PAR-Clip - Une méthode pour identifier transcriptome à l'échelle des sites de liaison des protéines liant l'ARN

Summary

Transcrits d'ARN sont soumis à régulation post-transcriptionnelle vaste qui est médiée par une multitude d'action trans protéines liant l'ARN (pratiques commerciales restrictives). Nous présentons ici une méthode généralisable pour identifier précisément et à l'échelle du transcriptome à l'échelle des sites liaison à l'ARN de pratiques commerciales restrictives.

Abstract

Transcrits d'ARN sont soumis à la régulation des gènes post-transcriptionnel en interagissant avec des centaines de protéines liant l'ARN (pratiques commerciales restrictives) et microARN complexes contenant ribonucléoprotéine (miRNPs) qui sont souvent exprimés dans une cellule de type dépendante. Pour comprendre comment l'interaction de ces facteurs liant l'ARN affecte la régulation de la transcription individuels, des cartes à haute résolution in vivo des protéines-ARN interactions sont nécessaires ^1.

Une combinaison de facteurs génétiques, des approches biochimiques et informatiques sont généralement appliqués pour identifier l'ARN-RBP ou de l'ARN-RNP interactions. Profilage biopuces de l'ARN associés aux pratiques commerciales restrictives immunopurifié (RIP-Chip) ² définit les objectifs à un niveau du transcriptome, mais son application est limitée à la caractérisation des interactions cinétiquement stable et seulement dans de rares cas ^3,4 permet d'identifier l'élément de reconnaissance RBP (RRE ) dans l'ARN cible de long. Plus directe informations sur le site RBP cible est obtenu en combinant dans réticulation UV vivo ^5,6 avec l'immunoprécipitation ^7-9 suivie de l'isolement de segments d'ARN réticulé et séquençage d'ADNc (CLIP) ^10. CLIP a été utilisé pour identifier les cibles d'un certain nombre de pratiques commerciales restrictives ^11-17. Toutefois, CLIP est limitée par la faible efficacité des UV à 254 nm ARN-protéine de réticulation, et l'emplacement de la réticulation n'est pas facilement identifiable au sein de l'fragments séquencés réticulés, ce qui rend difficile de séparer les UV réticulé cibler des segments d'ARN à partir de fond non réticulé fragments d'ARN également présent dans l'échantillon.

Nous avons développé une approche puissante de réticulation basé sur des cellules de déterminer à haute résolution et du transcriptome à l'échelle des sites de liaison des pratiques commerciales restrictives cellulaire et miRNPs que nous appelons PAR-Clip (photoactivables-ribonucléoside-Enhanced réticulation et immunoprécipitation) (voir Fig. 1A pour un aperçu de la méthode). La méthode repose sur l'incorporation d'analogues ribonucléoside photoréactif, tels que le 4-thiouridine (4-SU) et 6-thioguanosine (6-SG) dans transcrits d'ARN naissantes par des cellules vivantes. L'irradiation des cellules par la lumière UV de 365 nm induit réticulation efficace de photoréactif nucléoside marqué ARN cellulaires aux pratiques commerciales restrictives qui interagissent. Immunoprécipitation de la RBP de l'intérêt est suivie de l'isolement de l'ARN réticulé et coimmunoprecipitated. L'ARN isolé est transformée en une banque d'ADNc et profonde séquencé en utilisant la technologie Solexa. Un trait caractéristique de banques d'ADNc préparées par RAP-Clip est que la position précise de réticulation peuvent être identifiés par des mutations qui résident dans l'ADNc séquencés. Lorsque vous utilisez 4-SU, séquences réticulés thymidine à la transition cytidine, tandis que l'aide de 6-SG résultats dans la guanosine à l'adénosine mutations. La présence des mutations dans les séquences réticulé permet de les séparer du fond de séquences dérivées d'ARN cellulaires abondants.

Application de la méthode à un certain nombre de protéines liant l'ARN diversifié a été signalé dans Hafner et al. ¹⁸

Protocol

Le protocole ci-dessous décrit la procédure de PAR-Clip pour cellules HEK293 exprimant DRAPEAU / HA-taggés IGF2BP1 lors de l'induction par la doxycycline. Nous allons utiliser un anticorps anti-FLAG pour immunoprécipitation.

PAR-Clip fonctionnera avec n'importe quel lignée cellulaire exprimant des niveaux détectables de l'endogène, sans étiquette ARN protéine de liaison (RBP) d'intérêts si un anticorps efficace pour immunoprécipitation est disponible.

Cellules Expansion

1. Développer FlpIn-HEK293/TO/FLAG/HA-IGF2BP1 cellules dans un milieu de croissance. Nous vous recommandons d'utiliser entre 100 à 400 x 10 ⁶ cellules (environ 10 à 40 cm 15 assiettes de culture cellulaire) comme point de départ. Cultivez-les à environ 80% de confluence.
2. 14 h avant réticulation ajouter un) 4-thiouridine à une concentration finale de 100 uM (1:1000 v / v d'un M 1 4-thiouridine solution stock) directement au milieu de culture cellulaire et b) induire l'expression de l'indicateur / HA taggés IGF2BP1 par addition de 1 ug / ml de doxycycline (1:10.000 v / v de 10 mg / ml solution stock doxycycline). REMARQUE: au lieu de 4-thiouridine vous pouvez également utiliser 100 uM de 6-thioguanosine.

Réticulation UV

1. Laver les cellules une fois avec 10 ml PBS glacé par plaque et retirez PBS complètement.
2. Placez les plaques sur un plateau avec de la glace et irradier découverts à 0,15 J / cm ² de 365 nm de lumière UV dans un Stratalinker 2400 (Stratagene) ou un appareil similaire.
3. Racler les cellules off avec une spatule en caoutchouc dans 1 ml de PBS par plaque, le transfert de 50 tubes de centrifugation ml et recueillir par centrifugation à 500 g pendant 5 min à 4 ° C et jeter le surnageant. 100 x 10 ⁶ cellules HEK293 (10 15 cm plaques) donnera environ. 1 ml de cellule humide de granules.
4. (Optionnel) Sauf si vous voulez continuer directement avec la lyse cellulaire, choc geler les cellules dans l'azote liquide et stocker granulés à -80 ° C. Les culots cellulaires peuvent être conservés pendant au moins 12 mois.

Lyse cellulaire et RNaseT1 digérer

1. Relevez culot cellulaire de cellules réticulées dans 3 volumes de tampon de lyse NP40 1x et incuber sur de la glace pendant 10 min.
2. Lysat à cellules claires par centrifugation à 13000 xg pendant 15 min à 4 ° C.
3. Effacer le lysat encore en le filtrant à travers un filtre à membrane de 0,2 um seringue (Acrodisc Pall ou équivalent).
4. Ajouter ribonucléase T1 (Fermentas, 10000 U / pl) à une concentration finale de 1 U / pl et incuber dans un bain-marie pendant 15 min à 22 ° C. Refroidir la réaction par la suite pour 5 min sur la glace avant de procéder.

Immunoprécipitation et la récupération des fragments d'ARN cibles réticulé

Utiliser le séparateur magnétique

Suivez ces directives tout au long de la préparation de l'échantillon pour empêcher les billes magnétiques de se dessécher.

1. Placer le tube contenant les billes sur le support magnétique pour 1 2 minutes.
2. Ajouter le tampon dans le tube alors que le tube est sur le séparateur magnétique.
3. Boucher le tube, le retirer du séparateur magnétique, et remettre en suspension les perles. Vous pouvez remettre en suspension les perles en feuilletant le tube avec votre doigt ou d'utiliser un Vortexer fixé à 5 6.
4. Centrifuger brièvement pour ramasser toutes les billes qui peuvent rester dans le bouchon du tube.
5. Répétez les étapes 1 à 4 selon les besoins.

Préparation des billes magnétiques

1. Transférer 10 ul de particules magnétiques Dynabeads protéines G (Invitrogen) lysat par cellule ml (pour une expérience typique elle devrait être d'env. 40 50 ul de billes) à un tube de 1,5 ml. Lavez perles deux fois avec 1 ml de tampon citrate-phosphate.
2. Remettre en suspension dans un volume double de tampon citrate-phosphate par rapport au volume initial de billes en suspension.
3. Ajouter 0,25 pg d'anti-FLAG anticorps monoclonal M2 (Sigma) par ml de suspension et incuber sur une roue en rotation pendant 40 min à température ambiante.
4. Lavez perles deux fois dans 1 ml de tampon citrate-phosphate pour éliminer l'anticorps non liés.
5. Remettre les billes dans le double du volume de tampon citrate-phosphate par rapport au volume initial de billes en suspension.

Immunoprécipitation (IP), deuxième RNase T1 digestion, et la déphosphorylation

1. Ajouter 20 ul d'anticorps fraîchement préparés conjugués des billes magnétiques par ml de lysat partielle RNase T1 cellule traitée et incuber dans 15 ml tubes de centrifugation sur une roue en rotation pendant 1 h à 4 ° C.
2. Recueillir des billes magnétiques sur un collecteur de particules magnétiques de 15 et 50 tubes de centrifugation ml (Invitrogen) et le transfert des tubes de 1,5 ml de microcentrifugation.
3. Lavez perles 3 fois dans 1 ml de tampon de lavage IP.
4. Ajouter RNaseT1 (Fermentas, 10000 U / pl) à une concentration finale de 100 U / ul et incuber la suspension de billes dans un bain-marie pendant 15 min à 22 ° C. Refroidir la suite sur la glacependant 5 min.
5. Lavez 3 fois en perles de 1 ml de tampon de lavage haute-sel.
6. Perles Remettre en suspension dans 1 volume de tampon de déphosphorylation
7. Ajouter phosphatase intestinale de veau alcaline (CIAP, ONE) à une concentration finale de 0,5 U / pl, et incuber la suspension pendant 10 min à 37 ° C.
8. Lavez perles fois dans 1 ml de tampon de lavage phosphatase
9. Laver deux fois en perles kinase (PNK) tampons polynucléotide sans DTT (la concentration la TNT nécessaires à la réaction enzymatique est suffisamment élevée pour endommager les billes magnétiques).
10. Resuspendre perles perles en un seul volume initial de tampon PNK

Le marquage des segments d'ARN aux protéines réticulées immunoprécipité

1. Pour la suspension de billes décrites ci-dessus, ajouter ^Υ-32 P-ATP à une concentration finale de 0,5 pCi / ul et T4 PNK (ONE) à 1 U / ul dans un volume de billes d'origine. Incuber la suspension pendant 30 min à 37 ° C.
2. Ajouter ATP non radioactif pour obtenir une concentration finale de 100 uM et incuber pendant encore 5 min à 37 ° C.
3. Laver les billes magnétiques 5 fois avec 800 pl d'PNK tampon sans TNT.
4. Resuspendre les perles dans 70 ul de tampon de chargement SDS-PAGE.

SDS-PAGE et électroélution des réticulé ARN-protéine complexes à partir de tranches de gel

1. Incuber la suspension radiomarqué pendant 5 min dans un bloc chauffant à 95 ° C pour dénaturer et la libération de la RBP immunoprécipités avec l'ARN réticulé et vortex.
2. Retirez les billes magnétiques sur le séparateur et le transfert du surnageant dans un tube de centrifugeuse propre de 1,5 ml.
3. Charge 40 ul du surnageant par puits d'une Novex Bis-Tris à 4-12% (Invitrogen) en gel de polyacrylamide préfabriqué et exécuter le gel pendant 55 min à 200 V.
4. Démonter la chambre de gel et de démanteler le gel, la laissant monté sur une plaque. Pour faciliter l'alignement du gel à l'impression sur papier phosphorimager, nous recommandons l'implantation de trois minuscules morceaux de gel radioactifs asymétrique à trois des quatre coins du gel. Morceaux de gel radioactifs peuvent être recueillies à partir de gels qui ont été précédemment utilisé pour purifier radiomarqué oligonucléotides synthétiques. Envelopper le gel dans un film plastique (par exemple, Saran) pour éviter toute contamination.
5. Exposer le gel d'un écran blanchi phosphorimager pendant 1 h et de visualiser sur un phosphorimager.
6. Aligner le gel sur le dessus de l'impression phosphorimager utilisant les morceaux de gel implanté pour l'orientation. Découpez les bandes qui correspondent à la taille attendue de la RBP (IGF2BP1, env. 75 kDa) et transférer dans un tube D-Tube dialyseur Midi et ajouter 800 ul 1x tampon SDS cours d'exécution.
7. Electroelute réticulé ARN-RBP complexes en 1x SDS courir tampon à 100 V pendant 2 h. excisés du gel et électro dans un Midi D-Tube dialyseur (Novagen) dans 800 pi de tampon SDS fonctionne selon les instructions du fabricant.

Protéinase K digestion

1. Ajouter un volume égal de tampon 2x protéinase K par rapport à la electroeluate, suivie par l'ajout de protéinase K (Roche) à une concentration finale de 1,2 mg / ml. Incuber pendant 30 min à 55 ° C.
2. Récupérer l'ARN par acides phénol / chloroforme / IAA d'extraction (25:24:1, pH 4,0), suivie par une extraction au chloroforme. Ajouter 1 l de glycogène (10 mg / ml stock) précipiter l'ARN en ajoutant 3 volumes d'éthanol. Dissoudre le culot dans l'eau 10,5 pi.

la préparation d'ADNc et le séquençage de profondeur

Réaliser l'ARN récupérés par un protocole standard d'ADNc préparation décrit à l'origine pour le clonage de petits ARN régulateurs ^19. La première étape, la ligature adaptateur 3 ', a été réalisée comme décrit sur une échelle de 20 ul avec 10,5 ul de l'ARN récupérés. Utilisez le séquençage Solexa adaptateur ensembles décrits. Selon la quantité d'ARN récupérés, 5'-adaptateur-3'-adaptateur de produits sans inserts peuvent être détectées après amplification de l'ADNc par PCR comme des bandes supplémentaires. Dans de tels cas, le produit d'accise plus de PCR de taille attendue à partir d'un NuSieve 3% à faible point de fusion gel d'agarose, éluer le produit de PCR à partir des morceaux de gel en utilisant le kit GelElute (Qiagen) et la séquence en utilisant la technologie Solexa. Un séquençage Solexa courir offre habituellement entre 6 et 10 millions de séquences qui sont assez lit pour une couverture du transcriptome gamme de sites de liaison des protéines liant l'ARN.

Analyse bioinformatique

Attention analyse bioinformatique de la séquence de lit doit être fait pour obtenir un aperçu significatif dans les sites pour la liaison à l'ARN RBP examinés, tels que l'élément de reconnaissance d'ARN, les régions préférées liant le RBP a (exonique vs intronique, séquence codante vs non traduite séquence). La séquence lit doivent être alignés contre les bases de données du génome et de l'Est. Nous utilisons habituellement lit Mapping unique dans le génome avec jusqu'à un décalage, l'insertion ou la suppression de construire des grappes de la séquence lit qui peuvent ensuite être analysés ultérieurement. La fréquence des mutations caractéristiques de la grappe séquencé lit, T pour les transitions C en utilisant 4-SU et G à A transitions en utilisant 6-SG, sont révélateurs de séquences avec succès réticulé. Dans notre expérience, les ARN non réticulé étiquetés avec 4-SU montrent un taux de mutation de fond d'environ 20%. Ce taux est augmente à env. 50-80% sur la réticulation.

Une description détaillée de l'analyse bioinformatique peut être trouvée dans le matériel supplémentaire de la publication par Hafner et al. ¹⁸

Étapes facultatives

Détermination du taux d'incorporation de 4-thiouridine en ARN total

Isoler l'ARN total à partir de la lignée cellulaire exprimant de façon stable le RBP d'intérêt après plus en milieu supplémenté avec 100 uM 4SU 16 h avant la récolte. Comme contrôle, la récolte des cellules cultivées sans ajout 4SU. Isoler l'ARN total par addition de 3 volumes de réactif Trizol (Sigma) pour les culots lavés suivant les instructions du fabricant. était encore purifier l'ARN total en utilisant Qiagen RNeasy selon le protocole du fabricant. Pour éviter l'oxydation des 4SU pendant l'isolement de l'ARN et l'analyse, ajouter 0,1 mM dithiothréitol (DTT) pour les tampons de lavage et ultérieures étapes enzymatiques. Digest et déphosphorylé ARN total à nucléosides unique pour l'analyse HPLC comme décrit avant le ^20. Brièvement, dans un volume de 30 ul, incuber 40 ug d'ARN total ont été purifiées pendant 16 h à 37 ° C avec 0,4 U de phosphatase alcaline bactérienne (biochimique Worthington) et 0,09 venin de serpent U phosphodiestérase (Worthington Biochemical). En tant que norme de référence, utiliser un ARN de synthèse 4SU marqué, (nous en standard l'utilisation CGUACGCGGAAUACUUCGA (4SU) U) et également l'objet de compléter la digestion enzymatique. Séparez les mélanges résultant de ribonucléosides par HPLC sur une découverte Supelco C18 (phase greffée de particules de silice uM 5, 250 x 4,6 mm) colonne en phase inverse (Bellefonte PA, USA). Tampons HPLC sont 0,1 M dans l'acétonitrile TEAA 3% (A) et 90% d'acétonitrile dans de l'eau (B). Utilisez un gradient isocratique: 0% de B pendant 15 min, 0 à 10% de B pendant 20 min, 10 à 100% de B pendant 30 min. Appliquer un B 5 min à 100% lavez appliquée entre les courses pour nettoyer la colonne HPLC.

Les résultats représentatifs

La figure 1 (droite) montre un résultat représentatif d'une PAR-Clip réalisé avec des lignées cellulaires exprimant DRAPEAU / HA-taggés avec 4 IGF2BP1-SU et 6-SG. Notez que l'efficacité de réticulation de la 6-SG pour IGF2BP1 est inférieur au rendement de réticulation pour 4-SU. L'efficacité plus faible réticulation se traduira par un fond plus élevé des séquences dérivées de fragments d'ARN cellulaires abondants et donc vous devriez considérer élargissement de l'expérience lors de l'utilisation moins efficace nucléosides photoréactif.

Le panneau de gauche de la figure 1 montre une comparaison de l'utilisation de différents analogues de l'uridine photoréactif qui pourrait être potentiellement utilisé pour PAR-Clip rapport aux traditionnels UV 254 nm de réticulation.

L'intensité de la bande radioactive de la bonne longueur vous donne une bonne idée si l'expérience PAR-Clip a travaillé et que vous avez isolé l'ARN suffisantes pour mener à bien un petit protocole de séquençage de l'ARN (étape par étape pour la préparation de la description banque d'ADNc de petites séquençage des ARN peut être trouvée dans ^19). La fréquence des mutations caractéristiques de la lecture séquencé, T pour les transitions C en utilisant 4-SU et G à A transitions en utilisant 6-SG, sont révélateurs de séquences avec succès réticulé. Dans notre expérience, les ARN non réticulé étiquetés avec 4-SU montrent un taux de mutation de fond d'environ 20%. Ce taux est augmente à env. 50-80% sur la réticulation.

Materials

Buffers and reagents

Growth medium HEK293 cells

DMEM 10% FBS 2 mM L-Glutamine 100 U/ml penicillin 100 U/ml streptomycin 100 μg/ml hygromycin 15 μg/ml blasticidin

4-thiouridine stock solution (1 M)

260.27 mg 4-thiouridine 1 ml DMSO

Doxycyclin stock (10 mg/ml)

10 mg doxycyclin 1 ml DMSO

1x NP40 lysis buffer

Prepare a stock of 5x buffer without DTT and protease inhibitors. Add DTT and protease inhibitor directly before the experiment.

50 mM HEPES, pH 7.5 150 mM KCl 2 mM EDTA 1 mM NaF 0.5% (v/v) NP40 0.5 mM DTT complete EDTA-free protease inhibitor cocktail (Roche)

Citrate-Phosphate buffer

4.7 g/l citric acid 9.2 g/l Na2HPO4 pH 5.0

IP-wash buffer

50 mM HEPES-KOH, pH 7.5 300 mM KCl 0.05% (v/v) NP40 0.5 mM DTT (add directly before experiment) complete EDTA-free protease inhibitor cocktail (Roche) (add directly before experiment)

High-salt wash buffer

50 mM HEPES-KOH, pH 7.5 500 mM KCl 0.05% (v/v) NP40 0.5 mM DTT (add directly before the experiment) complete EDTA-free protease inhibitor cocktail (Roche) (add directly before the experiment)

Dephosphorylation buffer

50 mM Tris-HCl, pH 7.9 100 mM NaCl 10 mM MgCl2 1 mM DTT

Phosphatase wash buffer

50 mM Tris-HCl, pH 7.5 20 mM EGTA 0.5% (v/v) NP40

Polynucleotide kinase (PNK) buffer without DTT

50 mM Tris-HCl, pH 7.5 50 mM NaCl 10 mM MgCl2

PNK buffer

50 mM Tris-HCl, pH 7.5 50 mM NaCl 10 mM MgCl2 5 mM DTT

SDS PAGE loading buffer

10% glycerol (v/v) 50 mM Tris-HCl, pH 6.8 2 mM EDTA 2% SDS (w/v) 100 mM DTT 0.1% bromophenol blue

2x Proteinase K buffer

100 mM Tris-HCl, pH 7.5 150 mM NaCl 12.5 mM EDTA 2% (w/v) SDS