Estabelecer culturas de fibroblastos adultos primária de roedores

Summary

Este artigo descreve um protocolo para isolamento e manutenção de culturas de fibroblastos primários da pele e do tecido pulmonar dos roedores silvestres.

Abstract

A importância de usar pilhas, ao invés de linhas celulares de cancro, para estudos biológicos está se tornando amplamente reconhecida. Pilhas são preferidas em estudos de células a apoptose ciclo de controle, e reparo do DNA, como as células cancerosas carregam mutações em genes envolvidos nestes processos. Pilhas não podem ser cultivadas indefinidamente devido ao início da senescência replicativa ou aneuploidization. Assim, novas culturas devem ser estabelecidas regularmente. O procedimento para o isolamento de fibroblastos de roedores embrionárias está bem estabelecida, mas isolar culturas de fibroblastos adultos, muitas vezes representa um desafio. Fibroblastos de roedores adultos isolados a partir de modelos do rato da doença humana pode ser um controle preferidos quando comparando-os com fibroblastos de pacientes humanos. Além disso, os fibroblastos adultos são o único material disponível quando se trabalha com roedores silvestres onde as fêmeas grávidas não podem ser facilmente obtidos. Aqui nós fornecemos um protocolo para isolamento e cultura de fibroblastos da pele de roedores adultos e os pulmões. Nós usamos este procedimento com sucesso para isolar os fibroblastos de mais de vinte espécies de roedores a partir de ratos de laboratório e em ratos de roedores silvestres como o castor, porco-espinho, e esquilo.

Protocol

1. Antes de Começar

1. Esterilizar a tesoura e uma pinça com etanol 70%.
2. Lugar agitador magnético pequeno dentro de um copo 30 mL, cobrir com duas camadas de papel alumínio, e autoclave.
3. Prepare a 28 unidades Wunsch / mL solução estoque de Liberase Blendzyme 3 em água estéril. Faça alíquotas 0,5 mL e congelar a -20 ° C. Descongelar uma alíquota de novo antes de cada utilização. A solução pode parecer turvo após o descongelamento. Vortex a solução até que fique claro.
4. Aqueça o meio de cultura celular.

2. Preparação de amostras de animais

Cuidado: animais selvagens podem conter agentes patogênicos, como um vírus da raiva. Sempre estar ciente de abrir farelos.

1. Eutanásia do animal e colocar a carcaça a 4 ° C. O melhor é usar a carcaça de imediato, no entanto, se isso não é prático, como se os animais são recolhidos no campo, as carcaças podem ser usados ​​dentro de 24 horas. Após 24 horas a queda de produção celular.
2. Dissecar o animal no centro cirúrgico ou na capa químicos (não na capa da cultura de tecidos).
3. Axilas área é um local conveniente para coletar amostras de pele como a pele das axilas é mais fino, contém menos gordura, ea pele é menos denso. Limpar o local da incisão com etanol 70%. Verifique se o pêlo é embebido com álcool.
4. Raspar os pêlos ao redor do local da incisão com um bisturi afiado. Raspar uma área maior do que o local da incisão desejada. Tentar minimizar cortes na pele. Pulverizar a área com álcool 70% e deixe secar.
5. Para coletar uma amostra de pele especial sobre o consumo de um fragmento de aproximadamente 1 cm ^2. Beliscar a pele com uma pinça, e cortar com tesoura. Tente não cortar a camada de gordura com a pele, como gordura interfere com a digestão da colagenase. Para coletar as amostras de pulmão, lave a área do peito com etanol 70%, e abra a pele do peito com uma tesoura, fazendo uma incisão em forma de T e puxar as abas para além da pele. Lave a área do músculo abriu com etanol 70% e deixe secar. Cortar a caixa torácica com a pinça estéril e tesoura (use cortadores de osso para animais de maior porte). Uso de técnicas estéreis para evitar a contaminação dos órgãos internos. Não toque os órgãos internos com instrumentos que tocou a pele de animal. Cortar fragmentos de pulmão de aproximadamente 1 cm ² usando uma pinça e tesouras estéreis.
6. Fragmentos de tecido lugar em tubos de 50 ml com PBS estéril, para evitar a secagem.
7. Lavar a parte externa do tubos de 50 ml com fragmentos de tecido com etanol, e levá-los para a capa de cultura de tecidos.
8. Devidamente dispor de carcaça animal.

3. Células extrair

1. Transferir os fragmentos de tecido em um prato de 10 centímetros cultura de tecidos utilizando bisturi estéril. Não transferir PBS muito com a amostra.
2. Corte o tecido em pedaços ~ 1 mm com dois bisturis. Use duas lâminas usando uma tesoura ação a partir do centro e afastamento. Manter o tecido enrolado, não corte pedaço por pedaço. Quando o corte é suficiente a pele se assemelha putty, ele não vai separar em pedaços, mas vai esticar fina. O tecido pulmonar é mais fácil de cortar, e ele irá separar-se em pequenos pedaços.
3. Usando um bisturi, transferir o tecido cortado em copo mL estéril 30 com barra de agitação estéril. Lave a placa usada para cortar tecido com 10 mL de DMEM/F12 mídia com 0,14 unidades Wunsch / mL Liberase Blendzyme 3, e 1X antibiótico / antimicótico e adicionar a solução para o copo 30 mL com fragmentos de tecido.
4. Cobrir o copo com papel alumínio estéril e incubar a 37 ° C, mexendo lentamente, por 30 a 90 minutos. A duração da incubação depende do tipo de espécies e tecidos. Tome cuidado para não sobre-digerir o tecido. Melhores rendimentos são obtidos quando fragmentos de tecido ainda estão presentes no final da digestão. Pele demora mais tempo para digerir do que o pulmão. Pele de animais de grande porte leva mais tempo para digerir. Verifique a digestão depois de 30 min, e depois a cada 10 min. Quando a digestão da pele é concluída, a mídia torna-se turva e fragmentos de pele separados uns dos outros, e as bordas das peças tornam-se "fuzzy". Digestão pulmonar deve ser interrompido quando mudam de cor fragmentos de pulmão de vermelho para branco e começar a formar fibras pegajosas.
5. Solução de pipeta contendo o fragmento de tecido para cima e para baixo para quebrar os aglomerados. Transferir a solução para tubo de 50 mL estéril. Se os fragmentos de mover-se facilmente através do corte da pipeta 10 mL e digestão foi bem feito. Lavar o copo 3 vezes com 10 mL de morno DMEM/F12 media com 15% FBS, 1X antibiótico / antimicótico e adicione os meios de comunicação para o tubo de 50 mL com fragmentos de tecido. Fechar o tubo de 50 mL e misturar por inversão várias vezes. A FBS na mídia vai parar a digestão Liberase.
6. Giram em 524 g em uma centrífuga balançando cultura balde do tecido por 5 min. Remover o sobrenadante. Ressuspender o sedimento em 10 mL de morno DMEM/F12 media com 15% FBS, 1X antibiótico / antimicótico. Pipeta com a suspensãoforça máxima para quebrar os pedaços de tecido.
7. Adicionar outro, 30 mL de DMEM/F12 media com 15% FBS, 1X antibiótico / antimicótico mix, e centrifugar a 524 g em uma centrífuga balançando cultura balde do tecido por 5 min. Repita mais uma vez para remover os vestígios do Liberase.
8. Ressuspender o sedimento em 10 mL de DMEM/F12 mídia com FBS 15%, 1X antibiótico / antimicótico e transferir para um prato de 10 centímetros cultura de tecidos e coloque em uma cultura de tecidos incubadora a 37 ° C, 5% CO _2, 3% O ₂ .
9. Verifique as placas todos os dias para fibroblastos e cor media. Se o isolamento foi bem-sucedida, fibroblastos rastejar para fora dos fragmentos de tecido e fixe a placa (Figura 1). Os fibroblastos começam a sair fragmentos de tecido dentro de 2-5 dias.
10. Se a mídia muda de cor para amarelo, indica contaminação em potencial ou a superlotação de celas. Examine as placas sob o microscópio em grandes ampliações. Se as bactérias, fungos ou vermes estão presentes descartar as placas (isso raramente é um problema com animais de laboratório, no entanto pode ocorrer quando as amostras são coletadas na natureza). Se não houver contaminação está presente, mas a mídia mudou de cor, isso é causado por um excesso de células ou fragmentos de tecido demais colocados no mesmo prato. Se mais de 60% da placa é coberta por fibroblastos anexa, alterar a mídia sobre a placa e transferir os fragmentos de tecido para um novo prato com a nova mídia. Se não fibroblastos muitos ligados à placa, alterar a mídia e dividir os pedaços de tecido para um 2-4 pratos.
11. Após 7 dias, se a mídia não tivesse sido alterado anteriormente, alterar a mídia e transferir os fragmentos de tecido para um novo prato com as novas mídias.
12. Incubar as células e fragmentos de tecido para um adicional de 7 dias. Por 14 dias todos os fibroblastos viáveis ​​tenham saído os fragmentos de tecido.
13. Após 14 dias desde o início do isolamento de células, descartar a velha mídia e fragmentos de tecido, a colheita das células e placa-los em um novo prato de 5x10 ⁵ células / EMEM placa com FBS 15%, 1X Penicilina / Estreptomicina, não aminoácidos essenciais , sódio e piruvato. EMEM mídia vai apoiar o crescimento de fibroblastos tipos de células e outros só vai morrer ou parar de proliferar.
14. Depois que as células chegar confluência de 80-90%, congelar uma alíquota de células para utilização futura.
15. Continue cultivando as células, dividindo-os em 5x10 ⁵ células / placa quando as células atingem confluência de 80-90%.

4. Resultados representante

Fibroblastos normais são células grandes com saliências proeminentes (lamellipodia) (Figura 2). Fibroblastos crescer em uma monocamada. Uma cultura saudável e em crescimento contém células 1-10% na fase M, reconhecido como arredondado células elevados sobre a superfície da placa, mas não retirado da placa (Figura 3). Tipicamente, um prato de 10 cm semeados com 5x10 ⁵ células se torna confluente em 3-4 dias. O tempo de duplicação varia muito entre as espécies, e pode ser maior para algumas das espécies de vida longa de roedores ^1. Quando as células encher um prato eles prendem a proliferação na fase G1. Prato típico confluentes de fibroblastos contém uma camada de células hermeticamente embalados (Figura 4). Quando as células atingem confluência de 90% que eles estão prontos para dividir. Se desejado, as células podem ser mantidos em uma placa presa confluentes por longos períodos de tempo com mudanças regulares de mídia (uma ou duas vezes por semana).

Figura 1. Isolamento de fibroblastos da pele do rato (A) e pulmão (B). A mídia foi mudado para remover as células solto e detritos antes de tirar as fotos no dia 7.

Figura 2. Fibroblastos de pulmão de rato.

Figura 3. Um campo de fibroblastos de rato com células em estágios M, fotografadas com ampliação de 10x.

Figura 4. Uma placa confluentes de fibroblastos de rato, fotografadas com ampliação de 10x.

Discussion

Fibroblastos normais primárias oferecem uma excelente alternativa para as linhas de células de câncer estabelecido na pesquisa biológica. Uma vantagem importante de fibroblastos é que eles não carregam mutações em oncogenes e supressores de tumor e manter postos de controle do ciclo celular intacto. Isso faz com que fibroblastos normais de um sistema preferido para os estudos de regulação do ciclo celular, reparo do DNA e apoptose. O protocolo aqui descrito fornece uma receita simples para o isolamento e manutenção de fibroblastos primários. Este protocolo foi utilizado com sucesso para isolar os fibroblastos de mais de 20 espécies de roedores.

É importante manter a esterilidade em todas as vezes quando se trabalha com culturas de células para evitar a contaminação. Se o laboratório também culturas linhas de câncer agressivo de células, como células HeLa, fibroblastos deverão ser tratadas separadamente a partir de células de câncer. É preferível ter um capuz designado e incubadora de culturas primárias.

É preferível manter culturas celulares primárias na concentração de oxigênio fisiológicos de 3%. Atmosférica (20%) de oxigênio reduz expectativa de vida de culturas e aumenta o estresse oxidativo. Fibroblastos de rato são sensíveis ao estresse oxidativo e senesce ou digite crise dentro ~ 14 duplicações população, quando mantida em 20% (atmosférica) de oxigênio. Fibroblastos de rato pode ser mantida indefinidamente, ² 3% de oxigénio.

Sempre manter o registro do número de duplicação da população das culturas. Espécies de grande porte (massa corporal acima de 8.000 g) são propensos a apresentar senescência replicativa, e terá uma duração limitada na cultura, mesmo com 3% de oxigénio ^1. Células a partir de espécies menores, como ratos e camundongos, irão proliferar indefinidamente em 3% de oxigénio, mas pode eventualmente tornar-se aneuplóides. Se possível, começar os experimentos utilizando células, à duplicação populacional.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM/F12 media	Invitrogen	11330-032
Fetal Bovine Serum (FBS), Qualified	Invitrogen	01437-036	The Qualified serum had been pre-tested to provide good growth support for primary fibroblasts.
Antibiotic/Antimycotic	Invitrogen	15420-096
Penicillin/Streptomycin	Invitrogen	15140-122
Liberase TM Research Grade	Roche	05401127001	Replacement enzyme.
A note from the authors: Since Roche discontinued Liberase Blendzyme 3 (11814184001), they recommend using Liberase TM Research Grade medium Thermolysin (Cat. no. 05401119001 - 10 mg, Cat. no. 05401127001 - 100mg) instead. We have switched to this enzyme successfully with no issues.
EMEM media	ATCC	30-203	The EMEM media from ATCC already contains nonessential amino acids and sodium pyruvate.
Feathered #21 disposable, sterile scalpel	Multiple suppliers
Three Gas Control incubator	Forma or Heraeus