Gründung Primary Adult Fibroblastenkulturen von Nagetieren

Summary

Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll für die Isolierung und Instandhaltung von Fibroblastenkulturen von Haut-und Lungengewebe von wilden Nagetieren.

Abstract

Die Bedeutung der Verwendung von primären Zellen, anstatt Krebszelllinien, für biologische Studien wird immer weithin anerkannt. Primäre Zellen sind in Studien der Kontrolle des Zellzyklus, Apoptose bevorzugt, und die DNA-Reparatur, wie Krebszellen Mutationen in Genen, die an diesen Prozessen beteiligt sind. Primäre Zellen kann nicht unbegrenzt durch das Einsetzen der replikativen Seneszenz oder aneuploidization kultiviert werden. Daher müssen neue Kulturen regelmäßig ermittelt werden. Das Verfahren zur Isolierung von Nagetier embryonalen Fibroblasten ist gut etabliert, aber isoliert Erwachsenen Fibroblastenkulturen oft eine Herausforderung. Adult Nagetier Fibroblasten aus Mausmodellen menschlicher Erkrankungen isoliert kann eine bevorzugte gesteuert werden, wenn man sie zu Fibroblasten aus menschlichen Patienten. Darüber hinaus sind erwachsene Fibroblasten die einzige verfügbare Material bei der Arbeit mit wilden Nagetieren, wo schwangere Frauen nicht leicht erhalten werden kann. Hier bieten wir ein Protokoll für die Isolierung und Kultivierung von adulten Fibroblasten von Nagern Haut und Lunge. Wir haben dieses Verfahren erfolgreich an Fibroblasten aus über zwanzig Nagetieren isoliert vom Labor Mäusen und Ratten zu wilden Nagetieren wie Biber, Stachelschwein und Eichhörnchen.

Protocol

1. Vor dem Start

1. Sterilisieren Schere und Pinzette mit 70% Ethanol.
2. Legen Sie kleine Magnetrührer in einem 30 mL Becherglas mit zwei Lagen Folie, und Autoklaven zu decken.
3. Bereiten Sie eine 28 Wunsch-Einheiten / ml Stammlösung von Liberase Blendzyme 3 in sterilem Wasser. Machen Sie 0,5 ml und bei -20 ° C. Tauwetter ein neues Aliquot vor jedem Einsatz. Die Lösung kann trübe aussehen nach dem Auftauen. Vortex die Lösung, bis es klar wird.
4. Warm up den Zellkulturmedien.

2. Tierische Probenvorbereitung

Achtung: wilde Tiere können Krankheitserreger enthalten wie eine Tollwut-Virus. Achten Sie immer auf offene spitze oder scharfe Gegenstände.

1. Euthanize das Tier und Ort der Karkasse bei 4 ° C. Es ist am besten auf die Karkasse sofort zu verwenden, aber wenn dies nicht praktikabel ist, wie wenn die Tiere in dem Gebiet sind, können die die Kadaver innerhalb von 24 Stunden verwendet werden. Nach 24 Stunden Zellausbeute abnimmt.
2. Präparieren Sie die Tiere in den OP oder in der chemischen Kapuze (nicht in der Gewebekultur Kapuze).
3. Unterarm-Bereich ist eine praktische Website, um Hautproben sammeln, wie Achsel-Haut ist dünner, enthält weniger Fett und das Fell ist weniger dicht. Reinigen Sie die Inzisionsstelle mit 70% Ethanol. Stellen Sie sicher, das Fell mit Ethanol getränkt wird.
4. Shave das Fell rund um die Inzisionsstelle mit einem scharfen Skalpell. Shave eine größere Fläche als die gewünschte Inzisionsstelle. Versuchen Sie, Schnitte an der Haut zu minimieren. Spray Bereich mit 70% Ethanol und trocknen lassen.
5. Zum Sammeln einer Hautprobe Verbrauchsteuern ein Fragment von ca. 1 cm ^2. Drücken Sie die Haut mit dem Gewebe einer Pinzette und schneiden mit der Schere. Versuchen Sie nicht, die Fettschicht der Haut abgeschnitten, als Fett stört Kollagenaseverdau. Zum Sammeln der Lunge Proben, waschen Sie die Brust mit 70% Ethanol, und öffnen Sie die Haut auf der Brust mit einer Schere, indem sie eine T-Form Schnitt-und Auseinanderziehen der Klappen der Haut. Waschen Sie die geöffneten Muskel-Bereich mit 70% Ethanol und trocknen lassen. Schneiden Sie den Brustkorb mit einer sterilen Pinzette und Schere (Verwendung Knochenfräser für größere Tiere). Verwenden Sie sterile Techniken zur Vermeidung einer Kontamination der inneren Organe. Berühren Sie nicht die inneren Organe mit Instrumenten, die das Tier Fell berührt. Cut Lunge Fragmente von etwa 1 cm ² mit einer sterilen Pinzette und Schere.
6. Legen Sie Gewebestücke in 50 ml-Röhrchen mit sterilem PBS Austrocknen zu verhindern.
7. Waschen Sie die außerhalb der 50-ml-Tuben mit Gewebestücke mit Ethanol, und nehmen sie auf die Gewebekultur Kapuze.
8. Richtig tierischen Kadaver zu entsorgen.

3. Extrahieren Cells

1. Übertragen Sie die Gewebestücke in einen 10 cm Gewebe Kulturschale mit sterilen Skalpell. Übertragen Sie keine zu viel PBS mit der Probe.
2. Schneiden Sie das Gewebe in ~ 1 mm Stücke mit zwei Skalpelle. Verwenden Sie zwei Blätter mit einer Schere Aktion ab der Mitte und Auseinanderziehen. Halten Sie das Gewebe ballte, schneiden nicht Stück für Stück. Wenn das Schneiden genügt die Haut ähnelt Kitt, wird es nicht in Stücke getrennt, aber dehnt dünn. Das Lungengewebe ist leichter zu schneiden, und es wird in kleine Stücke zu trennen.
3. Mit einem Skalpell, Übertragung der Schnitt Gewebe in sterilen 30 ml-Becher mit sterilen Rührstab. Waschen Sie die Platte zum Schneiden von Gewebe mit 10 ml DMEM/F12 Medien mit 0,14 Wunsch Einheiten / ml Liberase Blendzyme 3 und 1X Antibiotikum / Antimykotikum verwendet, und fügen Sie die Lösung für die 30 ml-Becher mit Gewebeteilen.
4. Becher mit sterilen Folie, und bei 37 ° C unter ständigem Rühren langsam, für 30 bis 90 Minuten. Die Länge der Inkubationszeit hängt von der Art und Gewebe. Achten Sie darauf, nicht zu stark zu verdauen das Gewebe. Besten Ausbeuten werden erzielt, wenn Gewebestücke noch am Ende der Verdauung zu präsentieren. Haut braucht mehr Zeit als die Lunge zu verdauen. Haut vor großen Tieren dauert länger zu verdauen. Überprüfen Sie die Verdauung nach 30 min und dann alle 10 min. Wenn die Haut Verdauung abgeschlossen ist, wird das Medium trüb und Haut-Fragmente voneinander getrennt, und die Ränder der Stücke werden "fuzzy". Lung Verdauung sollte gestoppt, wenn Lungen-Fragmente verändern ihre Farbe von rot nach weiß und starten Sie bilden klebrige Fasern.
5. Pipettieren der Lösung, die Gewebestücke nach oben und unten, um die Klumpen zu brechen. Die Lösung wird in sterile 50-ml-Tube. Wenn die Fragmente leicht durch die 10 mL Pipette Schneiden und Verdauung war gut gemacht. Spülen Sie das Becherglas 3 mal mit 10 ml warmes DMEM/F12 Medien mit 15% FBS, 1X Antibiotikum / Antimykotikum und fügen Sie die Medien an die 50 ml Tube mit Gewebeteilen. Schließen Sie die 50 ml Tube und mischen durch Umdrehen ein paar mal. Die FBS in den Medien hört Liberase Verdauung.
6. Spin bei 524 g in einem Ausschwingrotor Gewebekultur Zentrifuge für 5 min. Entfernen Sie den Überstand. Das Pellet in 10 ml warmes DMEM/F12 Medien mit 15% FBS, 1X Antibiotikum / Antimykotikum. Pipettieren der Suspension mitmaximale Kraft auf das Gewebe Stücke brechen.
7. Fügen Sie ein weiteres 30 mL DMEM/F12 Medien mit 15% FBS, 1X Antibiotikum / Antimykotikum, mischen und zentrifugieren bei 524 g in einem Ausschwingrotor Gewebekultur Zentrifuge für 5 min. Wiederholen Sie noch einmal auf die Spuren von Liberase entfernen.
8. Das Pellet in 10 ml DMEM/F12 Medien mit 15% FBS, 1X Antibiotikum / Antimykotikum und in ein 10 cm Gewebe Kulturschale und in einer Gewebekultur-Inkubator bei 37 ° C, 5% CO _2, 3% O ₂ .
9. Prüfen Sie die Platten jeden Tag für Fibroblasten und Medien Farbe. Wenn die Isolierung erfolgreich war, kriechen Fibroblasten aus dem Gewebe Fragmente und heften sich an die Platte (Abbildung 1). Die Fibroblasten beginnen Gewebestücke innerhalb von 2-5 Tagen zu verlassen.
10. Wenn die Medien ändert sich die Farbe zu gelb, deutet dies auf eine mögliche Kontamination oder Überbelegung der Zellen. Untersuchen Sie die Platten unter dem Mikroskop bei starker Vergrößerung. Wenn Bakterien, Pilze oder Würmer vorhanden sind entsorgen Sie die Platten (das ist selten ein Problem mit Labortieren, aber kann auftreten, wenn die Proben aus der Natur gesammelt werden). Wenn keine Kontamination vorhanden ist, aber die Medien die Farbe gewechselt, ist dies entweder zu viele Zellen oder zu viele Gewebestücke in der gleichen Schale gelegt verursacht. Wenn mehr als 60% der Platte durch befestigt Fibroblasten bedeckt ist, ändern Sie die Medien auf der Platte und übertragen Sie die Gewebestücke auf eine neue Platte mit den neuen Medien. Wenn nicht viele Fibroblasten an der Platte befestigt, ändern Sie die Medien und spaltete die Gewebestücke zu einem 2-4 Platten.
11. Nach 7 Tagen, wenn Medien nicht schon früher geändert wurde, ändern Sie die Medien und den Transfer der Gewebestücke auf eine neue Platte mit neuen Medien.
12. Inkubieren Sie die Zellen und Gewebe-Fragmente für weitere 7 Tage. Bis zum Tag 14 alle lebensfähigen Fibroblasten haben die Gewebestücke verlassen.
13. Nach 14 Tagen ab dem Beginn der Zell-Isolierung, entsorgen Sie die alten Medien und Gewebeteile, die Ernte der Zellen und die Platte sie auf eine neue Platte auf 5x10 ⁵ Zellen / Platte EMEM mit 15% FBS, 1X Penicillin / Streptomycin, nicht-essentiellen Aminosäuren und Natriumpyruvat. EMEM Medien unterstützen das Wachstum von Fibroblasten nur und anderen Zelltypen sterben oder aufhören proliferierenden.
14. Nachdem die Zellen 80-90% Konfluenz erreicht, frieren ein Aliquot von Zellen für die zukünftige Verwendung.
15. Weiter Kultivierung der Zellen durch Teilung ihnen bei 5x10 ⁵ Zellen / Platte, wenn die Zellen 80-90% Konfluenz erreichen.

4. Repräsentative Ergebnisse

Normalen Fibroblasten sind große Zellen mit prominenten Vorsprünge (Lamellipodien) (Abbildung 2). Fibroblasten wachsen in einer Monoschicht. Eine gesunde wachsenden Kultur bei 1-10% der Zellen in M-Stadium erkannt, da sich Zellen auf der Oberfläche der Platte erhöhten abgerundet, aber nicht von der Platte (Abbildung 3) abgelöst. Typischerweise wird eine 10 cm Schüssel mit 5x10 ⁵ Zellen ausgesät konfluent in 3-4 Tagen. Die Verdoppelung der Zeit variiert stark zwischen den Arten und größer sein kann für einige der langlebigen Nagetierarten ^1. Wenn die Zellen einen Teller sie verhaften Verbreitung in G1-Phase zu füllen. Typische konfluenten Platte von Fibroblasten enthält einen dicht gepackten Schicht von Zellen (Abbildung 4). Wenn die Zellen 90% Konfluenz erreichen sie bereit sind, für die Spaltung. Falls gewünscht, können die Zellen auf einem verhaftet konfluenten Platte für längere Zeit mit regelmäßigem Medienwechsel (ein-oder zweimal pro Woche) gehalten werden.

Abbildung 1. Fibroblast isoliert von der Haut von Mäusen (A) und der Lunge (B). Die Medien wurde geändert, um ungebundene Zellen und Trümmer zu entfernen, bevor unter den Bildern am Tag 7.

Abbildung 2. Maus Lungenfibroblasten.

Abbildung 3. Ein Feld von Maus-Fibroblasten mit Zellen in M-Phase, bei 10-facher Vergrößerung fotografiert.

Abbildung 4. Eine konfluente Platte von Maus-Fibroblasten, bei 10-facher Vergrößerung fotografiert.

Discussion

Normale primären Fibroblasten bieten eine hervorragende Alternative zu den etablierten Zelllinien in der biologischen Forschung. Ein wichtiger Vorteil von Fibroblasten ist, dass sie nicht tragen Mutationen in Onkogenen und Tumor-Unterdrücker und pflegen intakten Zellzyklus-Kontrollpunkte. Dies macht normalen Fibroblasten eine bevorzugte System für das Studium der Regulation des Zellzyklus, DNA-Reparatur und Apoptose. Die hier beschriebene Protokoll bietet ein einfaches Rezept für die Isolierung und Wartung von primären Fibroblasten. Dieses Protokoll wurde verwendet, um erfolgreich zu isolieren Fibroblasten aus über 20 Arten von Nagetieren.

Es ist wichtig, um die Sterilität zu allen Zeiten zu halten, wenn die Arbeit mit Zellkulturen, um eine Kontamination zu vermeiden. Wenn das Labor auch Kulturen aggressive Krebszelllinien wie HeLa-Zellen, Fibroblasten sollten getrennt von Krebszellen behandelt werden. Es wird bevorzugt an eine bestimmte Kapuze und Inkubator für primäre Kulturen haben.

Es ist besser, primären Zellkulturen bei physiologischen Sauerstoff-Konzentration von 3% zu halten. Atmosphärische (20%) Sauerstoff verkürzt Lebensdauer der Kulturen und den oxidativen Stress. Maus-Fibroblasten sind empfindlich gegenüber oxidativem Stress und senesce oder geben Krise innerhalb ~ 14 Populationsverdopplungen bei 20% (Luft-) Sauerstoff erhalten. Maus-Fibroblasten auf unbestimmte Zeit auf 3% Sauerstoff ² beibehalten werden.

Bewahren Sie Aufzeichnungen über die Anzahl der Verdopplung der Population der Kulturen. Große Arten (body mass über 8.000 g) werden wahrscheinlich replikativen Seneszenz zeigen, und wird eine begrenzte Lebensdauer in Kultur haben, selbst bei 3% Sauerstoff ^1. Zellen aus kleineren Arten, wie Mäuse und Ratten, wird auf unbestimmte Zeit vermehren sich bei 3% Sauerstoff, sondern kann schließlich so aneuploid. Wenn möglich, beginnen die Experimente mit Zellen bei geringer Verdopplung der Population.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM/F12 media	Invitrogen	11330-032
Fetal Bovine Serum (FBS), Qualified	Invitrogen	01437-036	The Qualified serum had been pre-tested to provide good growth support for primary fibroblasts.
Antibiotic/Antimycotic	Invitrogen	15420-096
Penicillin/Streptomycin	Invitrogen	15140-122
Liberase TM Research Grade	Roche	05401127001	Replacement enzyme.
A note from the authors: Since Roche discontinued Liberase Blendzyme 3 (11814184001), they recommend using Liberase TM Research Grade medium Thermolysin (Cat. no. 05401119001 - 10 mg, Cat. no. 05401127001 - 100mg) instead. We have switched to this enzyme successfully with no issues.
EMEM media	ATCC	30-203	The EMEM media from ATCC already contains nonessential amino acids and sodium pyruvate.
Feathered #21 disposable, sterile scalpel	Multiple suppliers
Three Gas Control incubator	Forma or Heraeus