El establecimiento de cultivos primarios de fibroblastos de adultos de los roedores

Summary

En este artículo se describe un protocolo para el aislamiento y mantenimiento de cultivos primarios de fibroblastos de la piel y el tejido pulmonar de los roedores salvajes.

Abstract

La importancia del uso de células primarias, en lugar de líneas celulares de cáncer, para estudios biológicos está siendo ampliamente reconocido. Las células primarias son las preferidas en los estudios de control del ciclo celular, la apoptosis y la reparación del ADN, las células cancerosas son portadores de mutaciones en los genes implicados en estos procesos. Las células primarias no pueden ser cultivadas indefinidamente debido a la aparición de la senescencia replicativa o aneuploidization. Por lo tanto, de nuevas culturas es necesario establecer con regularidad. El procedimiento para el aislamiento de los fibroblastos embrionarios de roedores está bien establecido, pero aislando las culturas de fibroblastos adultos a menudo se presenta un desafío. Fibroblastos de roedores adultos aislados de los modelos de ratón de la enfermedad humana puede ser un control preferido cuando se los compara con los fibroblastos procedentes de pacientes humanos. Además, los fibroblastos adultos son el único material disponible cuando se trabaja con roedores salvajes donde las mujeres embarazadas no pueden ser obtenidos fácilmente. Aquí les ofrecemos un protocolo para el aislamiento y cultivo de fibroblastos de la piel de roedores adultos y los pulmones. Hemos utilizado con éxito este procedimiento para aislar los fibroblastos de más de veinte especies de roedores de los ratones y ratas de laboratorio a los roedores salvajes como los castores, puerco espín, y la ardilla.

Protocol

1. Antes de empezar

1. Esterilizar tijeras y pinzas con etanol al 70%.
2. Lugar pequeño agitador magnético dentro de un vaso de precipitados de 30 ml, cubierta con dos capas de papel de aluminio, y autoclave.
3. Prepare un 28 unidades Wunsch / ml de solución stock de Liberase Blendzyme 3 en agua estéril. Hacer alícuotas de 0,5 ml y congelar a -20 ° C. Descongelar una alícuota de nuevo antes de cada uso. La solución puede aparecer turbia después de la descongelación. Vortex la solución hasta que se aclare.
4. Calentar el medio de cultivo celular.

2. Preparación de muestras de animales

Precaución: los animales salvajes pueden contener agentes patógenos tales como virus de la rabia. Que sea siempre consciente de abrir objetos punzantes.

1. Sacrificar al animal y colocar el cadáver a 4 ° C. Lo mejor es utilizar el canal inmediatamente, sin embargo, si esto no es práctico, como si los animales son recogidos en el campo, los canales se pueden utilizar dentro de las 24 horas. Después de 24 horas, la reducciones de los rendimientos de la célula.
2. Diseccionar al animal en la sala de operaciones o en la campana química (no en la campana de cultivo de tejidos).
3. Área debajo del brazo es un sitio conveniente para recoger muestras de piel, como piel de las axilas es más fino, contiene menos grasa y la piel es menos densa. Limpie el sitio de la incisión con un 70% de etanol. Asegúrese de que la piel se empapa con etanol.
4. Afeitarse la piel alrededor del sitio de la incisión con un bisturí. Afeitarse un área más grande que el sitio de la incisión deseada. Trate de minimizar los cortes en la piel. Rocíe el área con el 70% de etanol y dejar secar.
5. Para cobrar una especial muestra de piel de un fragmento de aproximadamente 1 cm ^2. Pellizcar la piel con pinzas de tejido y se corta con tijeras. Trate de no cortar la capa de grasa con la piel, la grasa interfiere con la digestión colagenasa. Para recoger las muestras de pulmón, lave el área del pecho con un 70% de etanol, y abrir la piel en el pecho con unas tijeras, haciendo una incisión en forma de T y separando las aletas de la piel. Lave el área del músculo abrió con un 70% de etanol y dejar secar. Cortar las costillas con las pinzas y tijeras estériles (uso de cortadores de huesos de animales de mayor tamaño). Utilice técnicas de esterilización para evitar la contaminación de los órganos internos. No toque los órganos internos con los instrumentos que tocaba el pelo de los animales. Cortar los fragmentos de pulmón de aproximadamente 1 cm ² utilizando una pinza estéril y tijeras.
6. Fragmentos de tejido en lugar de tubos de 50 ml con PBS estéril para evitar la desecación.
7. Lavar la parte externa de la tubos de 50 ml con fragmentos de tejido con etanol, y los llevan a la capilla de cultivo de tejidos.
8. Como deshacerse de los cadáveres de animales.

3. Extraer células

1. La transferencia de los fragmentos de tejido en una placa de cultivo de 10 cm de tejido utilizando bisturí estéril. No transfiera demasiado PBS con la muestra.
2. Cortar el tejido en trozos de 1 mm ~ con dos escalpelos. Use dos hojas con una acción de tijera a partir del centro y separando. Mantenga la bola con el tejido, no corte pieza por pieza. Cuando el corte es suficiente, la piel se asemeja a la masilla, no se separará en pedazos, pero se estrecha franja. El tejido pulmonar es más fácil de cortar, y se separará en pequeños pedazos.
3. El uso de un bisturí, la transferencia de los tejidos cortados en el vaso estéril de 30 ml con barra de agitación estéril. Lavar la placa utilizada para el corte de tejidos con 10 ml de DMEM/F12 los medios de comunicación, con 0,14 unidades Wunsch / mL Liberase Blendzyme 3, y 1X antibiótico / antimicótico, y la solución en el vaso de 30 mL con fragmentos de tejido.
4. Cubrir el vaso con una lámina estéril, y se incuba a 37 ° C, revolviendo lentamente, durante 30 a 90 minutos. La duración de la incubación depende del tipo de la especie y el tejido. Tenga cuidado de no sobre-digerir el tejido. Mejores rendimientos se obtienen cuando los fragmentos de tejidos están todavía presentes en la final de la digestión. La piel necesita más tiempo para digerir que el pulmón. La piel de animales de gran tamaño tarda más tiempo en digerir. Compruebe la digestión después de 30 minutos, y luego cada 10 min. Cuando la digestión de la piel se haya completado, los medios de comunicación se vuelve turbia y fragmentos de piel separados unos de otros, y los bordes de las piezas se convierten en "confusos". La digestión de pulmón debe ser parado cuando los pulmones cambian de color fragmentos de rojo a blanco y empezar a formar las fibras pegajosas.
5. Pipeta la solución que contiene fragmentos de tejido de arriba abajo para romper los terrones. Transferir la solución a un tubo estéril de 50 ml. Si los fragmentos se mueven fácilmente a través del corte de una pipeta de 10 ml y la digestión se hace bien. Lavar el vaso tres veces con 10 ml de agua tibia DMEM/F12 los medios de comunicación con FBS al 15%, antibiótico / antimicótico 1X y añadir los medios de comunicación en el tubo de 50 ml con fragmentos de tejido. Cierre el tubo de 50 ml y mezclar por inversión varias veces. El FBS en los medios de comunicación se detendrá la digestión Liberase.
6. Giran a 524 g en una centrífuga de la cultura basculante tejido durante 5 min. Eliminar el sobrenadante. Resuspender el precipitado en 10 ml de agua tibia DMEM/F12 los medios de comunicación con FBS al 15%, 1X antibiótico / antimicótico. Pipeta con la suspensiónla máxima fuerza para romper las piezas de tejido.
7. Añadir otro 30 ml de DMEM/F12 los medios de comunicación con FBS al 15%, 1X antibiótico / antimicótico, mezclar y centrifugar a 524 g en una centrífuga de la cultura basculante tejido durante 5 min. Repetir una vez más para eliminar los restos de Liberase.
8. Resuspender el precipitado en 10 ml de DMEM/F12 los medios de comunicación con FBS al 15%, 1X antibiótico / antimicótico y la transferencia a un plato de cultivo de 10 cm de tejido y colocarlo en un cultivo de tejidos incubadora a 37 ° C, 5% de CO _2, el 3% O ₂ .
9. Revise las placas de todos los días para los fibroblastos y el color de los medios de comunicación. Si el aislamiento se ha realizado correctamente, los fibroblastos se arrastran fuera de los fragmentos de tejido y se adhieren a la placa (Figura 1). Los fibroblastos comienzan a salir de fragmentos de tejido dentro de 2-5 días.
10. Si el color de los medios de comunicación cambia a amarillo, lo que indica una posible contaminación o el hacinamiento de las celdas. Examinar las placas bajo el microscopio a gran aumento. Si las bacterias, hongos o parásitos están presentes descartar las placas (esto no suele ser un problema con los animales de laboratorio, sin embargo puede ocurrir cuando las muestras se recogen de la naturaleza). Si no hay contaminación está presente, pero los medios de comunicación cambió de color, esto es causado por muchas células o fragmentos de tejido demasiados colocado en el mismo plato. Si más del 60% de la placa está cubierto por los fibroblastos adjunto, cambie los medios de comunicación en la placa y la transferencia de los fragmentos de tejido para una nueva placa con los nuevos medios. Si no los fibroblastos muchos unido a la placa, cambiar los medios de comunicación y dividir las piezas de tejido a un 2-4 placas.
11. Después de 7 días, si los medios de comunicación no se había modificado anteriormente, el cambio de los medios y la transferencia de los fragmentos de tejido para una nueva placa con los nuevos medios.
12. Se incuban las células y fragmentos de tejido durante 7 días. El día 14 todos los fibroblastos viables han salido los fragmentos de tejido.
13. Después de 14 días desde el inicio de la celda de aislamiento, desechar los viejos medios y fragmentos de tejido, las células de la cosecha y la placa en un plato nuevo en 5x10 ⁵ células / EMEM placa con FBS al 15%, 1X penicilina / estreptomicina, aminoácidos no esenciales y sodio piruvato. Los medios de comunicación EMEM apoyará el crecimiento de los fibroblastos tipos de células y otros sólo se mueren o dejan de proliferar.
14. Después de llegar a las células del 80-90% de confluencia, congelar una parte alícuota de las células para su uso futuro.
15. Continuar cultivando las células de dividir a 5x10 ⁵ células / placa cuando las células alcanzan el 80-90% de confluencia.

4. Resultados representante

Fibroblastos normales son células grandes con protuberancias prominentes (lamellipodia) (Figura 2). Fibroblastos crecen en una monocapa. Una cultura sana de crecimiento contiene células 10.1% en la etapa M, reconocidos como detenidos células elevada sobre la superficie de la placa, pero no separado de la placa (Figura 3). Por lo general, un plato de 10 cm sembrados con 5x10 ⁵ células confluentes se convierte en 3-4 días. El tiempo de duplicación varía mucho entre las especies, y puede ser mayor para algunas de las especies de roedores de larga duración ^1. Cuando las células se llenan de una placa que detener la proliferación en la fase G1. Plato típico confluentes de fibroblastos contiene una capa apretada de las células (Figura 4). Cuando las células llegan al 90% de confluencia que están listos para partir. Si lo desea, las células se pueden mantener en una placa confluente detenidos durante largos períodos de tiempo con cambios regulares de medios (una o dos veces a la semana).

Figura 1. Aislamiento de fibroblastos de piel de ratón (A) y pulmón (B). El medio se cambió para eliminar las células sueltas y escombros antes de tomar las imágenes en el día 7.

Figura 2. Fibroblastos de ratón de pulmón.

Figura 3. Un campo de fibroblastos de ratón con células de M-etapa, fotografiado con un aumento de 10 veces.

Figura 4. Una placa confluente de fibroblastos de ratón, fotografiado con un aumento de 10 veces.

Discussion

Normal de los fibroblastos primarios ofrecen una excelente alternativa para establecer líneas celulares de cáncer en la investigación biológica. Una ventaja importante de los fibroblastos, es que no son portadores de mutaciones en oncogenes y los supresores de tumores y mantener intactos los puestos de control del ciclo celular. Esto hace que los fibroblastos normales de un sistema preferido para los estudios de la regulación del ciclo celular, reparación del ADN y la apoptosis. El protocolo aquí descrito proporciona una sencilla receta para el aislamiento y el mantenimiento de los fibroblastos primarios. Este protocolo se utilizó para aislar con éxito fibroblastos de más de 20 especies de roedores.

Es importante para mantener la esterilidad en todo momento cuando se trabaja con cultivos celulares para evitar la contaminación. Si el laboratorio también las culturas agresivas líneas celulares de cáncer, como las células HeLa, fibroblastos debe ser manejado por separado de las células cancerosas. Es preferible tener una campana de designados y vivero de cultivos primarios.

Es preferible mantener cultivos primarios de células de concentración de oxígeno fisiológicas del 3%. Atmosférica (20%) de oxígeno reduce la vida útil de las culturas y aumenta el estrés oxidativo. Fibroblastos de ratón son sensibles al estrés oxidativo y senescencia o entrar en crisis dentro de unos 14 duplicaciones de la población cuando se mantiene en 20% (la atmósfera) de oxígeno. Fibroblastos de ratón se puede mantener indefinidamente a las ² de oxígeno del 3%.

Siempre mantenga un registro del número de duplicación de la población de las culturas. Especies de gran tamaño (masa corporal superior a 8.000 g) son propensos a exhibir la senescencia replicativa, y tendrá una duración limitada en la cultura, incluso en ^un 3% de oxígeno. Las células de las especies más pequeñas, como los ratones y las ratas, que proliferan de forma indefinida en el 3% de oxígeno, pero con el tiempo pueden llegar a ser aneuploides. Si es posible, comenzar los experimentos con células en duplicación de la población de bajos.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM/F12 media	Invitrogen	11330-032
Fetal Bovine Serum (FBS), Qualified	Invitrogen	01437-036	The Qualified serum had been pre-tested to provide good growth support for primary fibroblasts.
Antibiotic/Antimycotic	Invitrogen	15420-096
Penicillin/Streptomycin	Invitrogen	15140-122
Liberase TM Research Grade	Roche	05401127001	Replacement enzyme.
A note from the authors: Since Roche discontinued Liberase Blendzyme 3 (11814184001), they recommend using Liberase TM Research Grade medium Thermolysin (Cat. no. 05401119001 - 10 mg, Cat. no. 05401127001 - 100mg) instead. We have switched to this enzyme successfully with no issues.
EMEM media	ATCC	30-203	The EMEM media from ATCC already contains nonessential amino acids and sodium pyruvate.
Feathered #21 disposable, sterile scalpel	Multiple suppliers
Three Gas Control incubator	Forma or Heraeus