Kemirgenler itibaren İlköğretim Yetişkin Fibroblast Kültürleri kurulması

Summary

Bu makalede, izolasyon ve bakım, cilt ve akciğer dokusunda yaban kemirgenler birincil fibroblast kültürlerinin için bir protokol tanımlamaktadır.

Abstract

Biyolojik çalışmalar için, birincil hücreler, kanser hücre hatları yerine kullanmanın önemi, yaygın olarak kabul haline geliyor. Birincil hücreler, hücre döngüsü kontrolü, apoptozis çalışmaları tercih ve DNA onarımı, kanser hücreleri, bu süreçlere dahil genlerindeki mutasyonlar taşıyan. İlköğretim hücreleri süresiz replikatif yaşlanması veya aneuploidization başlangıcı nedeniyle kültür olamaz. Bu nedenle, yeni kültürler, düzenli bir şekilde kurulması gerekmektedir. Kemirgen embriyonik fibroblastlar izolasyonu için prosedür iyi kurulmuş, ama çoğu zaman bir meydan okuma sunuyor yetişkin fibroblast kültürlerinde izole eder. Insan hastalığı fare modelleri izole Yetişkin kemirgen fibroblastlar, insan hasta fibroblastlar karşılaştırarak tercih edilen bir kontrol olabilir. Ayrıca, hamile kadın kolayca elde edilemez yabani kemirgenler ile çalışırken yetişkin fibroblastlar sadece kullanılabilir bir malzeme. Burada kemirgen cilt ve akciğerlerden yetişkin fibroblastlar izolasyonu ve kültürü için bir protokol sağlar. Bu yordamı Biz yirmi kemirgen türleri üzerinde laboratuvarda fareler ve sıçanlar, kunduz, kirpi, sincap gibi yabani kemirgenler fibroblastlar izole etmek için başarıyla kullanılır.

Protocol

1. Başlamadan Önce

1. % 70 etanol ile makas ve forseps sterilize edin.
2. 30 ml beher içindeki küçük manyetik karıştırıcı yerleştirin, iki folyo katmanlar ve otoklav ile kaplayın.
3. Steril su içinde 28 Wunsch Liberase Blendzyme 3 ünite / mL stok çözelti hazırlayın. -20 ° C'de 0.5 mL alikotları ve donma yapın Her kullanımdan önce yeni bir kısım çözülme. Çözüm çözme sonrası bulanık görünebilir. Vorteksleyin çözüm açık hale gelinceye kadar.
4. Isınma hücre kültür ortamı.

2. Hayvan Numune Hazırlama

Dikkat: vahşi hayvanların kuduz virüsü gibi böyle bir patojenler içerebilir. Her zaman açık kavuz farkında olun.

1. Hayvan Euthanize ve 4 karkas ° C Ancak, hayvanların alanında toplanan sanki bu tür pratik değilse, hemen karkas kullanmak en iyisidir, karkaslar 24 saat içinde kullanılmalıdır. 24 saat sonra hücre verimi azalır.
2. (Doku kültürü kaputu), cerrahi süit ya da kimyasal kaputun içindeki hayvan teşrih.
3. Koltukaltı alan koltuk altı cilt daha ince olduğu gibi, daha az yağ içeren cilt örnekleri toplamak için uygun bir site ve kürk daha az yoğundur. % 70 etanol ile kesi yeri temizleyin. Kürk etanol ile ıslatılmış olduğundan emin olun.
4. Keskin bir bistüri ile kesi sitesi etrafında kürk Tıraş. Istenen kesi yeri daha büyük bir alan Tıraş. Cilt için kesintileri en aza indirmek için deneyin. % 70 etanol ile bölgede Sprey ve kurumaya bırakın.
5. Bir deri örneği tüketim yaklaşık 1 cm ² bir parçasını toplamak için. Doku forseps ile cilt çimdik, ve makasla kesmek. Yağ kollajenaz sindirim müdahale gibi, deri ile yağ tabakası kesmek için deneyin. Akciğer örnekleri toplamak için, göğüs bölgesinde% 70 etanol ile yıkayın ve T şeklinde bir kesi yapmak ve cilt kapakları dışında çekerek makas ile göğüs cilt açmak. Açılan kas alanı% 70 etanol ile yıkayın ve kurumaya bırakın. Steril forseps ve makas (büyük hayvanlar için kemik kesiciler kullanmak) kullanılarak göğüs kafesi kesin. Iç organları kirlenmesini önlemek için steril teknikler kullanın. Hayvan kürk dokundu araçların iç organları dokunmayın. Steril forseps ve makas kullanılarak yaklaşık 1 cm ² akciğer parçaları kesin.
6. Yeri doku parçaları steril PBS ile 50 ml tüpler kurumasını önlemek için.
7. 50 ml tüpler dışında etanol ile doku parçaları ile yıkayın ve doku kültürü kaputu götürün.
8. Düzgün hayvan karkas atmayın.

3. Ayıklanıyor Hücreler

1. Doku parçaları steril neşter kullanılarak 10 cm doku kültürü çanak içine aktarın. Örneği ile çok PBS transferi yapmayın.
2. Iki neşter kullanılarak ~ 1 mm adet doku kesin. Merkezinde başlayan ve çekme dışında bir makas eylemini kullanarak iki ucu kullanın. Parça parça kesmeyin, doku tıkıştırılmış tutun. Kesme cilt macun benzer yeterli olduğunda, parçalar halinde ayrı ama ince germek olacaktır. Akciğer doku kesmek için kolay ve küçük parçalar halinde ayrı olacaktır.
3. Bir neşter kullanarak, steril heyecan çubuğu ile kesilmiş doku steril 30 ml beher içine aktarın. Ile DMEM/F12 medya 10 ml / 0.14 Wunsch birimleri mL Liberase Blendzyme 3 ve 1X antimikotik / antibiyotik doku kesmek için kullanılan plaka yıkayın ve doku parçaları ile 30 ml beher çözüm ekleyin.
4. Steril folyo ile beher Kapak ve 37 ° inkübe ° C, yavaş yavaş karıştırarak, 30 ila 90 dakika. Inkübasyon süresini tür ve doku tipine bağlıdır. Doku üzerinde sindirmek için özen gösterin. Doku parçaları, sindirim sonunda hala mevcut zaman en iyi verimi elde edilir. Cilt, akciğer sindirimi daha uzun sürer. Büyük hayvanların Cilt sindirimi uzun sürer. 30 dakika sonra sindirim, ve sonra her 10 dakikada bir kontrol edin. Cilt sindirim işlemi tamamlandığında, medya bulutlu ve deri parçaları birbirinden ayrı olur ve parçaların kenarlarında "bulanık" hale gelir. Akciğer sindirim kırmızı beyaz ve yapışkan lifleri oluşmaya başlar ve akciğer parçaları renk değiştiren kesilmelidir.
5. Yığınları kırmak için ve doku parçaları aşağı yukarı içeren pipetleyin çözüm. Steril 50 ml tüp çözüm aktarın. Parçaları 10 ml pipet kesme ve sindirim yoluyla kolayca hareket yapıldı. 10 ml% 15 FBS, antimikotik / antibiyotik 1X sıcak DMEM/F12 medya beher 3 kez doku parçaları ile durulayın ve 50 ml tüp medya ekleyebilirsiniz. 50 mL tüp ve inversiyon bir kaç kez karıştırın kapatın. Medya FBS Liberase sindirim duracaktır.
6. 5 dakika için bir sallanan kova doku kültürü santrifüj 524 g dönerler. Süpernatantı. % 15 FBS, 1X antimikotik / antibiyotik ile 10 ml sıcak DMEM/F12 medya pelletini tekrar. Pipetleyin süspansiyon iledoku parçaları kırmak için maksimum kuvvet.
7. % 15 FBS, 1X, 5 dakika için bir sallanan kova doku kültürü santrifüj 524 g / antibiyotik antimikotik, mix ve santrifüj ile DMEM/F12 medya başka bir 30 ml ekleyin. Liberase izlerini kaldırmak için bir kez daha tekrarlayın.
8. Ile DMEM/F12 medya 10 ml% 15 FBS pelletini tekrar 1X antimikotik / antibiyotik ve 37 doku kültürü inkübatör 10 cm doku kültürü çanak ve yeri ° C,% 5 CO ₂ transfer% 3 O ₂ .
9. Plakalar, fibroblastlar ve medya renk için her gün kontrol edin. Izolasyon başarılı olursa, fibroblastlar doku parçaları tarama ve plaka takmak (Şekil 1). Fibroblast, 2-5 gün içinde doku parçaları çıkmak için başlar.
10. Eğer medya sarı renk değiştirir, bu potansiyel kirlenme veya hücrelerin aşırı kalabalık gösterir. Mikroskop altında yüksek büyütmede plakaları inceleyin. , Bakteri, mantar veya solucan mevcut levhalar (Bu laboratuar hayvanları ile nadiren bir konudur, ancak doğadan toplanan numunelerin oluşabilir) iptal edilir. Hiçbir kirlenme mevcut, ancak medya renk değiştirdiyseniz, bu çok fazla hücre veya aynı tabak içinde yerleştirilen çok sayıda doku parçaları ya da neden olmaktadır. % 60 daha fazla plaka takılı fibroblastlar kapsadığı ise, plaka üzerinde ortamı değiştirmek ve yeni medya ile yeni bir plaka doku parçaları aktarmak. Pek çok fibroblastlar plaka bağlı, medya değiştirmek ve 2-4 tabak doku parçaları bölmek.
11. 7 gün sonra, medyada daha önce değiştirilmiş olsaydı, medya değiştirmek ve yeni medya ile yeni bir plaka doku parçaları aktarmak.
12. Hücre ve doku parçaları, ek bir 7 gün süreyle inkübe edin. 14 gün yaşayabilir fibroblastlar doku parçaları çıkmış durumdayız.
13. Hücre izolasyonu başından itibaren 14 gün sonra, eski ortam ve doku parçaları atmak% 15 FBS, 1X Penisilin / Streptomisin, non-esansiyel amino asitleri ile yeni bir plaka üzerinde ^5x10 5 hücre / plaka EMEM hücreleri ve plaka onları hasat ve sodyum piruvat. EMEM medya tek ve diğer hücre türleri ölmeye veya prolifere duracaktır fibroblastların büyümeyi desteklemek.
14. Hücreleri% 80-90 izdiham ulaştıktan sonra, bir kısım hücreler gelecekte kullanmak üzere dondurun.
15. 5x10 ⁵ hücre / plaka bölme onları kültür hücreleri hücrelerinin% 80-90 izdiham ulaştığınızda devam edin.

4. Temsilcisi Sonuçlar

Normal fibroblastlar belirgin çıkıntılar (lamellipodia) (Şekil 2) ile büyük hücrelerdir. Fibroblastlar bir tek tabaka büyür. Sağlıklı büyüyen kültür, plaka yüzey üzerinde yüksek hücreleri yuvarlak, ama plaka (Şekil 3) müstakil tanınan M aşamasında% 1-10 hücreleri, içerir. Tipik olarak, 5x10 ⁵ hücre numaralı seribaşı 10 cm çanak, 3-4 gün içinde konfluent olur . Iki katına zaman türler arasında büyük ölçüde değişir ve bazı uzun ömürlü kemirgen türleri ¹ için daha büyük olabilir. Hücrelerin çoğalması G1 aşamasında tutuklama bir tabak doldurduğunuzda. Fibroblastlar Tipik konfluent plaka hücreleri (Şekil 4) sıkışık bir tabaka içerir. Hücrelerin% 90 izdiham ulaştığınızda yarma için hazır. İsterseniz, hücrelerin düzenli medya değişiklikleri (bir veya iki kez bir hafta) ile uzun süre için tutuklandı konfluent bir plaka üzerinde muhafaza edilebilir.

Şekil 1. Günlük 7 fotoğraf çekmek için önce unattached hücreleri ve enkaz kaldırmak için fare deri (A) ve akciğer (B) Fibroblast izolasyon medya değiştirildi.

Şekil 2. Fare akciğer fibroblastlar.

Şekil 3. 10X büyütme fotoğrafı fare fibroblastların M-aşamada hücre içeren bir alan.

Şekil 4. 10X büyütmede fotoğraflandı fare fibroblastlar konfluent plaka.

Discussion

Normal birincil fibroblastlar, biyolojik araştırmalar yılında kurulan kanser hücre hatları için mükemmel bir alternatif sağlar. Fibroblastların önemli bir avantajı, onkogenler ve tümör bastırıcılarının mutasyonlar taşımak ve sağlam hücre döngüsü kontrol noktaları korumak olduğunu. Bu normal fibroblastlar, hücre döngüsü kontrolü, DNA onarımı ve apoptozis çalışmaları için tercih edilen bir sistem yapar. Burada açıklanan protokol birincil fibroblastlar izolasyon ve bakımı için basit bir reçete sunar. Bu protokol, 20 tür kemirgen başarılı fibroblastlar izole etmek için kullanılmıştır.

Kontaminasyonu önlemek için hücre kültürleri ile çalışırken her zaman kısırlık korumak için önemlidir. Eğer laboratuvarda aynı zamanda kültürler HeLa hücrelerinde gibi agresif kanser hücresi hatlarında, fibroblastlar kanser hücreleri ayrı ayrı ele alınması gerekir. Birincil kültürler için bir kaput ve inkübatör için tercih edilir.

Bu fizyolojik oksijen konsantrasyonu% 3 primer hücre kültürleri korumak için tercih edilir. Atmosferik (% 20) oksijen, ömrünü kültürler ve artar oksidatif stres kısaltır. Fare fibroblastlar oksidatif strese karşı duyarlıdır ve% 20 (atmosfer) oksijen bakımı yapıldığında ~ 14 nüfus çiftlenmeler içinde kriz senesce ya da girecek. Fare fibroblastlar% 3 oksijen ² süresiz olarak muhafaza edilebilir.

Her zaman kültürlerin nüfus iki katına sayısının kaydını tutmak. Büyük türlerinin (8.000 g üzerinde vücut kitle) replikatif yaşlanması sergilemek olasıdır ve hatta% 3 oksijen ^1, kültür sınırlı bir ömre sahip. Örneğin, fare ve sıçan gibi küçük türlerin, hücreleri% 3 oksijen süresiz çoğalacak, ama sonunda anöploid olabilir. Eğer mümkünse, düşük nüfus iki katına hücreleri kullanarak deneyler başlar.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM/F12 media	Invitrogen	11330-032
Fetal Bovine Serum (FBS), Qualified	Invitrogen	01437-036	The Qualified serum had been pre-tested to provide good growth support for primary fibroblasts.
Antibiotic/Antimycotic	Invitrogen	15420-096
Penicillin/Streptomycin	Invitrogen	15140-122
Liberase TM Research Grade	Roche	05401127001	Replacement enzyme.
A note from the authors: Since Roche discontinued Liberase Blendzyme 3 (11814184001), they recommend using Liberase TM Research Grade medium Thermolysin (Cat. no. 05401119001 - 10 mg, Cat. no. 05401127001 - 100mg) instead. We have switched to this enzyme successfully with no issues.
EMEM media	ATCC	30-203	The EMEM media from ATCC already contains nonessential amino acids and sodium pyruvate.
Feathered #21 disposable, sterile scalpel	Multiple suppliers
Three Gas Control incubator	Forma or Heraeus