॉल के साथ ऊतक के टुकड़े के साथ 50 एमएल ट्यूबों के बाहर धो, और उन्हें टिशू कल्चर हुड के लिए ले.
ठीक पशु लोथ के निपटान.

3. एक्स्ट्रेक्टिंग कक्ष

एक 10 सेमी टिशू कल्चर बाँझ स्केलपेल का उपयोग पकवान में ऊतक टुकड़े स्थानांतरण. नमूने के साथ बहुत ज्यादा पीबीएस हस्तांतरण मत करो.
कट ~ 1 मिमी दो नलियां का उपयोग कर टुकड़े में ऊतक. दो ब्लेड का उपयोग कर एक कैंची केंद्र से शुरू और अलग खींच कार्रवाई का उपयोग करें. रखें ऊतक balled टुकड़ा द्वारा टुकड़ा काट नहीं नहीं. जब काटने पर्याप्त है त्वचा पोटीन जैसा दिखता है, इसे टुकड़ों में अलग नहीं लेकिन पतली खिंचाव जाएगा होगा. फेफड़े के ऊतकों में कटौती करने के लिए आसान है, और यह छोटे टुकड़ों में अलग कर देगा.
एक स्केलपेल का प्रयोग, बाँझ 30 एमएल बीकर में कटौती ऊतक बाँझ हलचल पट्टी के साथ हस्तांतरण. DMEM/F12 मीडिया के 10 एमएल के साथ 0.14 Wunsch / इकाइयों एमएल Liberase Blendzyme 3, और 1X / एंटीबायोटिक antimycotic के साथ ऊतकों को काटने के लिए इस्तेमाल की थाली धो, और ऊतक के टुकड़े के साथ 30 एमएल बीकर का हल जोड़ने.
बाँझ पन्नी के साथ बीकर कवर, और 37 पर सेते ° सी, धीरे धीरे क्रियाशीलता, 30 से 90 मिनट के लिए. ऊष्मायन की लंबाई प्रजातियों और ऊतक के प्रकार पर निर्भर करता है. ध्यान रखना करने के लिए नहीं ऊतक से अधिक को पचाने. उत्तम पैदावार प्राप्त कर रहे हैं जब ऊतक टुकड़े पाचन के अंत में अभी भी मौजूद हैं. त्वचा अब फेफड़ों की तुलना में पचाने में लेता है. बड़े जानवरों से त्वचा अब लगता है को पचाने में. 30 मिनट के बाद पाचन, और फिर हर 10 मिनट की जाँच करें. मीडिया, जब त्वचा पाचन पूरा हो गया है बादल छाए रहेंगे और एक दूसरे से अलग त्वचा टुकड़े हो जाता है, और टुकड़े के किनारों "फजी" हो. फेफड़े पाचन फेफड़ों के टुकड़े परिवर्तन के लाल से सफेद और चिपचिपा फाइबर बनाने शुरू रंग जब बंद कर दिया जाना चाहिए.
Pipet युक्त ऊतक टुकड़े ऊपर और नीचे समाधान के clumps को तोड़ने. बाँझ 50 एमएल ट्यूब के समाधान स्थानांतरण. यदि टुकड़े 10 एमएल विंदुक काटने और पाचन के माध्यम से आसानी से चाल अच्छी तरह से किया गया था. बीकर 15% FBS, 1X / एंटीबायोटिक antimycotic के साथ 10 एमएल गर्म DMEM/F12 मीडिया के साथ 3 बार कुल्ला और 50 एमएल ट्यूब ऊतक के टुकड़े के साथ मीडिया जोड़ने. 50 एमएल ट्यूब और एक बार कुछ उलटा द्वारा मिश्रण बंद. मीडिया में FBS Liberase पाचन बंद हो जाएगा.
5 मिनट के लिए एक झूलते बाल्टी टिशू कल्चर अपकेंद्रित्र में 524 जी में स्पिन. सतह पर तैरनेवाला निकालें. गर्म DMEM/F12 मीडिया के 10 एमएल में 15% FBS, 1X / एंटीबायोटिक antimycotic के साथ गोली Resuspend. निलंबन के साथ Pipetअधिकतम ऊतक के टुकड़े को तोड़ने के बल.
15% FBS, 1X / एंटीबायोटिक antimycotic, और 5 मिनट के लिए एक झूलते बाल्टी टिशू कल्चर अपकेंद्रित्र में 524 जी में मिश्रण अपकेंद्रित्र के साथ DMEM/F12 मीडिया के एक और 30 एमएल जोड़ें. एक और समय Liberase के निशान हटाने दोहराएँ.
DMEM/F12 मीडिया के 10 एमएल में 15% FBS के साथ गोली Resuspend, 1X / एंटीबायोटिक antimycotic और एक 10 सेमी ऊतक संस्कृति पकवान और एक टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में जगह 37 ° सी, _5% सीओ 2, करने के लिए स्थानांतरण _{3% 2} हे .
प्लेटें fibroblasts और मीडिया रंग के लिए हर दिन की जाँच करें. अगर अलगाव सफल रहा था, fibroblasts ऊतक टुकड़े के बाहर क्रॉल और प्लेट (चित्रा 1) के लिए देते हैं. fibroblast 2-5 दिनों के भीतर ऊतकों के टुकड़े से बाहर निकलें शुरू करते हैं.
यदि मीडिया परिवर्तन पीला रंग, यह संभावित संक्रमण या कक्षों की भीड़भाड़ को इंगित करता है. उच्च आवर्धन पर खुर्दबीन के नीचे प्लेटों की जांच करते हैं. यदि बैक्टीरिया, कवक, या कीड़े वर्तमान प्लेट (यह शायद ही कभी प्रयोगशाला जानवरों के साथ एक मुद्दा है, लेकिन हो सकता है जब नमूने जंगली से एकत्र कर रहे हैं) त्यागने कर रहे हैं. यदि कोई संदूषण मौजूद है, लेकिन मीडिया रंग बदल गया, यह या तो बहुत अधिक कक्षों या भी कई ऊतक एक ही थाली में रखा टुकड़े की वजह से है. यदि प्लेट के 60% से अधिक संलग्न fibroblasts द्वारा कवर किया जाता है, थाली पर मीडिया को बदलने और नए मीडिया के साथ एक नई प्लेट ऊतक टुकड़े हस्तांतरण. यदि नहीं fibroblasts कई थाली से जुड़ी मीडिया को बदलने के लिए और एक 2-4 प्लेटें ऊतक टुकड़े विभाजित.
7 दिनों के बाद, अगर मीडिया पहले नहीं बदला था, मीडिया परिवर्तन और नए मीडिया के साथ एक नई प्लेट के ऊतक टुकड़े हस्तांतरण.
एक अतिरिक्त 7 दिनों के लिए और कोशिकाओं ऊतक टुकड़े सेते हैं. 14 दिन तक सभी व्यवहार्य fibroblasts ऊतक टुकड़े exited है.
सेल अलगाव की शुरुआत से 14 दिनों के बाद, पुराने मीडिया और ऊतक टुकड़े त्यागें, 15% FBS, 1X पेनिसिलीन / स्ट्रेप्टोमाइसिन, गैर आवश्यक अमीनो एसिड के साथ कोशिकाओं और ^5x10 5 कोशिकाओं / प्लेट EMEM पर उन्हें एक नई प्लेट पर प्लेट फसल , और पाइरूवेट सोडियम. EMEM मीडिया fibroblasts केवल और अन्य प्रकार की कोशिकाओं मरने या proliferating बंद हो जाएगा के विकास का समर्थन करेंगे.
बाद कोशिकाओं 80-90% संगम तक पहुँचते हैं, तो भविष्य में उपयोग के लिए कक्षों की एक विभाज्य फ्रीज.
5x10 ⁵ कोशिकाओं / प्लेट पर उन्हें बंटवारे द्वारा कोशिकाओं संवर्धन जारी रखें जब कोशिकाओं 80-90% संगम तक पहुँचने .

4. प्रतिनिधि परिणाम

सामान्य fibroblasts प्रमुख protrusions (lamellipodia) (चित्रा 2) के साथ बड़े कोशिकाओं रहे हैं. Fibroblasts एक monolayer में बढ़ता है. एक स्वस्थ संस्कृति बढ़ रही एम चरण में 1-10% कोशिकाओं, के रूप में गोल थाली की सतह से अधिक ऊंचा कोशिकाओं, लेकिन प्लेट (चित्रा 3) से अलग नहीं है मान्यता प्राप्त हैं. आमतौर पर, एक 10 सेमी 5x10 ⁵ कोशिकाओं के साथ वरीयता प्राप्त पकवान 3-4 दिनों में मिला हुआ हो जाता है. दुगनी समय प्रजातियों के बीच बहुत भिन्न होता है, और लंबे समय रहते कृंतक ^एक प्रजातियों में से कुछ के लिए अधिक से अधिक हो सकता है . जब कोशिकाओं को एक थाली वे G1 चरण में प्रसार गिरफ्तारी को भरने. Fibroblasts की विशिष्ट मिला हुआ प्लेट कोशिकाओं (चित्रा 4) के एक कसकर बांध परत में शामिल है. जब कोशिकाओं को 90% संगम तक पहुँचने वे बंटवारे के लिए तैयार हैं. अगर वांछित है, कोशिकाओं एक गिरफ्तार समय की विस्तारित अवधि के लिए नियमित रूप से मीडिया परिवर्तन (एक या दो बार एक सप्ताह) के साथ मिला हुआ प्लेट पर रखा जा सकता है.

चित्रा 1. माउस (एक) त्वचा और फेफड़ों (बी) से fibroblast अलगाव मीडिया. स्वाधीन कोशिकाओं और मलबे 7 दिन पर तस्वीरें लेने से पहले हटायें बदल गया था .

चित्रा 2. माउस फेफड़ों fibroblasts.

चित्रा 3. माउस एम चरण में कोशिकाओं से युक्त fibroblasts की एक क्षेत्र है, 10X आवर्धन पर फोटो खिंचवाने.

चित्रा 4. माउस fibroblasts की एक मिला हुआ प्लेट, 10X आवर्धन पर फोटो खिंचवाने.

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Discussion

सामान्य प्राथमिक fibroblasts जैविक अनुसंधान के क्षेत्र में स्थापित कैंसर कोशिका लाइनों के लिए एक बढ़िया विकल्प प्रदान करते हैं. Fibroblasts की एक महत्वपूर्ण लाभ यह है कि वे परिवर्तन ओंकोजीन और ट्यूमर शामक में नहीं ले और बरकरार सेल चक्र चौकियों को बनाए रखने. यह सामान्य कोशिका चक्र विनियमन, डीएनए की मरम्मत, और apoptosis के अध्ययन के लिए एक पसंदीदा प्रणाली fibroblasts बनाता है. यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल अलगाव और प्राथमिक fibroblasts की रखरखाव के लिए एक सरल नुस्खा प्रदान करता है. इस प्रोटोकॉल को सफलतापूर्वक कृन्तकों के 20 से अधिक प्रजातियों से fibroblasts अलग करने के लिए इस्तेमाल किया गया था.

यह महत्वपूर्ण है हर समय बाँझपन बनाए रखने के जब सेल संस्कृतियों के साथ काम करने के लिए संक्रमण से बचने. यदि प्रयोगशाला भी HELA कोशिकाओं जैसे आक्रामक कैंसर कोशिका लाइनों संस्कृतियों, fibroblasts कैंसर की कोशिकाओं से अलग संभाला जाना चाहिए. यह एक नामित और प्राथमिक संस्कृतियों के लिए हुड इनक्यूबेटर पसंद है.

यह 3% की शारीरिक ऑक्सीजन एकाग्रता में प्राथमिक सेल संस्कृतियों को बनाए रखने के लिए बेहतर है. (20%) वायुमंडलीय ऑक्सीजन संस्कृतियों और बढ़ जाती है oxidative तनाव उम्र shortens. माउस fibroblasts oxidative तनाव के प्रति संवेदनशील हैं और senesce या ~ 14 जनसंख्या दोहरीकरण के भीतर संकट में प्रवेश करेंगे जब 20 (वायुमंडलीय)% ऑक्सीजन पर रखा. माउस fibroblasts 3% ऑक्सीजन ² पर अनिश्चित काल तक बनाए रखा जा सकता है.

हमेशा संस्कृतियों की जनसंख्या दुगनी की संख्या का रिकार्ड रखने. बड़े प्रजातियों (8,000 g ऊपर शरीर द्रव्यमान) replicative senescence प्रदर्शन की संभावना है, और संस्कृति में एक सीमित देता है 3% ¹ ऑक्सीजन भी. चूहों और चूहों जैसे छोटे प्रजातियों, से कोशिकाओं को अनिश्चित काल 3% ऑक्सीजन पैदा, लेकिन अंततः aneuploid बन सकता है. यदि संभव हो, कम जनसंख्या दुगनी में कोशिकाओं का उपयोग प्रयोगों शुरू करते हैं.

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

हम इस प्रोटोकॉल के पहले संस्करण के साथ हमें प्रदान करने के लिए डॉ. स्टीवन Austad धन्यवाद. यह काम NIH और एलिसन मेडिकल फाउंडेशन से VG अनुदान द्वारा और के रूप में समर्थित किया गया था

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM/F12 media	Invitrogen	11330-032
Fetal Bovine Serum (FBS), Qualified	Invitrogen	01437-036	The Qualified serum had been pre-tested to provide good growth support for primary fibroblasts.
Antibiotic/Antimycotic	Invitrogen	15420-096
Penicillin/Streptomycin	Invitrogen	15140-122
Liberase TM Research Grade	Roche	05401127001	Replacement enzyme.
A note from the authors: Since Roche discontinued Liberase Blendzyme 3 (11814184001), they recommend using Liberase TM Research Grade medium Thermolysin (Cat. no. 05401119001 - 10 mg, Cat. no. 05401127001 - 100mg) instead. We have switched to this enzyme successfully with no issues.
EMEM media	ATCC	30-203	The EMEM media from ATCC already contains nonessential amino acids and sodium pyruvate.
Feathered #21 disposable, sterile scalpel	Multiple suppliers
Three Gas Control incubator	Forma or Heraeus