Etablera primärkulturer Vuxen Fibroblast från gnagare

Summary

Denna artikel beskriver ett protokoll för isolering och underhåll av primära fibroblast kulturer från hud och lungvävnad hos vilda gnagare.

Abstract

Vikten av att använda galvaniska element, snarare än cancer cellinjer, för biologiska studier blir allmänt erkänd. Primärceller är att föredra i studier av kontrollen av cellcykeln, apoptos, och DNA-reparation, som cancerceller bär mutationer i gener som är inblandade i dessa processer. Primärceller kan inte odlas på obestämd tid på grund av uppkomsten av replikationsförmåga åldrande eller aneuploidization. Därför, nya kulturer måste fastställas regelbundet. Förfarandet för isolering av gnagare embryonala fibroblaster är väl etablerad, men isolera vuxna fibroblast kulturer ofta en utmaning. Vuxen gnagare fibroblaster isolerade från musmodeller för mänskliga sjukdomar kan vara en god kontroll man jämför dem med fibroblaster från mänskliga patienter. Dessutom vuxna fibroblaster är den enda tillgängliga materialet när man arbetar med vilda gnagare där dräktiga honor inte enkelt kan erhållas. Här ger vi ett protokoll för isolering och odling av vuxna fibroblaster från gnagare hud och lungor. Vi använde den här proceduren framgångsrikt att isolera fibroblaster från över tjugo gnagare från laboratorie-möss och råttor till vilda gnagare som bäver, piggsvin och ekorre.

Protocol

1. Innan du börjar

1. Sterilisera sax och pincett med 70% etanol.
2. Lägg små magnetomrörare inne i en 30 ml bägare, täck med två lager folie och autoklav.
3. Förbered en 28 Wunsch enheter / ml stamlösning av Liberase Blendzyme 3 i sterilt vatten. Gör 0,5 mL alikvoter och fryser vid -20 ° C. Tina en ny alikvot före varje användning. Lösningen kan visas grumlig efter upptining. Vortex lösningen tills det blir klart.
4. Värm upp i media cellkultur.

2. Animal Provberedning

Varning: vilda djur kan innehålla patogener som en rabiesvirus. Alltid vara medveten om öppna vassa föremål.

1. Euthanize djuret och placera kroppen i 4 ° C. Det är bäst att använda kroppen direkt, men om detta inte är praktiskt t.ex. om djur samlas in på fältet, kan slaktkroppar användas inom 24 timmar. Efter 24 timmar i cellen avkastningen minskar.
2. Dissekera djuret i den kirurgiska svit eller i kemiska huva (inte i vävnadsodling huva).
3. Armhålan är en bekväm plats för att samla in huden prover armarna hud är tunnare, innehåller mindre fett, och pälsen är mindre tät. Rengör snitt platsen med 70% etanol. Se till att päls är blöt med etanol.
4. Raka pälsen runt snittet plats med en vass skalpell. Raka ett större område än den önskade snitt webbplatsen. Försök att minimera nedskärningar i huden. Spraya området med 70% etanol och låt den torka.
5. Att samla ett hudprov punktskatt ett fragment av ca 1 cm ^2. Nyp ihop huden med vävnad pincett och klipp med sax. Försök att inte klippa fettlager med huden, som fett stör kollagenas matsmältningen. Att samla lungan prover, tvätta bröstet med 70% etanol, och öppna huden på bröstet med en sax genom att göra en T-form snitt och dra isär flikarna i huden. Tvätta öppnade muskeln området med 70% etanol och låt torka. Skär bröstkorgen med hjälp av steril pincett och sax (använd ben saxar för större djur). Använd sterila tekniker för att undvika kontaminering av inre organ. Rör inte de inre organen med instrument som rörde djuret päls. Klipp lunga fragment av ca 1 cm ² med hjälp av steril pincett och sax.
6. Placera vävnad fragment i 50 ml rör med steril PBS för att undvika uttorkning.
7. Tvätta utsidan av 50 ml rör med vävnad fragment med etanol, och ta dem till vävnadsodling huven.
8. Kassera djurkropp.

3. Extrahera celler

1. Överför vävnaden fragment i en 10 cm vävnadsodling maträtt med steril skalpell. Överför inte alltför mycket PBS med provet.
2. Skär vävnaden i ~ 1 mm bitar med två skalpeller. Använd två blad med hjälp av en sax åtgärd från mitten och dra isär. Håll vävnaden balled upp, klipp inte bit för bit. När den skärande räcker huden liknar spackel, kommer det inte separera i bitar, men kommer att sträcka tunn. I lungvävnad är lättare att skära, och det kommer att skilja i små bitar.
3. Med hjälp av en skalpell, överföra skär vävnaden i sterila 30 ml bägare med sterilt rör bar. Tvätta plattan används för att skära vävnad med 10 mL DMEM/F12 media med 0,14 Wunsch enheter / ml Liberase Blendzyme 3 och 1X antibiotika / antimykotika, och tillsätt lösningen till 30 ml bägare med vävnad fragment.
4. Täck bägaren med steril folie och inkubera vid 37 ° C under omrörning långsamt, för 30 till 90 minuter. Längden på inkubationstiden beror på art och vävnadstyp. Se till att inte över-smälta vävnad. Bästa avkastningen erhålls när vävnad fragment fortfarande finns kvar i slutet av matsmältningen. Hud tar längre tid att smälta än lungan. Hud från stora djur, tar längre tid att smälta. Kontrollera matsmältningen efter 30 min, och därefter var 10 min. När huden matsmältningen är klar, blir media molnighet och fragment hud skilda från varandra, och kanterna på bitarna blir "luddiga". Lung matsmältningen bör avslutas när lungorna fragment ändrar färg från rött till vitt och börja bilda klibbiga fibrer.
5. Pipettera lösningen innehållande väv fragment upp och ner för att bryta klumpar. Överför lösningen till sterila 50 ml tub. Om fragmenten rör sig lätt genom 10 ml pipett skärning och matsmältningen gjordes bra. Skölj bägaren 3 gånger med 10 ml varmt DMEM/F12 media med 15% FBS, 1X antibiotika / antimykotika och lägga till media till 50 ml tub med vävnad fragment. Stäng 50 ml tub och blanda genom inversion några gånger. Den FBS i media kommer att sluta Liberase matsmältningen.
6. Snurra på 524 g på en svängig hink vävnadsodling Centrifugera i 5 minuter. Avlägsna supernatanten. Återsuspendera pelleten i 10 ml varmt DMEM/F12 media med 15% FBS, 1X antibiotika / antimykotika. Pipettera suspensionen medmaximal kraft att bryta vävnaden bitar.
7. Lägg till ytterligare 30 ml DMEM/F12 media med 15% FBS, 1X antibiotika / antimykotika, blanda och centrifugera vid 524 gi en svängig hink vävnadsodling Centrifugera i 5 minuter. Upprepa en gång till för att ta bort spår av Liberase.
8. Återsuspendera pelleten i 10 ml DMEM/F12 media med 15% FBS, 1X antibiotika / antimykotika och överför till en 10 cm vävnadsodling skål och lägg i en vävnadsodling inkubator vid 37 ° C, 5% CO _2, 3% O ₂ .
9. Kontrollera plattorna varje dag för fibroblaster och media färg. Om isoleringen lyckades, fibroblaster krypa ut ur vävnaden fragment och fäster plattan (Figur 1). Den fibroblast börja avsluta vävnad fragment inom 2-5 dagar.
10. Om media ändrar färg till gult, visar detta eventuella föroreningar eller överbeläggning av celler. Undersök plattorna under mikroskop med hög förstoring. Om bakterier, svampar eller maskar kasta närvarande plattorna (detta är sällan ett problem med försöksdjur, kan dock uppstå när proven tas från naturen). Om ingen smitta finns, men media ändrat färg, detta orsakas av antingen alltför många celler eller för många fragment vävnad placeras i samma maträtt. Om mer än 60% av plåten är täckt av bifogad fibroblaster, ändra media på tallriken och överför vävnaden fragment till en ny platta med de nya medierna. Om inte många fibroblaster fäst plattan, ändra media och dela vävnad bitar till en 2-4 tallrikar.
11. Efter 7 dagar, om media inte hade ändrats tidigare, ändra medier och överför vävnaden fragment till en ny platta med nya medier.
12. Inkubera cellerna och fragment vävnad för ytterligare 7 dagar. Efter 14 dagar är alla livskraftiga fibroblaster har lämnat vävnaden fragment.
13. Efter 14 dagar från början av cellens isolering, kassera den gamla medier och fragment vävnad, skörda celler och platta dem på en ny platta på 5x10 ⁵ celler / platta EMEM med 15% FBS, 1X Penicillin / streptomycin, icke essentiella aminosyror , och natrium pyruvat. EMEM media kommer att stödja tillväxt av fibroblaster bara och andra celltyper dör eller slutar breder ut sig.
14. Efter att cellerna når 80-90% sammanflödet, frysa en alikvot av celler för framtida bruk.
15. Fortsätt att odla cellerna genom att dela upp dem på 5x10 ⁵ celler / platta när cellerna når 80-90% sammanflödet.

4. Representativa resultat

Normala fibroblaster är stora celler med framträdande utskjutande delar (lamellipodia) (Figur 2). Fibroblaster växa i en monolager. Ett friskt växande kultur innehåller 1-10% celler i M skede erkännas som avrundas uppåt celler förhöjda över ytan av plattan, men inte loss från plattan (Figur 3). Vanligtvis blir en 10 cm parabolantenn ympats med 5x10 ⁵ celler konfluenta i 3-4 dagar. Fördubblingen varierar kraftigt mellan arter och kan vara större för några av de långlivade gnagare ^1. När celler fyller en tallrik de arresterar spridning i G1 skede. Typiska sammanflytande tallrik fibroblaster innehåller ett tätt lager av celler (Figur 4). När cellerna når 90% sammanflödet de är redo för klyvning. Om så önskas kan cellerna upprätthållas på ett gripits konfluenta plåt för längre perioder med regelbundna medier förändringar (en eller två gånger i veckan).

Figur 1. Fibroblast isolering från mus hud (A) och lunga (B). Medierna har ändrats för att avlägsna lös celler och skräp innan man tar bilder på dag 7.

Figur 2. Mus lung fibroblaster.

Figur 3. Ett fält med musfibroblaster innehåller celler i M-stadium, fotograferad vid 10x förstoring.

Figur 4. En sammanflytande tallrik musfibroblaster fotograferad vid 10x förstoring.

Discussion

Normal primära fibroblaster ger ett utmärkt alternativ till etablerade cancercellinjer i biologisk forskning. En viktig fördel med fibroblaster är att de inte bär på mutationer i onkogener och tumör stötvågsfilter och bibehålla intakt checkpoints cellcykeln. Detta gör normala fibroblaster en önskad system för studier av cellcykeln reglering, DNA-reparation, och apoptos. Protokollet som beskrivs här är ett enkelt recept för isolering och underhåll av primära fibroblaster. Detta protokoll har använts för att framgångsrikt isolera fibroblaster från över 20 arter av gnagare.

Det är viktigt att behålla steriliteten vid alla tillfällen när du arbetar med cellkulturer för att undvika kontaminering. Om laboratoriet också kulturer aggressiva linjer cancercell som HeLa celler, bör fibroblaster hanteras separat från cancerceller. Det är att föredra att ha en utsedd huva och inkubator för primära kulturer.

Det är bättre att behålla primära cellkulturer vid fysiologiska syrekoncentration på 3%. Atmosfärisk (20%) syre förkortar livslängden av kulturer och ökar oxidativ stress. Musfibroblaster är känsliga för oxidativ stress och kommer senesce eller ange krisen inom ~ 14 befolkning dubbleringar när bibehålls på 20% (atmosfäriskt) syre. Musfibroblaster kan bevaras i oändlighet till 3% syre ^2.

Alltid föra register över antalet invånare fördubbling av kulturer. Stora arter (body mass över 8000 g) kommer sannolikt att ställa ut replikationsförmåga åldrande, och kommer att ha en begränsad livslängd på kultur, även på 3% syre ^1. Celler från mindre arter, som möss och råttor, kommer att föröka sig på obestämd tid på 3% syre, men kan så småningom bli aneuploid. Om möjligt påbörja experiment med celler med låg befolkning fördubblas.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM/F12 media	Invitrogen	11330-032
Fetal Bovine Serum (FBS), Qualified	Invitrogen	01437-036	The Qualified serum had been pre-tested to provide good growth support for primary fibroblasts.
Antibiotic/Antimycotic	Invitrogen	15420-096
Penicillin/Streptomycin	Invitrogen	15140-122
Liberase TM Research Grade	Roche	05401127001	Replacement enzyme.
A note from the authors: Since Roche discontinued Liberase Blendzyme 3 (11814184001), they recommend using Liberase TM Research Grade medium Thermolysin (Cat. no. 05401119001 - 10 mg, Cat. no. 05401127001 - 100mg) instead. We have switched to this enzyme successfully with no issues.
EMEM media	ATCC	30-203	The EMEM media from ATCC already contains nonessential amino acids and sodium pyruvate.
Feathered #21 disposable, sterile scalpel	Multiple suppliers
Three Gas Control incubator	Forma or Heraeus