Summary
توضح هذه المقالة بروتوكول للعزلة وصيانة الثقافات الليفية الأولية من الجلد وأنسجة الرئة من القوارض البرية.
Abstract
أهمية استخدام الخلايا الأولية ، بدلا من خطوط الخلايا السرطانية ، للدراسات البيولوجية أصبح من المسلم به على نطاق واسع. ويفضل الخلايا الأولية في دراسات الخلايا دورة الخلية ، والسيطرة ، وإصلاح الحمض النووي ، كما الخلايا السرطانية تحمل طفرات في الجينات المسؤولة عن هذه العمليات. لا يمكن أن يكون مثقف الخلايا الأولية اجل غير مسمى بسبب ظهور الشيخوخة أو تنسخي aneuploidization. وبالتالي ، ثقافات جديدة تدعو الحاجة إلى وضع بانتظام. راسخة الإجراء لعزل الخلايا الليفية القوارض الجنينية ، ولكن عزل الثقافات الليفية الكبار غالبا ما يقدم تحديا. قد الليفية القوارض الكبار معزولة عن نماذج الماوس من الأمراض التي تصيب الإنسان تكون السيطرة المفضل عند مقارنتها الليفية من المرضى من البشر. علاوة على ذلك ، لا أخلاقي الليفية هي المادة الوحيدة المتاحة عند العمل مع القوارض البرية التي لا يمكن فيها الإناث الحوامل يمكن الحصول عليها بسهولة. هنا نقدم بروتوكول للعزلة وثقافة الليفية الكبار من القوارض الجلد والرئتين. استخدمنا هذا الإجراء بنجاح لعزل الخلايا الليفية من أكثر أنواع القوارض العشرين من الفئران والجرذان المختبرية على القوارض البرية مثل القندس ، النيص ، والسنجاب.
Protocol
1. قبل بدء
- مقص وملقط تعقيم مع الايثانول 70 ٪.
- مكان مغناطيسي صغير داخل دورق 30 مل ، وتغطي مع اثنين من طبقات من احباط ، وموصدة.
- إعداد 28 وحدة ونش / مل محلول المخزون من Blendzyme Liberase 3 في الماء المعقم. جعل aliquots 0.5 مل والتجميد في -20 درجة مئوية. أذاب a قسامة جديدة قبل كل استخدام. قد يبدو الحل غائما بعد الذوبان. دوامة الحل حتى يصبح واضحا.
- الاحماء وسائل الإعلام ثقافة الخلية.
2. تحضير العينة الحيوانية
الحذر : قد تحتوي على الحيوانات البرية مسببات الأمراض مثل فيروس داء الكلب. أن يكون دائما على بينة من الأدوات الحادة مفتوحة.
- الموت ببطء والحيوانية ووضع الجثة في 4 درجات مئوية. فمن الأفضل لاستخدام الجثة على الفور ، ولكن ، إذا كان هذا ليس عمليا كما لو يتم جمع الحيوانات في الميدان ، قد يتم استخدام جثث خلال 24 ساعة. بعد 24 ساعة على هبوط العائد الخلية.
- تشريح الحيوان في الجناح الجراحي أو الكيميائي في غطاء محرك السيارة (وليس في الغطاء زراعة الأنسجة).
- منطقة الإبط هو موقع مناسب لجمع عينات من الجلد تحت الإبط والجلد أرق ، ويحتوي على كميات اقل من الدهون ، والفراء هو أقل كثافة. تنظيف الموقع مع شق الايثانول 70 ٪. تأكد من غارقة الفراء مع الايثانول.
- حلق الفراء حول موقع شق مع مشرط حاد. حلق مساحة أكبر من موقع شق المطلوب. في محاولة لتقليل التخفيضات على الجلد. رش المنطقة مع 70 ٪ من الإيثانول واتركها لتجف.
- لجمع المكوس عينة الجلد جزء من حوالي 1 سم 2. قرصة الجلد مع ملقط الأنسجة ، وقطع مع مقص. ليس محاولة لخفض طبقة الدهون مع الجلد ، والدهون كما يتداخل مع عملية الهضم كولاجيناز. لجمع عينات من الرئة ، وغسل منطقة الصدر مع الايثانول 70 ٪ ، وفتح الجلد على صدره مع مقص عن طريق شق تي الشكل وسحب اللوحات بعيدا من الجلد. غسل المنطقة العضلات مع فتح 70 ٪ من الإيثانول وترك الجافة. قطع القفص الصدري باستخدام ملقط معقم والمقص (استخدام قواطع العظام للحصول على أكبر الحيوانات). استخدام تقنيات معقمة لتجنب تلويث الأعضاء الداخلية. لا تلمس الأعضاء الداخلية مع الصكوك التي مست فراء الحيوانات. قطع شظايا من الرئة حوالي 1 سم 2 باستخدام ملقط معقم والمقص.
- شظايا الأنسجة مكان في 50 مل من الأنابيب مع برنامج تلفزيوني العقيمة لتجنب الجفاف.
- غسل السطح الخارجي للأنابيب سعة 50 مل مع شظايا الأنسجة مع الإيثانول ، وأخذها إلى الأنسجة هود الثقافة.
- التخلص السليم من الذبيحة.
3. استخراج خلايا
- نقل الأنسجة شظايا في صحن 10 سم زراعة الأنسجة باستخدام مشرط معقم. لا نقل تلفزيوني مع الكثير من العينة.
- قطع الانسجة الى قطع ~ 1 ملم باستخدام اثنين من المشارط. استخدام اثنين من ريش باستخدام مقص العمل بدءا من الوسط وسحب إربا. الحفاظ على النسيج حتى تكور ، لا قطع قطعة قطعة. عندما قطع كافية في الجلد تشبه المعجون ، فإنه لن الى قطع منفصلة ولكنها ستمتد رقيقة. نسيج الرئة هو أسهل لقطع ، وأنه سيفصل الى قطع صغيرة.
- باستخدام مشرط ، ونقل الأنسجة يقتطع العقيمة الدورق 30 مل بقضيب العقيمة. غسل لوحة تستخدم لقطع الأنسجة مع 10 مل من وسائل الاعلام مع وحدات DMEM/F12 ونش 0.14 / مل Liberase Blendzyme 3 ، والمضادات الحيوية 1X / مضاد فطري ، وإضافة إلى حل الدورق 30 مل مع شظايا الأنسجة.
- تغطية كأس بورق العقيمة ، واحتضان عند 37 درجة مئوية ، واثارة ببطء ، لمدة 30 إلى 90 دقيقة. طول الحضانة يعتمد على نوع ونوع الأنسجة. الحرص على عدم الإفراط في هضم الأنسجة. ويتم الحصول على أفضل غلة عندما الأنسجة شظايا لا تزال موجودة في نهاية عملية الهضم. الجلد يستغرق وقتا أطول للهضم من الرئة. الجلد من الحيوانات الكبيرة وقتا أطول لهضمها. التحقق من عملية الهضم بعد 30 دقيقة ، ومن ثم كل 10 دقيقة. عند اكتمال عملية الهضم الجلد ، وسائل الإعلام يصبح غائما وشظايا الجلد منفصلة عن بعضها البعض ، وحواف القطع تصبح "غامض". يجب أن تتوقف عملية الهضم الرئة عند تغيير لون الرئة شظايا من الأحمر إلى الأبيض والبدء في تشكيل الألياف اللزجة.
- الماصة في محلول يحتوي على شظايا النسيج صعودا وهبوطا لكسر كتل. الحل لنقل أنبوب 50 مل العقيمة. إذا كانت شظايا التحرك بسهولة من خلال قطع ماصة 10 مل والهضم وحسنا فعلت. شطف الكأس 3 مرات مع 10 مل من وسائل الاعلام DMEM/F12 FBS دافئة مع 15 ٪ ، 1X مضاد حيوي / مضاد فطري وإضافة وسائل الإعلام للأنبوب 50 مل مع شظايا الأنسجة. إغلاق أنبوب 50 مل وتخلط بواسطة انقلاب عدة مرات. سوف FBS في وسائل الاعلام وقف Liberase الهضم.
- تدور في 524 غرام في جهاز للطرد المركزي دلو يتأرجح زراعة الأنسجة لمدة 5 دقائق. إزالة طاف. Resuspend وبيليه في 10 مل من وسائل الاعلام DMEM/F12 FBS دافئة مع 15 ٪ ، 1X مضاد حيوي / مضاد فطري. الماصة مع تعليقأقصى قوة لكسر قطعة النسيج.
- إضافة آخر 30 مل من وسائل الاعلام مع DMEM/F12 FBS 15 ٪ ، 1X مضاد حيوي / مضاد فطري ، ومزيج الطرد المركزي في 524 غرام في جهاز للطرد المركزي دلو يتأرجح زراعة الأنسجة لمدة 5 دقائق. أكرر مرة أخرى لإزالة آثار Liberase.
- Resuspend وبيليه في 10 مل من وسائل الاعلام مع DMEM/F12 FBS 15 ٪ ، 1X مضاد حيوي / مضاد فطري ونقل إلى صحن 10 سم ومكان زراعة الأنسجة في نسيج الثقافة الحاضنة في 37 درجة مئوية ، 5 ٪ CO 2 ، O 2 3 ٪ .
- الاختيار لوحات كل يوم لالليفية واللون وسائل الإعلام. إذا كانت العزلة قد تمت بنجاح ، الليفية الزحف للخروج من شظايا الأنسجة ونعلق على لوحة (الشكل 1). وتبدأ الخلايا الليفية للخروج شظايا الأنسجة في غضون 2-5 أيام.
- إذا كان يتغير لونه إلى الأصفر وسائل الإعلام ، وهذا يشير إلى تلوث محتمل أو اكتظاظ الزنازين. فحص لوحات تحت المجهر في التكبير عالية. إذا البكتيريا والفطريات والديدان أو تجاهل الحاضر لوحات (وهذا نادرا ما يكون مسألة مع حيوانات المختبر ، ولكن قد تحدث عندما يتم جمع عينات من البرية). إذا لم يحصل أي تلوث موجود ولكن وسائل الإعلام تغيير اللون ، ويتسبب هذا إما عن طريق العديد من الخلايا أو الأنسجة شظايا كثيرة جدا وضعت في طبق واحد. إذا شملت أكثر من 60 ٪ من لوحة من قبل الليفية المرفقة ، وتغير وسائل الاعلام على لوحة ونقل شظايا الأنسجة لوحة جديدة مع وسائل الإعلام الجديدة. إن لم يكن الكثير من الخلايا الليفية التي تعلق على لوحة ، وتغيير وسائل الإعلام وتقسيم قطعة نسيج لوحات 2-4.
- بعد 7 أيام ، إن وسائل الإعلام لم تتغير في وقت سابق ، وتغير وسائل الإعلام ونقل شظايا الأنسجة لوحة جديدة مع وسائل الإعلام الجديدة.
- احتضان خلايا الأنسجة وشظايا ل7 أيام إضافية. قبل 14 يوما قد خرجت عن الليفية قابلة للحياة شظايا الأنسجة.
- بعد 14 يوما من بداية العزلة الخلية ، تجاهل وسائل الإعلام القديمة وشظايا الأنسجة والخلايا والحصاد لوحة لهم على طبق من جديد في خلايا 5x10 5 / EMEM وحة FBS مع 15 ٪ ، 1X البنسلين / الستربتوميسين وغير الأحماض الأمينية الأساسية والبيروفات الصوديوم. وسائل الإعلام EMEM دعم نمو الخلايا الليفية أنواع الخلايا الأخرى فقط ، وسوف يموت أو وقف الانتشار.
- بعد الوصول إلى نقطة التقاء الخلايا 80-90 ٪ ، وتجميد an قسامة من الخلايا لاستخدامها في المستقبل.
- مواصلة زراعة الخلايا من خلال تقسيمها إلى خلايا 5x10 5 / لوحة عندما تصل خلايا التقاء 80-90 ٪.
4. ممثل النتائج
الخلايا الليفية هي خلايا طبيعية واسعة مع نتوءات بارزة (lamellipodia) (الشكل 2). الليفية تنمو في أحادي الطبقة. ثقافة صحية متزايدة يحتوي على خلايا 1-10 ٪ في المرحلة M ، كما اعترفت تقريب خلايا مرتفعة على سطح اللوحة ، ولكن ليس بمعزل عن لوحة (الشكل 3). عادة ، طبق 10 سم مع خلايا المصنف 5 5x10 تصبح متكدسة في 3-4 أيام. الوقت مضاعفة يختلف كثيرا بين الأنواع ، وربما تكون أكبر بالنسبة لبعض أنواع القوارض طويلة الأمد 1. عندما الخلايا ملء طبق يعتقلون الانتشار في المرحلة G1. لوحة متموجة نموذجي يحتوي على الخلايا الليفية طبقة من الخلايا معبأة بإحكام (الشكل 4). عندما تصل إلى نقطة التقاء الخلايا 90 ٪ انهم مستعدون لتقسيم. إذا رغبت في ذلك ، يمكن الحفاظ على الخلايا على لوحة an متموجة اعتقلوا لفترات طويلة من الزمن مع التغيرات وسائل الاعلام العادية (مرة أو مرتين في الأسبوع).
الشكل 1. تم تغيير العزلة الليفية من جلد الفأر (A) والرئة (B) ، وسائل الإعلام لإزالة الخلايا غير مرتبط والحطام قبل اتخاذ الصور على يوم واحد 7.
الشكل 2. الليفية الماوس الرئة.
الشكل 3. حقل من الخلايا الليفية تحتوي على خلايا الفأر في مرحلة - M وتصويرها على التكبير 10x.
الشكل 4. صفيحة متموجة من الخلايا الليفية الماوس وتصويرها على التكبير 10x.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الليفية الأولية الطبيعية تقدم بديلا ممتازا لإنشاء خطوط الخلايا السرطانية في مجال البحوث البيولوجية. ميزة هامة من الخلايا الليفية هو أنها لا تحمل طفرات في الجينات المسرطنة والمكثفات ورم سليمة والحفاظ على نقاط التفتيش دورة الخلية. وهذا يجعل الخلايا الليفية العادي يفضل نظاما للدراسات لتنظيم دورة الخلية ، وإصلاح الحمض النووي ، وموت الخلايا المبرمج. بروتوكول الموصوفة هنا يقدم وصفة بسيطة للعزلة وصيانة الليفية الأولية. وقد استخدم هذا البروتوكول لعزل الخلايا الليفية بنجاح لأكثر من 20 نوعا من القوارض.
فمن المهم للحفاظ على عقم في جميع الأوقات عند التعامل مع الثقافات الخلية لتجنب التلوث. إذا كان مختبر الثقافات أيضا خطوط الخلايا السرطانية عدوانية مثل خلايا هيلا ، ينبغي التعامل معها بشكل منفصل الليفية من خلايا السرطان. ويفضل أن يكون لها غطاء محرك السيارة المعينة وحاضنة للثقافات الابتدائي.
فمن الأفضل للحفاظ على ثقافات الخلية الأساسية في تركيز الأوكسجين الفسيولوجية من 3 ٪. الغلاف الجوي (20 ٪) الأكسجين يقصر عمر الثقافات ويزيد الاكسدة. الليفية الماوس حساسة لالاكسدة وسوف senesce أو أدخل الأزمة في غضون 14 ~ الأضعاف السكان عندما حافظت على 20 ٪ (الغلاف الجوي) الأوكسجين. يمكن الحفاظ على الخلايا الليفية الماوس إلى أجل غير مسمى في 2 الأكسجين 3 ٪.
دائما سجل عدد السكان تضاعف من الثقافات. الأنواع الكبيرة (كتلة الجسم فوق 8000 ز) من المرجح أن يحمل تنسخي الشيخوخة ، وسوف يكون له عمر محدود في الثقافة ، وحتى في الأكسجين 3 ٪ 1. والخلايا من أصغر الأنواع ، مثل الفئران والجرذان ، وتنتشر إلى أجل غير مسمى في الأكسجين 3 ٪ ، ولكنها قد تصبح في نهاية المطاف مختل الصيغة الصبغية. إذا كان ذلك ممكنا ، بدء التجارب باستخدام الخلايا إلى مضاعفة السكانية المنخفضة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
نشكر الدكتور ستيفن Austad لتزويدنا النسخة الأولى من هذا البروتوكول. وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة والمؤسسة الطبية لVG إليسون وAS
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F12 media | Invitrogen | 11330-032 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Qualified | Invitrogen | 01437-036 | The Qualified serum had been pre-tested to provide good growth support for primary fibroblasts. |
| Antibiotic/Antimycotic | Invitrogen | 15420-096 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| Liberase TM Research Grade | Roche | 05401127001 | Replacement enzyme. |
| A note from the authors: Since Roche discontinued Liberase Blendzyme 3 (11814184001), they recommend using Liberase TM Research Grade medium Thermolysin (Cat. no. 05401119001 - 10 mg, Cat. no. 05401127001 - 100mg) instead. We have switched to this enzyme successfully with no issues. | |||
| EMEM media | ATCC | 30-203 | The EMEM media from ATCC already contains nonessential amino acids and sodium pyruvate. |
| Feathered #21 disposable, sterile scalpel | Multiple suppliers | ||
| Three Gas Control incubator | Forma or Heraeus | ||
References
- Seluanov, A. Distinct tumor suppressor mechanisms evolve in rodent species that differ in size and lifespan. Aging . Cell. 7, 813-823 (2008).
- Parrinello, S. Oxygen sensitivity severely limits the replicative lifespan of murine fibroblasts. Nat Cell Biol. 5, 741-747 (2003).
