Établir des cultures primaires de fibroblastes adultes à partir de rongeurs

Summary

Cet article décrit un protocole pour l'isolement et l'entretien des cultures de fibroblastes primaires de la peau et les tissus pulmonaires de rongeurs sauvages.

Abstract

L'importance de l'utilisation de cellules primaires, plutôt que de lignées cellulaires de cancer, pour des études biologiques est de plus largement reconnu. Les cellules primaires sont préférés dans les études sur le contrôle du cycle cellulaire, l'apoptose, et la réparation de l'ADN, les cellules cancéreuses sont porteurs de mutations dans les gènes impliqués dans ces processus. Les cellules primaires ne peuvent pas être cultivées indéfiniment en raison de l'apparition de la sénescence réplicative ou aneuploidization. Ainsi, de nouvelles cultures doivent être établis régulièrement. La procédure d'isolement de fibroblastes embryonnaires de rongeurs bien établie, mais d'isoler des cultures de fibroblastes adultes représente souvent un défi. Fibroblastes de rongeurs adultes isolés de modèles murins de maladies humaines peut être un contrôle préféré quand on les compare à des fibroblastes provenant de patients humains. Par ailleurs, les fibroblastes adultes sont les seuls matériaux disponibles lorsque vous travaillez avec des rongeurs sauvages où les femmes enceintes ne peuvent pas être obtenus facilement. Ici nous fournissons un protocole pour l'isolement et la culture de fibroblastes adultes de la peau des rongeurs et des poumons. Nous avons utilisé cette procédure avec succès pour isoler les fibroblastes de plus de vingt espèces de rongeurs à partir des souris de laboratoire et des rats à des rongeurs sauvages tels que le castor, le porc-épic et l'écureuil.

Protocol

1. Avant de partir

1. Stériliser des ciseaux et des pinces à l'éthanol 70%.
2. Placer les petits agitateur magnétique dans un bécher 30 mL, couvrir avec deux couches de papier d'aluminium, et autoclave.
3. Préparer un 28 unités Wunsch / ml de solution stock Libérase Blendzyme 3 dans l'eau stérile. Faire aliquotes de 0,5 ml et congeler à -20 ° C. Dégeler une aliquote de nouvelles avant chaque utilisation. La solution peut paraître nuageux après décongélation. Vortex la solution jusqu'à ce qu'elle devienne claire.
4. Réchauffez les milieux de culture cellulaire.

2. Préparation des échantillons d'animaux

Attention: les animaux sauvages peuvent contenir des agents pathogènes tels que virus de la rage. Soyez toujours conscient de dièses ouverte.

1. Euthanasier l'animal et le lieu de la carcasse à 4 ° C. Il est préférable d'utiliser la carcasse immédiatement, toutefois, si cela n'est pas pratique, comme si les animaux sont recueillies sur le terrain, les carcasses peuvent être utilisés dans les 24 heures. Après 24 heures, les baisses de rendement des cellules.
2. Disséquer l'animal dans le bloc opératoire ou dans hotte chimique (et non dans la hotte de culture de tissus).
3. Aisselles zone est un site pratique pour recueillir des échantillons de peau comme la peau des aisselles est plus mince, contient moins de gras, et la fourrure est moins dense. Nettoyez le site d'incision avec de l'éthanol à 70%. Assurez-vous que la fourrure est imbibé d'éthanol.
4. Rasez les poils autour du site d'incision avec un scalpel tranchant. Rasage une zone plus vaste que le site d'incision désirée. Essayez de minimiser les coupures de la peau. Vaporiser la zone avec 70% d'éthanol et laisser sécher.
5. Pour recueillir un échantillon de peau d'accise d'un fragment d'environ 1 cm ^2. Pincer la peau avec une pince de tissu et couper avec des ciseaux. Essayez de ne pas couper la couche de graisse avec la peau, sous forme de graisse interfère avec la digestion par la collagénase. Pour recueillir les échantillons pulmonaires, lavez la région de la poitrine avec de l'éthanol à 70%, et ouvert la peau sur la poitrine avec des ciseaux en faisant une incision en forme de T et en tirant en dehors des volets de la peau. Laver la zone musculaire ouvert avec 70% d'éthanol et laisser sécher. Couper la cage thoracique à l'aide des pinces stériles et les ciseaux (utilisation tailleurs d'os pour les gros animaux). Utiliser des techniques stériles pour éviter de contaminer les organes internes. Ne pas toucher les organes internes avec des instruments qui a touché la fourrure animale. Coupez les fragments pulmonaires d'environ 1 cm ^{2 à l'aide} des pinces stériles et des ciseaux.
6. Fragments de tissus place dans des tubes de 50 ml avec du PBS stérile pour éviter le dessèchement.
7. Laver l'extérieur de l'tubes de 50 ml avec des fragments de tissu avec de l'éthanol, et les prendre à la hotte de culture de tissus.
8. Débarrassez-vous correctement des carcasses d'animaux.

3. Cellules Extraction

1. Transfert des fragments de tissu dans un plat de 10 cm de culture de tissu à l'aide scalpel stérile. Ne transférez pas trop de PBS avec l'échantillon.
2. Coupez le tissu dans ~ 1 mm en utilisant deux morceaux scalpels. Utilisez deux lames de ciseaux en utilisant une action à partir du centre et en tirant à part. Gardez le tissu en boule, ne pas couper morceau par morceau. Quand la coupe est suffisamment la peau ressemble à du mastic, il ne sera pas séparée en morceaux, mais s'étendra mince. Le tissu pulmonaire est plus facile à couper, et il va séparer en petits morceaux.
3. Avec un scalpel, le transfert du tissu découpé en 30 stériles bécher mL avec un barreau d'agitation stérile. Laver la plaque utilisée pour la découpe de tissus avec 10 ml de DMEM/F12 des médias avec les unités Wunsch 0,14 / mL Libérase Blendzyme 3, et 1X antibiotique / antimycotique, et ajouter la solution dans le bécher de 30 mL avec des fragments de tissus.
4. Couvrir le bécher avec du papier stérile, et incuber à 37 ° C, en remuant doucement, pendant 30 à 90 minutes. La longueur de l'incubation dépend du type d'espèces et de tissus. Prenez soin de ne pas trop digérer les tissus. Meilleurs rendements sont obtenus lorsque des fragments de tissus sont encore présentes à la fin de la digestion. Peau prend plus de temps à digérer que le poumon. Peau d'animaux de grande taille prend plus de temps à digérer. Vérifiez la digestion après 30 minutes, puis toutes les 10 min. Lorsque la digestion est terminée la peau, les médias devient trouble et de fragments de peau séparés les uns des autres, et les bords des morceaux devenus "flou". La digestion du poumon doit être arrêté lorsque la couleur change pulmonaires fragments du rouge au blanc et commencer à former des fibres collante.
5. Pipeter la solution contenant des fragments de tissus et pour briser les mottes. Transférer la solution dans le tube de 50 ml stérile. Si les fragments se déplacer facilement à travers la coupe 10 ml pipette et la digestion a été bien fait. Rincer le bécher 3 fois avec 10 ml d'eau tiède DMEM/F12 médias avec 15% de FBS, 1X antibiotique / antimycotique et ajouter le support sur le tube de 50 ml avec des fragments de tissus. Fermer le tube de 50 ml et mélanger par inversion à quelques reprises. Le FBS dans les médias cesseront de digestion Libérase.
6. Centrifuger à 524 g dans une centrifugeuse de culture tissulaire seau balancer pendant 5 min. Enlever le surnageant. Reprendre le culot dans 10 ml d'eau tiède DMEM/F12 médias avec 15% de FBS, 1X antibiotique / antimycotique. Pipet la suspension avecforce maximale pour briser les morceaux de tissu.
7. Ajouter un autre de 30 ml de DMEM/F12 médias avec 15% de FBS, 1X antibiotique / antimycotique, mélanger et centrifuger à 524 g dans une centrifugeuse de culture tissulaire seau balancer pendant 5 min. Répéter une fois de plus pour éliminer les traces d'Libérase.
8. Reprendre le culot dans 10 ml de DMEM/F12 médias avec 15% de FBS, 1X antibiotique / antimycotique et transférer dans un plat de 10 cm de culture de tissu et placer dans un incubateur de culture tissulaire à 37 ° C, 5% de CO _2, 3% O ₂ .
9. Vérifiez les plaques tous les jours pour les fibroblastes et la couleur des médias. Si l'isolement a été un succès, les fibroblastes ramper hors des fragments de tissu et attacher à la plaque (figure 1). Les fibroblastes commencent à quitter les fragments de tissus dans les 2-5 jours.
10. Si les changements de supports de la couleur au jaune, cela indique une contamination potentielle ou le surpeuplement des cellules. Examiner les plaques sous la loupe à fort grossissement. Si les bactéries, les champignons ou les vers sont présents jeter les plaques (ce qui est rarement un problème avec les animaux de laboratoire, mais peut se produire lorsque les échantillons sont prélevés dans la nature). Si aucune contamination est présente, mais les médias ont changé de couleur, cela est causé soit par trop de cellules ou de fragments de tissus trop nombreux placés dans le même plat. Si plus de 60% de la plaque est recouverte par les fibroblastes joint, changer le support sur la plaque et le transfert des fragments de tissu d'une nouvelle plaque avec les nouveaux médias. Si ce n'est pas fibroblastes de nombreux attaché à la plaque, le changement des médias et de diviser les morceaux de tissu à un 2-4 plaques.
11. Après 7 jours, si les médias n'avaient pas été changés plus tôt, changer le support et le transfert des fragments de tissu d'une nouvelle plaque avec les nouveaux médias.
12. Incuber les cellules et de fragments de tissus pour 7 jours supplémentaires. Par tous les jours 14 fibroblastes viables ont quitté les fragments de tissus.
13. Après 14 jours depuis le début de l'isolement cellulaire, jeter le vieux médias et des fragments de tissus, la récolte des cellules et la plaque entre eux sur une nouvelle plaque à 5x10 ⁵ cellules / plaque avec EMEM FBS 15%, 1X pénicilline / streptomycine, acides aminés non essentiels , et de sodium pyruvate. Les médias EMEM viendra soutenir la croissance des fibroblastes types de cellules et d'autres ne vont mourir ou d'arrêter la prolifération.
14. Après que les cellules atteignent 80-90% de confluence, de geler une partie aliquote de cellules pour une utilisation future.
15. Poursuivre la culture des cellules en les découpant à 5x10 ⁵ cellules / plaque lorsque les cellules atteignent 80-90% de confluence.

4. Les résultats représentatifs

Fibroblastes normaux sont de grosses cellules avec des protubérances de premier plan (lamellipodes) (figure 2). Fibroblastes poussent en monocouche. Une culture de croissance sain contient des cellules 1-10% dans la phase M, reconnu comme arrondi cellules élevées sur la surface de la plaque, mais pas détaché de la plaque (figure 3). Typiquement, un plat de 10 cm ensemencé avec 5x10 ⁵ cellules confluentes devient en 3-4 jours. Le temps de doublement varie considérablement entre les espèces, et peut être plus élevé pour certaines des espèces de rongeurs à long terme ^1. Lorsque les cellules de remplir une plaque qu'ils arrêtent la prolifération en phase G1. Plaque d'confluent de fibroblastes contient une couche de cellules serrées (figure 4). Lorsque les cellules atteignent la confluence de 90% qu'ils sont prêts pour le fractionnement. Si désiré, les cellules peuvent être maintenues sur une plaque arrêtés confluentes pendant de longues périodes de temps avec les changements de supports réguliers (une ou deux fois par semaine).

Figure 1. L'isolement des fibroblastes de peau de souris (A) et du poumon (B). Les médias a été changé pour éliminer les cellules seules et les débris avant de prendre les photos au jour 7.

Figure 2. Fibroblastes pulmonaires de la souris.

Figure 3. Un champ de fibroblastes de souris contenant des cellules en M-scène, photographiée à un grossissement de 10X.

Figure 4. Une plaque confluent de fibroblastes de souris, photographiées à un grossissement de 10X.

Discussion

Normale fibroblastes primaires fournissent une excellente alternative aux établie lignées cellulaires de cancer dans la recherche biologique. Un avantage important des fibroblastes est qu'ils ne portent des mutations dans les oncogènes et suppresseurs de tumeur et de maintenir intactes les points de contrôle du cycle cellulaire. Cela rend les fibroblastes normaux d'un système privilégié pour les études de la régulation du cycle cellulaire, la réparation de l'ADN, et l'apoptose. Le protocole décrit ici fournit une recette simple pour l'isolement et l'entretien des fibroblastes primaires. Ce protocole a été utilisé avec succès pour isoler les fibroblastes provenant de plus de 20 espèces de rongeurs.

Il est important de maintenir la stérilité, à tout moment lorsque vous travaillez avec des cultures de cellules pour éviter toute contamination. Si le laboratoire a aussi agressive des cultures de lignées cellulaires du cancer tels que les cellules HeLa, les fibroblastes doivent être manipulés séparément des cellules cancéreuses. Il est préférable d'avoir une hotte désigné et incubateur de cultures primaires.

Il est préférable de maintenir les cultures de cellules primaires à la concentration en oxygène physiologique de 3%. Atmosphérique (20%) d'oxygène raccourcit la durée de vie des cultures et augmente le stress oxydatif. Fibroblastes de souris sont sensibles au stress oxydatif et la sénescence ou entrez crise au sein de ~ 14 doublements de population lors maintenu à 20% (atmosphérique) de l'oxygène. Fibroblastes de souris peut être maintenu indéfiniment à ² 3% d'oxygène.

Toujours garder une trace du nombre de doublement de population des cultures. Espèces de grande taille (masse corporelle supérieur à 8000 g) sont susceptibles d'exposer la sénescence réplicative, et aura une durée de vie limitée en culture, même à 3% d'oxygène ^1. Des cellules provenant de plus petites espèces, comme les souris et les rats, vont proliférer indéfiniment à 3% d'oxygène, mais peuvent éventuellement devenir aneuploïdes. Si possible, commencer les expériences utilisant des cellules au doublement de population faible.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM/F12 media	Invitrogen	11330-032
Fetal Bovine Serum (FBS), Qualified	Invitrogen	01437-036	The Qualified serum had been pre-tested to provide good growth support for primary fibroblasts.
Antibiotic/Antimycotic	Invitrogen	15420-096
Penicillin/Streptomycin	Invitrogen	15140-122
Liberase TM Research Grade	Roche	05401127001	Replacement enzyme.
A note from the authors: Since Roche discontinued Liberase Blendzyme 3 (11814184001), they recommend using Liberase TM Research Grade medium Thermolysin (Cat. no. 05401119001 - 10 mg, Cat. no. 05401127001 - 100mg) instead. We have switched to this enzyme successfully with no issues.
EMEM media	ATCC	30-203	The EMEM media from ATCC already contains nonessential amino acids and sodium pyruvate.
Feathered #21 disposable, sterile scalpel	Multiple suppliers
Three Gas Control incubator	Forma or Heraeus