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Biology

Stabilire colture primarie di fibroblasti adulti dai roditori

doi: 10.3791/2033 Published: October 5, 2010

Summary

Questo articolo descrive un protocollo per l'isolamento e il mantenimento delle colture primarie di fibroblasti della pelle e tessuto polmonare dei roditori selvatici.

Abstract

L'importanza di utilizzare cellule primarie, piuttosto che linee cellulari tumorali, per ricerche biologiche sta diventando ampiamente riconosciuto. Cellule primarie sono preferite in studi di controllo del ciclo cellulare, apoptosi, e la riparazione del DNA, le cellule tumorali sono portatori di mutazioni in geni coinvolti in questi processi. Cellule primarie non può essere coltivato a tempo indeterminato a causa della comparsa di senescenza replicativa o aneuploidization. Quindi, nuove culture devono essere stabiliti regolarmente. La procedura per l'isolamento di fibroblasti embrionali dei roditori è ben consolidata, ma isolando colture di fibroblasti adulti spesso è una sfida. Fibroblasti roditori adulti isolati da modelli murini di patologie umane può essere un controllo preferito quando li confronto a fibroblasti da pazienti umani. Inoltre, i fibroblasti adulti sono l'unico materiale a disposizione quando si lavora con i roditori selvatici in cui donne in gravidanza non possono essere facilmente ottenuto. Qui forniamo un protocollo per l'isolamento e la cultura dei fibroblasti adulti dalla pelle dei roditori e dei polmoni. Abbiamo usato questa procedura con successo per isolare fibroblasti da oltre venti specie di roditori da laboratorio, topi e ratti di roditori selvatici come il castoro, l'istrice e lo scoiattolo.

Protocol

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1. Prima di partire

  1. Sterilizzare forbici e pinze con il 70% di etanolo.
  2. Piccolo agitatore magnetico all'interno di un bicchiere da 30 ml, coprire con due strati di stagnola, e autoclave.
  3. Preparare un 28 unità Wunsch / mL di soluzione stock Liberase Blendzyme 3 in acqua sterile. Fai aliquote 0,5 ml e congelare a -20 ° C. Scongelare un'aliquota di nuovo prima di ogni utilizzo. La soluzione potrebbe apparire torbida dopo lo scongelamento. Vortex la soluzione fino a quando diventa chiaro.
  4. Scaldare i media di coltura cellulare.

2. Animal Preparazione del campione

Attenzione: gli animali selvatici possono contenere agenti patogeni come virus della rabbia. Siate sempre consapevoli di aperta taglienti.

  1. Eutanasia dell'animale e il luogo della carcassa a 4 ° C. E 'meglio usare la carcassa subito, tuttavia, se questo non è pratico, come se gli animali sono raccolti sul campo, le carcasse possono essere utilizzati entro 24 ore. Dopo 24 ore il calo di rendimento delle cellule.
  2. Sezionare l'animale in sala operatoria o in cappa chimica (non nel cofano tessuto cultura).
  3. Ascellare zona è un luogo comodo per raccogliere campioni di pelle come la pelle ascellare è più sottile, contiene meno grasso, e la pelliccia è meno densa. Pulire il sito di incisione con il 70% di etanolo. Assicurarsi che la pelliccia è imbevuto di etanolo.
  4. Accorciare il pelo intorno al sito di incisione con un bisturi affilato. Shave una zona più ampia rispetto al sito di incisione desiderata. Cercare di minimizzare i tagli alla pelle. Spruzzare la zona con il 70% di etanolo e lasciare asciugare.
  5. Per raccogliere un campione di pelle accise un frammento di circa 1 cm 2. Pizzicare la pelle con una pinza dei tessuti, e tagliare con le forbici. Cerca di non tagliare lo strato di grasso con la pelle, sotto forma di grasso interferisce con la digestione collagenasi. Per raccogliere i campioni di polmone, lavare la zona del petto con il 70% di etanolo, e aprire la pelle sul petto con le forbici facendo una forma a T incisione e tirando fuori i lembi della pelle. Lavare l'area muscolare aperto con il 70% di etanolo e lasciare asciugare. Tagliare la gabbia toracica con pinze e forbici sterili (usare frese ossea per animali più grandi). Utilizzare tecniche sterili per evitare di contaminare gli organi interni. Non toccare gli organi interni con strumenti che ha toccato il pelo degli animali. Taglio frammenti polmone di circa 1 cm 2 utilizzando pinze sterili e forbici.
  6. Frammenti di tessuto posto in 50 mL con PBS sterile per evitare l'essiccamento.
  7. Lavare la parte esterna dei 50 mL con frammenti di tessuto con etanolo, e portarli alla cappa coltura dei tessuti.
  8. Smaltire carcassa animale.

3. L'estrazione di cellule

  1. Trasferire i frammenti di tessuto in un piatto di coltura di tessuti 10 cm con bisturi sterile. Non trasferire troppo PBS con il campione.
  2. Tagliare il tessuto in ~ 1 pezzi millimetri utilizzando due bisturi. Utilizza due lame con un'azione a forbice partendo dal centro e tirando a parte. Mantenere il tessuto appallottolato, non tagliare pezzo per pezzo. Quando il taglio è sufficiente la pelle assomiglia a stucco, non verrà separato in pezzi, ma sarà tratto sottile. Il tessuto polmonare è più facile da tagliare, e sarà separato in piccoli pezzi.
  3. Usando un bisturi, trasferire il tessuto tagliato in sterile da 30 ml bicchiere con ancoretta sterile. Lavare la piastra utilizzata per il taglio dei tessuti con 10 ml di DMEM/F12 media con 0,14 unità Wunsch / mL Liberase Blendzyme 3, e 1X antibiotica / antimicotica, e aggiungere la soluzione nel becher ml 30 con frammenti di tessuto.
  4. Coprire il becher con un foglio di sterile e incubare a 37 ° C, mescolando lentamente, per 30 a 90 minuti. La lunghezza del incubazione dipende dal tipo di specie e dei tessuti. Fare attenzione a non digerire troppo il tessuto. Migliori rendimenti si ottengono frammenti di tessuto sono ancora presenti alla fine della digestione. La pelle richiede più tempo per digerire quello del polmone. La pelle di animali di grandi dimensioni richiede più tempo per digerire. Controllare la digestione dopo 30 minuti, e poi ogni 10 min. Quando la digestione pelle è completa, i media diventa torbida e frammenti di pelle separati gli uni dagli altri, ed i bordi dei pezzi diventano "fuzzy". Digestione del polmone dovrebbe essere interrotta quando al polmone cambia frammenti di colore dal rosso al bianco e iniziare a formare le fibre appiccicoso.
  5. Preparare la soluzione contenente frammenti di tessuto su e giù per rompere i grumi. Trasferire la soluzione sterile tubo 50 ml. Se i frammenti di muoversi facilmente attraverso il taglio pipetta 10 ml e la digestione è stato fatto bene. Lavare il becher 3 volte con 10 ml di caldo DMEM/F12 media con 15% FBS, antibiotico / antimicotico 1X e aggiungere il supporto per il tubo 50 ml con frammenti di tessuto. Chiudere il tubo da 50 ml e mescolare per inversione un paio di volte. Il FBS nei media si ferma la digestione Liberase.
  6. Girano a 524 g in un oscillante centrifuga cultura secchiello tessuto per 5 min. Rimuovere il surnatante. Risospendere il pellet in 10 ml di caldo DMEM/F12 media con 15% FBS, 1X antibiotico / antimicotico. Preparare la sospensione conmassima forza di rompere i pezzi di tessuto.
  7. Aggiungere un altro 30 ml di DMEM/F12 media con 15% FBS, 1X antibiotico / antimicotico, mescolare e centrifugare a 524 g in un oscillante centrifuga cultura secchiello tessuto per 5 min. Ripetere ancora una volta per rimuovere le tracce di Liberase.
  8. Risospendere il pellet in 10 ml di DMEM/F12 media con 15% FBS, 1X antibiotica / antimicotica e trasferirli in un piatto di coltura tissutale 10 cm e posto in un tessuto culturale incubatore a 37 ° C, 5% CO 2, il 3% O 2 .
  9. Controllare le piastre ogni giorno per i fibroblasti e il colore dei media. Se l'isolamento ha avuto successo, fibroblasti strisciare fuori dei frammenti di tessuto e allegare alla piastra (Figura 1). Il fibroblasti iniziano a uscire frammenti di tessuto entro 2-5 giorni.
  10. Se il colore dei media diventa giallo, significa potenziale contaminazione o sovraffollamento delle celle. Esaminare le piastre sotto il microscopio ad alto ingrandimento. Se i batteri, funghi, o vermi sono presenti scartare le piastre (questo è raramente un problema con gli animali da laboratorio, tuttavia può verificarsi quando i campioni vengano prelevati dal loro ambiente naturale). In assenza di contaminazione è presente, ma i media cambiato colore, questo è causato da troppe cellule o frammenti di tessuto troppi posti nello stesso piatto. Se oltre il 60% del piatto è coperto da fibroblasti attaccato, cambiare il supporto sul piatto e trasferire i frammenti di tessuto per una nuova piastra con i nuovi media. Se non fibroblasti molti attaccato alla piastra, cambiare i media e dividere i pezzi di tessuto per un 2-4 piatti.
  11. Dopo 7 giorni, se i media non era stato sostituito in precedenza, il cambiamento dei media e trasferire i frammenti di tessuto per una nuova piastra con i nuovi media.
  12. Incubare le cellule e frammenti di tessuto per altri 7 giorni. Entro il giorno 14 tutti i fibroblasti praticabile usciti i frammenti di tessuto.
  13. Dopo 14 giorni dall'inizio della cella di isolamento, scartare i media vecchi e frammenti di tessuto, raccogliere le cellule e la piastra in un piatto nuovo a 5x10 5 cellule / piastra Emem con il 15% FBS, 1X penicillina / streptomicina, non amminoacidi essenziali e sodio piruvato. I media Emem sosterrà la crescita dei fibroblasti tipi di cellule solo e gli altri moriranno o fermare la proliferazione.
  14. Dopo che le cellule raggiungono 80-90% confluenza, congelare una aliquota di cellule per uso futuro.
  15. Continuare a coltura le cellule dividerli a 5x10 5 cellule / piastra, quando le cellule raggiungono 80-90% confluenza.

4. Rappresentante Risultati

Fibroblasti normali sono cellule di grandi dimensioni con sporgenze prominente (lamellipodia) (Figura 2). I fibroblasti crescere in monostrato. Una cultura sana crescita contiene cellule 1-10% in fase M, riconosciuto come arrotondato cellule elevata sulla superficie della piastra, ma non distaccata dalla piastra (Figura 3). Tipicamente, un piatto di 10 centimetri con la testa di serie 5x10 5 cellule diventa confluenti in 3-4 giorni. Il tempo di raddoppio varia enormemente tra le specie, e può essere maggiore per alcune delle longeve specie di roditori 1. Quando le cellule riempire un piatto che l'arresto della proliferazione in fase G1. Tipico piatto confluenti dei fibroblasti contiene un fitto strato di cellule (Figura 4). Quando le cellule raggiungono il 90% confluenza sono pronti per la scissione. Se lo si desidera, le cellule possono essere mantenute su un piatto arrestato confluenti per lunghi periodi di tempo con le normali modifiche media (una o due volte alla settimana).

Figura 1
Figura 1. Isolamento da fibroblasti della pelle del mouse (A) e polmone (B). I media è stata modificata per rimuovere le cellule distaccati e detriti prima di prendere le immagini il giorno 7.

Figura 2
Figura 2. Topo polmone fibroblasti.

Figura 3
Figura 3. Un campo di fibroblasti di topo celle a M-stadio, fotografato con ingrandimento 10X.

Figura 4
Figura 4. Un piatto confluenti di fibroblasti di topo, fotografato con ingrandimento 10X.

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Discussion

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Normali fibroblasti primari fornire un'ottima alternativa alle linee di cellule tumorali stabilito nella ricerca biologica. Un vantaggio importante dei fibroblasti è che non siano portatori di mutazioni in oncogeni e soppressori tumorali e mantenere intatti i punti di controllo del ciclo cellulare. Questo rende fibroblasti normale un sistema preferito per gli studi di regolazione del ciclo cellulare, la riparazione del DNA e l'apoptosi. Il protocollo qui descritto fornisce una ricetta semplice per l'isolamento e la manutenzione dei fibroblasti primari. Questo protocollo è stato utilizzato con successo per isolare fibroblasti da oltre 20 specie di roditori.

E 'importante mantenere la sterilità in ogni momento quando si lavora con colture cellulari per evitare contaminazioni. Se il laboratorio anche culture aggressive linee di cellule di cancro come le cellule HeLa, fibroblasti devono essere trattate separatamente dalle cellule tumorali. E 'preferibile avere un cappuccio designato e incubatore per colture primarie.

E 'preferibile mantenere colture cellulari primarie ad una concentrazione di ossigeno fisiologica del 3%. Atmosferica (20%) ossigeno abbrevia la durata della vita di culture e aumenta lo stress ossidativo. Fibroblasti di topo sono sensibili allo stress ossidativo e sarà senesce entrare in crisi o in ~ 14 raddoppi popolazione quando mantenuta al 20% (atmosferica) di ossigeno. Fibroblasti di topo può essere mantenuto indefinitamente a 2 di ossigeno del 3%.

Tenere sempre record del numero di raddoppiamento della popolazione delle culture. Specie di grandi dimensioni (massa corporea sopra 8.000 g) sono suscettibili di esporre senescenza replicativa, e avrà una durata limitata di cultura, anche al 3% di ossigeno 1. Cellule di specie più piccole, come i topi e ratti, si moltiplicano indefinitamente al 3% di ossigeno, ma può finalmente diventare aneuploidi. Se possibile, iniziare gli esperimenti utilizzando cellule di raddoppiamento della popolazione a basso.

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Disclosures

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Acknowledgments

Ringraziamo il Dott. Steven Austad per averci fornito la prima versione di questo protocollo. Questo lavoro è stato supportato anche da finanziamenti del NIH e la Ellison Medical Foundation di VG e AS

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM/F12 media Invitrogen 11330-032
Fetal Bovine Serum (FBS), Qualified Invitrogen 01437-036 The Qualified serum had been pre-tested to provide good growth support for primary fibroblasts.
Antibiotic/Antimycotic Invitrogen 15420-096
Penicillin/Streptomycin Invitrogen 15140-122
Liberase TM Research Grade Roche 05401127001 Replacement enzyme.
A note from the authors: Since Roche discontinued Liberase Blendzyme 3 (11814184001), they recommend using Liberase TM Research Grade medium Thermolysin (Cat. no. 05401119001 - 10 mg, Cat. no. 05401127001 - 100mg) instead. We have switched to this enzyme successfully with no issues.
EMEM media ATCC 30-203 The EMEM media from ATCC already contains nonessential amino acids and sodium pyruvate.
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Three Gas Control incubator Forma or Heraeus

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References

  1. Seluanov, A. Distinct tumor suppressor mechanisms evolve in rodent species that differ in size and lifespan. Aging . Cell. 7, 813-823 (2008).
  2. Parrinello, S. Oxygen sensitivity severely limits the replicative lifespan of murine fibroblasts. Nat Cell Biol. 5, 741-747 (2003).
Stabilire colture primarie di fibroblasti adulti dai roditori
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Cite this Article

Seluanov, A., Vaidya, A., Gorbunova, V. Establishing Primary Adult Fibroblast Cultures From Rodents. J. Vis. Exp. (44), e2033, doi:10.3791/2033 (2010).More

Seluanov, A., Vaidya, A., Gorbunova, V. Establishing Primary Adult Fibroblast Cultures From Rodents. J. Vis. Exp. (44), e2033, doi:10.3791/2033 (2010).

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