Tot vaststelling van primaire Adult Fibroblast Culturen van knaagdieren

Summary

Dit artikel beschrijft een protocol voor de isolatie en het onderhoud van de primaire fibroblast culturen van de huid en longweefsel van wilde knaagdieren.

Abstract

Het belang van het gebruik van primaire cellen, in plaats van kanker cellijnen, voor biologisch onderzoek wordt steeds alom erkend. Primaire cellen hebben de voorkeur in studies van de controle van de celcyclus, apoptose, en DNA-herstel, zoals kankercellen te voeren mutaties in genen die betrokken zijn bij deze processen. Primaire cellen kunnen niet voor onbepaalde tijd als gevolg van het ontstaan ​​van replicatieve veroudering of aneuploidization worden gekweekt. Vandaar, nieuwe culturen moeten regelmatig worden vastgesteld. De procedure voor het isoleren van embryonale fibroblasten knaagdier is goed ingeburgerd, maar het isoleren van volwassen fibroblast culturen vaak een uitdaging. Volwassen knaagdieren fibroblasten geïsoleerd van muismodellen van de menselijke ziekte kan een voorkeur controle zijn wanneer ze te vergelijken met fibroblasten van menselijke patiënten. Bovendien, volwassen fibroblasten zijn de enige beschikbare materiaal bij het werken met wilde knaagdieren, waar zwangere vrouwen niet gemakkelijk kan worden verkregen. Hier hebben we een protocol voor het kweken van volwassen fibroblasten uit knaagdier huid en longen. We gebruikten deze procedure met succes te fibroblasten isoleren van meer dan twintig soorten knaagdieren van laboratorium muizen en ratten aan wilde knaagdieren zoals bever, stekelvarken, en eekhoorn.

Protocol

1. Voordat u begint

1. Steriliseren schaar en pincet met 70% ethanol.
2. Plaats kleine magneetroerder in een 30 ml beker, deksel met twee lagen folie en autoclaaf.
3. Bereid een 28 Wunsch eenheden / ml stockoplossing van Liberase Blendzyme 3 in steriel water. Maak 0,5 ml porties en invriezen bij -20 ° C. Dooi een nieuwe hoeveelheid voor elk gebruik. De oplossing kan verschijnen bewolkt na het ontdooien. Vortex de oplossing totdat duidelijk wordt.
4. Warming-up van de cel cultuur media.

2. Dier Monstervoorbereiding

Let op: wilde dieren kunnen ziekteverwekkers bevatten, zoals een hondsdolheid virus. Altijd bewust zijn van scherpe voorwerpen te openen.

1. Euthanaseren het dier en de plaats van het karkas bij 4 ° C. Het beste is om het karkas direct gebruiken echter, wanneer dit niet praktisch is, zoals wanneer de dieren worden verzameld in het veld, kan de karkassen worden gebruikt binnen 24 uur. Na 24 uur de cel opbrengst daalt.
2. Ontleden het dier in de chirurgische suite of in de chemische kap (niet in weefselkweek kap).
3. Oksels gebied is een handige site om de huid monsters te verzamelen als oksels huid is dunner, bevat minder vet, en de vacht wordt minder dicht. Reinig de incisie site met 70% ethanol. Zorg ervoor dat de vacht is doordrenkt met ethanol.
4. Scheren de vacht rondom de incisie site met een scherp scalpel. Shave een groter gebied dan de gewenste incisie site. Probeer te bezuinigingen op de huid te minimaliseren. Spray het gebied met 70% ethanol en laat het drogen.
5. Om een skin monster accijnzen te verzamelen een fragment van ongeveer 1 cm ^2. Knijp de huid met weefsel tang, en snijd met een schaar. Probeer niet om de vetlaag gesneden met de huid, als vet interfereert met collagenase spijsvertering. Voor het verzamelen van de longen monsters, was de borst met 70% ethanol, en open de huid op de borst met een schaar door het maken van een T-vormige incisie en trekken elkaar de flappen van de huid. Was de geopende spier gebied met 70% ethanol en laat drogen. Knip de ribbenkast met steriele pincet en een schaar (gebruik bot kotters voor grotere dieren). Gebruik steriele technieken om te voorkomen dat vervuilende interne organen. Raak de inwendige organen met instrumenten die de vacht van dieren aangeraakt. Snijd long fragmenten van ongeveer 1 cm ² met behulp van steriele pincet en een schaar.
6. Plaats weefselfragmenten in 50 ml buizen met steriel PBS om uitdrogen te voorkomen.
7. Was de buitenkant van de 50 ml buizen met tissue fragmenten met ethanol, en breng ze naar de weefselkweek kap.
8. Gooi van dierlijke karkas.

3. Extraheren Cellen

1. Breng de weefsel fragmenten in een 10 cm schotel met behulp van weefselkweek steriel scalpel. Niet overdragen teveel PBS met het monster.
2. Snijd de weefsel in ~ 1 mm stukken met behulp van twee scalpels. Gebruik twee bladen met behulp van een schaar actie begint bij het centrum en trekken elkaar. Houd het weefsel gebald omhoog, niet stuk gesneden door stuk. Wanneer het snijden voldoende is de huid lijkt op stopverf, zal het niet te splitsen in stukken, maar zal strekken dun. Het longweefsel is makkelijker te snijden, en het zal apart in kleine stukjes.
3. Met behulp van een scalpel, de overdracht van de gesneden weefsel in steriele 30 ml bekerglas met steriele roer bar. Was de plaat wordt gebruikt voor het snijden van weefsel met 10 ml DMEM/F12 media met 0,14 Wunsch eenheden / ml Liberase Blendzyme 3, en 1x antibiotica / antimycotica, en voeg de oplossing voor de 30 ml bekerglas met weefsel fragmenten.
4. Dek het bekerglas af met steriele folie, en incuberen bij 37 ° C, al roerend langzaam, gedurende 30 tot 90 minuten. De lengte van de incubatietijd is afhankelijk van de soort en weefseltype. Zorg ervoor dat u over-verteren het weefsel. De beste rendementen worden verkregen wanneer weefselfragmenten zijn nog steeds aanwezig aan het eind van de spijsvertering. Huid langer duurt om te verteren dan de long. Huid van grote dieren langer duurt om te verteren. Controleer de spijsvertering na 30 min, en daarna elke 10 minuten. Wanneer de huid spijsvertering is voltooid, de media troebel en de huid fragmenten van elkaar te scheiden, en de randen van de stukken worden "fuzzy". Long spijsvertering moet worden gestopt wanneer long fragmenten van kleur veranderen van rood naar wit en begin vormen van plakkerige vezels.
5. Pipet de oplossing die weefsel fragmenten op en neer om de klonten te breken. Breng de oplossing om steriele 50 ml buis. Als de fragmenten bewegen makkelijk door de 10 mL pipet te snijden en de spijsvertering is goed gedaan. Spoel de beker drie keer met 10 ml warm DMEM/F12 media met 15% FBS, 1X antibiotica / antimycotica en voeg de media om de 50 ml buis met weefsel fragmenten. Sluit de 50 ml buis en meng door inversie een paar keer. De FBS in de media zal stoppen Liberase spijsvertering.
6. Draaien op 524 g in een swingende emmer weefselkweek centrifuge gedurende 5 minuten. Verwijder het supernatant. Resuspendeer de pellet in 10 ml warm DMEM/F12 media met 15% FBS, 1X antibiotische / antimycotische. Pipet de suspensie metmaximale kracht om het weefsel stukken breken.
7. Voeg nog eens 30 ml DMEM/F12 media met 15% FBS, 1X antibiotica / antimycotica, mix en centrifugeer bij 524 g in een swingende emmer weefselkweek centrifuge gedurende 5 minuten. Herhaal dit nog een keer om de sporen van Liberase te verwijderen.
8. Resuspendeer de pellet in 10 ml DMEM/F12 media met 15% FBS, 1X antibiotica / antimycotica en over te dragen aan een 10 cm weefselkweek schotel en plaats in een weefselkweek incubator bij 37 ° C, 5% CO _2, 3% O ₂ .
9. Controleer of de platen elke dag voor fibroblasten en media kleur. Als de isolatie is gelukt, fibroblasten kruipen van het weefsel fragmenten en hechten aan de plaat (figuur 1). De fibroblasten beginnen met weefsel fragmenten af ​​te sluiten binnen 2-5 dagen.
10. Als de media van kleur verandert naar geel, geeft dit aan mogelijke verontreiniging of de overbevolking van de cellen. Onderzoek de platen onder de microscoop bij een hoge vergrotingsfactor. Als bacteriën, schimmels of wormen aanwezig zijn gooi de platen (dit is zelden een probleem met proefdieren, maar kan optreden wanneer de monsters worden genomen uit het wild). Als er geen verontreiniging aanwezig is, maar de media van kleur veranderd, wordt dit veroorzaakt door een te veel cellen of weefsel te veel fragmenten in dezelfde schotel. Als meer dan 60% van de plaat is bedekt met aangesloten fibroblasten, wijzigt u de media op de plaat en breng het weefsel fragmenten naar een nieuwe plaat met de nieuwe media. Als niet veel fibroblasten aan de plaat, verander de media en de splitsing van de stukjes weefsel een 2-4 platen.
11. Na 7 dagen, als de media niet was eerder veranderd, veranderen de media en overdracht van het weefsel fragmenten naar een nieuwe plaat met nieuwe media.
12. Incubeer de cellen en weefsels fragmenten voor een extra 7 dagen. Op dag 14 alle levensvatbare fibroblasten hebben verlaten het weefsel fragmenten.
13. Na 14 dagen vanaf het begin van de cel isolatie, gooi de oude media en weefsel fragmenten, de oogst van de cellen en de plaat ze op een nieuwe plaat op 5x10 ⁵ cellen / plaat EMEM met 15% FBS, 1X penicilline / streptomycine, niet-essentiële aminozuren , en natrium pyruvaat. EMEM media zal ondersteuning van de groei van fibroblasten alleen en andere celtypes zullen sterven of stoppen prolifererende.
14. Nadat de cellen te bereiken 80-90% confluentie, te bevriezen een hoeveelheid van cellen voor toekomstig gebruik.
15. Ga door het kweken van de cellen door ze te splitsen in 5x10 ⁵ cellen / plaat wanneer de cellen bereikt 80-90% confluentie.

4. Representatieve resultaten

Normale fibroblasten zijn grote cellen met prominente uitsteeksels (lamellipodia) (figuur 2). Fibroblasten groeien in een monolaag. Een gezonde groeiende cultuur bevat 1-10% cellen in M ​​stadium, erkend als afgerond cellen verhoogd over het oppervlak van de plaat, maar niet los van de plaat (figuur 3). Typisch, een 10 cm schotel gezaaid met 5x10 ⁵ cellen wordt confluent in 3-4 dagen. De verdubbelingstijd verschilt sterk tussen soorten, en groter kan zijn voor een deel van de langlevende knaagdieren ^1. Wanneer cellen een bord ze proliferatie arrestatie in G1-fase te vullen. Typische samenvloeiing plaat van fibroblasten bevat een dicht opeengepakte laag van cellen (figuur 4). Wanneer de cellen 90% confluentie bereiken ze klaar zijn voor splitsing. Indien gewenst, kunnen de cellen worden gehandhaafd op een aangehouden samenvloeiing plaat voor langere tijd met de reguliere media veranderingen (of twee keer per week).

Figuur 1. Fibroblast isolatie van de huid van muizen (A) en longen (B). De media werd veranderd verwijderen voordat losse cellen en puin aan het nemen van de foto's op dag 7.

Figuur 2. Muis longfibroblasten.

Figuur 3. Een veld van muis fibroblasten met cellen in de M-fase, gefotografeerd bij 10X vergroting.

Figuur 4. Een samenvloeiing plaat van muizen fibroblasten, gefotografeerd bij 10X vergroting.

Discussion

Normale primaire fibroblasten bieden een uitstekend alternatief voor gevestigde kanker cellijnen in biologisch onderzoek. Een belangrijk voordeel van fibroblasten is dat ze niet te voeren mutaties in oncogenen en tumor onderdrukkers en onderhouden van intacte cel-cyclus controleposten. Dit maakt normale fibroblasten een voorkeur voor de studies van de celcyclus, DNA reparatie, en apoptose. De hier beschreven protocol voorziet in een eenvoudig recept voor de isolatie en het onderhoud van de primaire fibroblasten. Dit protocol werd gebruikt om met succes fibroblasten isoleren van meer dan 20 soorten knaagdieren.

Het is belangrijk om de steriliteit te behouden ten alle tijden bij het werken met celculturen om besmetting te voorkomen. Als het laboratorium ook culturen agressieve kanker cellijnen zoals HeLa cellen, fibroblasten moeten apart behandeld worden van de kankercellen. Het verdient de voorkeur om een ​​aangewezen kap en incubator voor de primaire culturen.

Het is beter om primaire celculturen te handhaven op fysiologische zuurstofconcentratie van 3%. Atmosferische (20%) zuurstof verkort levensduur van culturen en verhoogt de oxidatieve stress. Muis fibroblasten zijn gevoelig voor oxidatieve stress en zal senesce of voer crisis binnen ~ 14 bevolking verdubbelingen bij gehandhaafd op 20% (atmosferische) zuurstof. Muis fibroblasten onbeperkt kan worden gehandhaafd op 3% zuurstof ^2.

Altijd record van het aantal van de bevolking verdubbeling van de culturen. Grote soorten (body massa boven 8.000 g) zijn waarschijnlijk replicatieve senescentie exposeren, en zal een beperkte levensduur hebben in cultuur, zelfs bij 3% zuurstof ^1. Cellen van kleinere soorten, zoals muizen en ratten, zal voor onbepaalde tijd woekeren op 3% zuurstof, maar kan uiteindelijk aneuploïde. Indien mogelijk, gaan de experimenten met cellen bij lage populatieverdubbelingstijd.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM/F12 media	Invitrogen	11330-032
Fetal Bovine Serum (FBS), Qualified	Invitrogen	01437-036	The Qualified serum had been pre-tested to provide good growth support for primary fibroblasts.
Antibiotic/Antimycotic	Invitrogen	15420-096
Penicillin/Streptomycin	Invitrogen	15140-122
Liberase TM Research Grade	Roche	05401127001	Replacement enzyme.
A note from the authors: Since Roche discontinued Liberase Blendzyme 3 (11814184001), they recommend using Liberase TM Research Grade medium Thermolysin (Cat. no. 05401119001 - 10 mg, Cat. no. 05401127001 - 100mg) instead. We have switched to this enzyme successfully with no issues.
EMEM media	ATCC	30-203	The EMEM media from ATCC already contains nonessential amino acids and sodium pyruvate.
Feathered #21 disposable, sterile scalpel	Multiple suppliers
Three Gas Control incubator	Forma or Heraeus