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बराबर क्लिप - एक विधि transcriptome चौड़ा शाही सेना बंधनकारी प्रोटीन की बाइंडिंग साइटें पहचानें

Published: July 2, 2010 doi: 10.3791/2034
Automatic Translation
1, 2, 3, 3, 4, 4, 1, 1, 2, 2, 1, 1, 5, 3, 1
1Howard Hughes Medical Institute, Laboratory of RNA Molecular Biology, Rockefeller University, 2Berlin Institute for Medical Systems Biology, Max-Delbrück-Center for Molecular Medicine, 3Biozentrum der Universität Basel and Swiss Institute of Bioinformatics (SIB), 4Biozentrum der Universität Basel and Swiss Institute of Bioinformatics (SIB), 5Genomics Resource Center, Rockefeller University

Summary

शाही सेना टेप है कि पार अभिनय शाही सेना बाध्यकारी प्रोटीन (RBPs) की एक भीड़ द्वारा मध्यस्थता है व्यापक posttranscriptional विनियमन के अधीन हैं. यहाँ हम एक generalizable विधि और ठीक transcriptome की व्यापक पैमाने पर RBPs की शाही सेना बाध्यकारी साइटों की पहचान उपस्थित थे.

Protocol

नीचे प्रोटोकॉल बराबर क्लिप HEK293 कोशिकाओं फ्लैग व्यक्त / IGF2BP1 हा डॉक्सीसाइक्लिन के साथ प्रेरण पर टैग के लिए प्रक्रिया का वर्णन करता है. हम immunoprecipitation के लिए एक विरोधी झंडा एंटीबॉडी का उपयोग करेगा.

बराबर क्लिप किसी भी कोशिका लाइन अंतर्जात के detectable स्तर, शाही सेना ब्याज की बाध्यकारी प्रोटीन (RBP) untagged व्यक्त अगर immunoprecipitation के लिए एक कुशल एंटीबॉडी उपलब्ध है के साथ काम करेंगे.

विस्तार कक्ष

  1. मध्यम विकास में FlpIn-HEK293/TO/FLAG/HA-IGF2BP1 कोशिकाओं का विस्तार करें. हम 100-400 x 10 6 कोशिकाओं (लगभग 1-40 15 सेमी सेल संस्कृति प्लेटों) के बीच एक प्रारंभिक बिंदु के रूप में उपयोग करने की अनुशंसा. उन्हें लगभग 80% confluency हो जाओ.
  2. 14 घंटे पहले crosslinking 100 सुक्ष्ममापी के अंतिम एकाग्रता (1:1000 v / v एम 1 4 thiouridine शेयर समाधान के) सेल संस्कृति माध्यम से सीधे) 4 thiouridine और जोड़ ख) झंडा / हा की अभिव्यक्ति प्रेरित 1 / डॉक्सीसाइक्लिन के μg मिलीलीटर (1:10,000 v / v 10 मिलीग्राम / एमएल डॉक्सीसाइक्लिन शेयर समाधान के) के अलावा द्वारा IGF2BP1 टैग. नोट: 4-thiouridine के बजाय आप भी 6-thioguanosine 100 सुक्ष्ममापी उपयोग कर सकते हैं.

यूवी - Crosslinking

  1. कोशिकाओं को एक बार और 10 मिलीलीटर ठंडा प्लेट प्रति पीबीएस के साथ धो PBS पूरी तरह से हटा.
  2. बर्फ और एक 2400 Stratalinker में 0.15 जम्मू / 2 सेमी 365 के एनएम यूवी प्रकाश (Stratagene) या इसी तरह की डिवाइस के साथ खुला चमकाना के साथ एक थाली पर प्लेस प्लेटें .
  3. कोशिकाओं परिमार्जन प्रति प्लेट, 50 मिलीलीटर centrifugation ट्यूब करने के लिए स्थानांतरण 1 मिलीलीटर पीबीएस में एक रबर पुलिसकर्मी के साथ और 500 XG पर centrifugation द्वारा 4 ° C से कम 5 मिनट के लिए और जमा सतह पर तैरनेवाला त्यागने. X 100 10 6 HEK293 कोशिकाओं (10 15 सेमी प्लेटें) लगभग निकलेगा. गीला सेल गोली के 1 मिलीलीटर.
  4. (वैकल्पिक) जब तक आप सीधे सेल lysis के साथ जारी रखना चाहते हैं, सदमे -80 में तरल नाइट्रोजन और दुकान में सेल गोली ° सी. फ्रीज सेल छर्रों कम से कम 12 महीने के लिए भंडारित किया जा सकता है है.

सेल lysis और RNaseT1 पचाने में

  1. 1x NP40 lysis बफर के 3 खंडों में Crosslinked कोशिकाओं के सेल गोली ले लो और 10 मिनट के लिए बर्फ पर सेते हैं.
  2. 15 मिनट के लिए 13,000 XG पर centrifugation द्वारा स्पष्ट सेल 4 बजे ° lysate सी.
  3. Lysate यह एक 0.2 सुक्ष्ममापी झिल्ली सिरिंज फिल्टर (पाल Acrodisc या समकक्ष) के माध्यम से फ़िल्टर करके आगे साफ़.
  4. यू 1 / 22 पर और 15 मिनट के लिए पानी स्नान में μl सेते डिग्री सेल्सियस के अंतिम एकाग्रता RNase T1 (Fermentas, 10,000 यू / μl) जोड़ें बाद में आगे बढ़ने से पहले बर्फ पर 5 मिनट के लिए शांत प्रतिक्रिया.

Immunoprecipitation और Crosslinked लक्ष्य शाही सेना के टुकड़े की वसूली

चुंबकीय विभाजक का उपयोग करना

नमूना तैयार करने के दौरान इन दिशानिर्देशों का पालन करने के लिए बाहर सुखाने से चुंबकीय मोतियों को रोकने.

  1. 1 2 मिनट के लिए चुंबकीय स्टैंड पर मोती युक्त ट्यूब रखें.
  2. ट्यूब बफर जोड़ें जबकि ट्यूब चुंबकीय विभाजक पर है.
  3. कैप ट्यूब, यह चुंबकीय विभाजक से निकालने के लिए, और मोती resuspend. आप अपनी उंगली के साथ ट्यूब flicking द्वारा मोती resuspend या 5 6 पर सेट vortexer का उपयोग कर सकते हैं.
  4. संक्षिप्त अपकेंद्रित्र किसी भी मोती है कि ट्यूब टोपी में रह सकता है इकट्ठा.
  5. दोहराएँ चरण 1 से 4 के रूप में आवश्यक है.

चुंबकीय मोतियों की तैयारी

  1. Dynabeads प्रोटीन जी चुंबकीय कणों के 10 μl (Invitrogen) प्रति मिलीलीटर सेल lysate स्थानांतरण (यह होना चाहिए एक विशिष्ट प्रयोग के लिए लगभग 40 मोतियों की 50 μl) एक 1.5 मिलीलीटर microfuge ट्यूब. साइट्रेट फॉस्फेट बफर के 1 मिलीलीटर के साथ मोती दो बार धो.
  2. साइट्रेट फॉस्फेट मनका निलंबन के मूल मात्रा रिश्तेदार बफर में दो बार की मात्रा में Resuspend है.
  3. विरोधी झंडा M2 मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के 0.25 μg (सिग्मा) प्रति मिलीलीटर और कमरे के तापमान पर 40 मिनट के लिए एक rotating पहिया पर निलंबन सेते जोड़ें.
  4. मोती दो बार साइट्रेट फॉस्फेट बफर के 1 मिलीलीटर में अनबाउंड एंटीबॉडी हटायें धो.
  5. साइट्रेट फॉस्फेट मनका निलंबन के मूल मात्रा रिश्तेदार बफर में दो बार की मात्रा में मोती Resuspend.

(आईपी) immunoprecipitation, दूसरा RNase T1 पाचन, और dephosphorylation

  1. हौसले से तैयार आंशिक RNase T1 इलाज सेल lysate के प्रति मिलीलीटर एंटीबॉडी संयुग्मित चुंबकीय मोतियों के 20 μl जोड़ें और 4 में 1 ज के लिए एक rotating पहिया पर 15 मिलीलीटर centrifugation ट्यूब में सेते डिग्री सेल्सियस
  2. एक चुंबकीय कण कलेक्टर पर चुंबकीय मोतियों और 15 और 50 मिलीलीटर centrifugation ट्यूब (Invitrogen) के लिए ले लीजिए 1.5 मिलीलीटर microfuge ट्यूबों के लिए स्थानांतरण.
  3. मोती आईपी धोने बफर के 1 मिलीलीटर में 3 बार धोएं.
  4. 100 यू / μl के अंतिम एकाग्रता के लिए RNaseT1 जोड़ें (Fermentas, +१०,००० यू / μl) और 22 पर 15 मिनट के लिए पानी के स्नान में मनका निलंबन सेते डिग्री सेल्सियस बर्फ पर बाद में कूल5 मिनट के लिए.
  5. मोती उच्च नमक धोने बफर के 1 मिलीलीटर में 3 बार धोएं.
  6. Dephosphorylation बफर के एक मात्रा में Resuspend मोती
  7. 0.5 यू / μl के अंतिम एकाग्रता बछड़ा आंत्र alkaline फॉस्फेट (CIAP, ठोंग) जोड़ें, और 37 पर 10 मिनट के लिए निलंबन सेते डिग्री सेल्सियस
  8. 1 मिलीलीटर में फॉस्फेट धोने बफर के मोती दो बार धो
  9. डीटीटी (डीटीटी enzymatic प्रतिक्रिया के लिए आवश्यक एकाग्रता है काफी उच्च चुंबकीय मोतियों को नुकसान पहुंचा है) के बिना दो बार polynucleotide kinase बफर (PNK) में मोती धो लें.
  10. PNK बफर के मूल मनका मात्रा में Resuspend मोती

शाही सेना immunoprecipitated प्रोटीन Crosslinked क्षेत्रों के Radiolabeling

  1. मनका निलंबन ऊपर वर्णित करने के लिए, 0.5 PNK μCi / μl और टी -4 के अंतिम एकाग्रता (चंचु) Υ-32 पी एटीपी-1 यू / एक मूल मनका मात्रा में μl को जोड़ने. 30 मिनट के लिए 37 पर निलंबन सेते डिग्री सेल्सियस
  2. गैर रेडियोधर्मी एटीपी जोड़ें 100 सुक्ष्ममापी के अंतिम एकाग्रता को प्राप्त है और 37 पर एक और 5 मिनट के लिए सेते डिग्री सेल्सियस
  3. चुंबकीय मोतियों डीटीटी बिना PNK बफर के 800 μl के साथ 5 बार धोएं.
  4. एसडीएस पृष्ठ लोड हो रहा है बफर के 70 μl में मोती Resuspend.

और जेल स्लाइस से Crosslinked आरएनए प्रोटीन परिसरों के electroelution एसडीएस PAGE

  1. 95 पर 5 मिनट के लिए एक गर्मी ब्लॉक में radiolabeled निलंबन सेते डिग्री सेल्सियस denature और Crosslinked शाही सेना और भंवर के साथ immunoprecipitated RBP रिलीज.
  2. विभाजक पर चुंबकीय मोतियों निकालें और एक साफ 1.5 मिलीलीटर microfuge ट्यूब स्थानांतरण सतह पर तैरनेवाला.
  3. सतह पर तैरनेवाला के 40 μl के प्रति अच्छी तरह से एक बीआईएस Tris Novex 4-12% (Invitrogen) मिल में बना हुआ polyacrylamide जेल लोड और 55 मिनट के लिए 200 पर जेल चलाने वी.
  4. जेल चैम्बर जुदा और जेल को नष्ट, यह एक थाली पर घुड़सवार छोड़ने. Phosphorimager कागज प्रिंटआउट के लिए जेल के संरेखण की सुविधा के लिए, हम तीन छोटे रेडियोधर्मी जेल टुकड़े तीन जेल के चार कोनों में asymmetrically दाखिल करने की सलाह देते हैं. रेडियोधर्मी जेल टुकड़े है कि पहले से radiolabeled सिंथेटिक oligonucleotides शुद्ध इस्तेमाल किया गया जैल से एकत्र किया जा सकता है है. संक्रमण से बचने के लिए प्लास्टिक की फिल्म में जेल (जैसे सरन लपेटो) लपेटें.
  5. एक blanked 1 घंटे के लिए phosphorimager स्क्रीन के लिए जेल बेनकाब और एक phosphorimager पर कल्पना.
  6. Phosphorimager उन्मुखीकरण के लिए प्रत्यारोपित जेल टुकड़े का उपयोग प्रिंटआउट के शीर्ष पर जेल संरेखित करें. बैंड है कि RBP (IGF2BP1, लगभग 75 केडीए) की उम्मीद आकार के अनुरूप है और एक डी - ट्यूब Dialyzer Midi ट्यूब को हस्तांतरण और 800 μl 1x एसडीएस चल बफर जोड़ने कट.
  7. Crosslinked आरएनए RBP 1x एसडीएस में जटिल 100 वी 2 एच. के लिए बफर चल Electroelute जेल से excised और निर्माता के निर्देशों के अनुसार 800 μl एसडीएस चल बफर में डी ट्यूब Dialyzer Midi (Novagen) में electroeluted.

Proteinase कश्मीर पाचन

  1. Electroeluate के लिए सम्मान के साथ एक 2x proteinase कश्मीर बफर के बराबर मात्रा proteinase कश्मीर (Roche) के 1.2 मिलीग्राम / मिलीलीटर की एक अंतिम एकाग्रता के अलावा द्वारा पीछा जोड़ें. 55 में 30 मिनट के लिए सेते डिग्री सेल्सियस
  2. अम्लीय phenol क्लोरोफॉर्म / / IAA निष्कर्षण (25:24:1, पीएच 4.0) क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण द्वारा पीछा द्वारा शाही सेना पुनर्प्राप्त. 1 glycogen के μl (10 शेयर मिलीग्राम / एमएल) जोड़ें इथेनॉल के 3 संस्करणों जोड़कर शाही सेना वेग. गोली 10.5 μl पानी में भंग.

सीडीएनए लाइब्रेरी तैयारी और गहरी अनुक्रमण

कैर्री एक मानक सीडीएनए लाइब्रेरी की तैयारी मूल रूप से छोटे विनियामक 19 RNAs के क्लोनिंग के लिए वर्णित प्रोटोकॉल के माध्यम से बरामद शाही सेना. पहला कदम, '3 एडाप्टर ligation, बाहर के रूप में एक 20 μl बरामद शाही सेना के 10.5 μl पैमाने का उपयोग पर वर्णित किया गया है. Solexa अनुक्रमण सेट वर्णित अनुकूलक का उपयोग करें. शाही सेना की राशि पर निर्भर करता है बरामद, 5'-एडाप्टर - 3'-एडाप्टर आवेषण के बिना उत्पादों अतिरिक्त पीसीआर बैंड के रूप सीडीएनए के प्रवर्धन के बाद पता लगाया जा सकता है. ऐसे मामलों में, एक 3% NuSieve से उम्मीद आकार के अब पीसीआर उत्पाद आबकारी कम गलनांक agarose जेल, जेल GelElute (Qiagen) किट और अनुक्रम का उपयोग कर Solexa प्रौद्योगिकी का उपयोग कर टुकड़े से पीसीआर उत्पाद elute. एक Solexa अनुक्रमण चलाने के आमतौर पर 6 और 10 लाख अनुक्रम के बीच परमिट पढ़ता है कि शाही सेना बंधनकारी प्रोटीन बाध्यकारी साइटों के transcriptome की विस्तृत कवरेज के लिए पर्याप्त हैं.

Bioinformatic विश्लेषण

अनुक्रम की सावधानी से bioinformatic विश्लेषण जरूरतों को जांच RBP के लिए शाही सेना आरएनए मान्यता तत्व, पसंदीदा बाध्यकारी क्षेत्रों RBP है (exonic बनाम intronic जैसे बाध्यकारी साइटों में सार्थक अंतर्दृष्टि प्राप्त किया जा करने के लिए पढ़ता है, अनुक्रम बनाम untranslated कोडन अनुक्रम). अनुक्रम पढ़ता जीनोम और ईएसटी डेटाबेस के खिलाफ गठबंधन किया जाना चाहिए. हम आम तौर पर पढ़ता है mappi का उपयोगविशिष्ट जीनोम एनजी एक बेमेल सम्मिलन, या अनुक्रम के समूहों का निर्माण करने के लिए विलोपन के साथ पढ़ता है कि तब आगे का विश्लेषण किया जा सकता है. क्लस्टर अनुक्रम में विशेषता म्यूटेशनों की आवृत्ति पढ़ता है, टी सी संक्रमण के लिए जब एक संक्रमण के लिए 4-SU और जी का उपयोग कर जब 6-एसजी का उपयोग कर सफलतापूर्वक Crosslinked दृश्यों का संकेत कर रहे हैं. हमारे अनुभव में uncrosslinked 4-SU के साथ लेबल RNAs के लगभग 20% की एक पृष्ठभूमि के उत्परिवर्तन की दर दिखा. यह दर लगभग बढ़ जाती है. Crosslinking पर 50-80%.

Bioinformatic विश्लेषण की एक विस्तृत वर्णन Hafner एट अल द्वारा प्रकाशन के पूरक सामग्री में पाया जा सकता है है 18 .

वैकल्पिक कदम

कुल शाही सेना में 4-thiouridine का समावेश स्तर के निर्धारण

सेल लाइन से कुल शाही सेना stably 100 16 घंटे पहले फसल को 4SU सुक्ष्ममापी के साथ पूरक माध्यम से बढ़ रहा है के बाद ब्याज की RBP व्यक्त पृथक. किसी नियंत्रण के रूप में, फसल कोशिकाओं 4SU अलावा बिना हो. कुल शाही सेना को धोया सेल छर्रों के निर्माता के निर्देशों का पालन करने के लिए 3 Trizol अभिकर्मक (सिग्मा) की मात्रा के अलावा द्वारा अलग. आगे कुल निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार Qiagen RNeasy का उपयोग शाही सेना शुद्ध. आरएनए अलगाव और विश्लेषण के दौरान 4SU की oxidization को रोकने के लिए, धोने buffers और बाद एंजाइमी कदम को 0.1 मिमी dithiothreitol (डीटीटी) जोड़ने. डाइजेस्ट और HPLC विश्लेषण के लिए एकल nucleosides dephosphorylated कुल शाही सेना के रूप में 20 से पहले का वर्णन किया . संक्षेप में, एक 30 μl मात्रा में, 16 ज के लिए 37 पर कुल शाही सेना शुद्ध 40 μg थे सेते ° सी यू 0.4 बैक्टीरियल क्षारीय (बायोकेमिकल Worthington) फॉस्फेट और 0.09 यू सांप के जहर के साथ phosphodiesterase (बायोकेमिकल Worthington). एक संदर्भ के मानक के रूप में, एक सिंथेटिक 4SU लेबल शाही सेना है, (हम standardly (4SU) CGUACGCGGAAUACUUCGA यू का उपयोग करें) और यह भी विषय enzymatic पाचन पूरा उपयोग करें. HPLC द्वारा एक Supelco डिस्कवरी C18 (बंधुआ चरण सिलिका 5 सुक्ष्ममापी कण, 250 x 4.6 मिमी) रिवर्स चरण स्तंभ (Bellefonte फिलीस्तीनी अथॉरिटी, संयुक्त राज्य अमरीका) पर ribonucleosides के परिणामस्वरूप मिश्रण को अलग करें. HPLC बफ़र्स 3% (ए) acetonitrile acetonitrile और पानी में 90% (बी) में 0.1 एम TEAA हैं. 15 मिनट, 20 मिनट के लिए 0 से 10% बी, 10 से 30 मिनट के लिए 100% बी के लिए एक isocratic ढाल 0% बी: का प्रयोग करें. एक 5 मिनट 100% बी के बीच लागू धोने HPLC स्तंभ साफ रन लागू करें.

प्रतिनिधि परिणाम

चित्रा 1
चित्रा 1 (सही पैनल) एक सेल लाइनों फ्लैग व्यक्त / 4-SU और 6-एसजी के साथ टैग IGF2BP1 हा के साथ प्रदर्शन बराबर क्लिप के एक प्रतिनिधि के परिणाम से पता चलता है . ध्यान दें कि IGF2BP1 के लिए 6 - एसजी के crosslinking क्षमता 4 - एस यू के लिए crosslinking क्षमता से कम है. कम crosslinking दक्षता प्रचुर मात्रा में सेलुलर RNAs के टुकड़े से प्राप्त दृश्यों के एक उच्च पृष्ठभूमि में परिणाम और इसलिए आप प्रयोग स्केलिंग जब कम कुशल photoreactive nucleosides का उपयोग पर विचार करना चाहिए.

चित्रा 1 के बाईं पैनल अलग photoreactive uridine analogs कि संभवतः पारंपरिक यूवी 254 एनएम crosslinking की तुलना में बराबर क्लिप के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है का उपयोग की तुलना से पता चलता है.

सही लंबाई की रेडियोधर्मी बैंड की तीव्रता आप एक अच्छा विचार है कि प्रयोग बराबर क्लिप काम किया है और एक छोटे आरएनए अनुक्रमण प्रोटोकॉल (छोटे सीडीएनए लाइब्रेरी की तैयारी के लिए कदम दर कदम विवरण के माध्यम से आप ले जाने के लिए पर्याप्त आरएनए अलग है देता है RNAs के अनुक्रमण 19 में पाया जा सकता है). अनुक्रम पढ़ता है, सी संक्रमण के लिए टी में विशेषता परिवर्तन जब एक संक्रमण के लिए 4-SU और जी का उपयोग कर जब 6-एसजी का उपयोग कर, की आवृत्ति सफलतापूर्वक Crosslinked दृश्यों का संकेत कर रहे हैं. हमारे अनुभव में uncrosslinked 4-SU के साथ लेबल RNAs के लगभग 20% की एक पृष्ठभूमि के उत्परिवर्तन की दर दिखा. यह दर लगभग बढ़ जाती है. Crosslinking पर 50-80%.

Disclosures

टीटी Alnylam फार्मास्यूटिकल्स के लिए एक cofounder और वैज्ञानिक सलाहकार और Regulus चिकित्सा के लिए एक सलाहकार है.

Acknowledgments

हम उपयोगी विचार - विमर्श के लिए Tuschl प्रयोगशाला के सदस्यों को धन्यवाद. महाराष्ट्र डेस्चर Akademischer Austauschdienst (DAAD) द्वारा समर्थित है. इस काम स्विस राष्ट्रीय फंड # MZ 3100A0 - 114,001 अनुदान द्वारा समर्थित किया गया, टीटी एक HHMI अन्वेषक है, और अपनी प्रयोगशाला में काम एनआईएच GM073047 अनुदान और MH08442 और स्टार फाउंडेशन द्वारा समर्थित किया गया था.

Materials

Buffers and reagents

Growth medium HEK293 cells
  • DMEM
  • 10% FBS
  • 2 mM L-Glutamine
  • 100 U/ml penicillin
  • 100 U/ml streptomycin
  • 100 μg/ml hygromycin
  • 15 μg/ml blasticidin

4-thiouridine stock solution (1 M)
  • 260.27 mg 4-thiouridine
  • 1 ml DMSO

Doxycyclin stock (10 mg/ml)
  • 10 mg doxycyclin
  • 1 ml DMSO

1x NP40 lysis buffer

Prepare a stock of 5x buffer without DTT and protease inhibitors. Add DTT and protease inhibitor directly before the experiment.
  • 50 mM HEPES, pH 7.5
  • 150 mM KCl
  • 2 mM EDTA
  • 1 mM NaF
  • 0.5% (v/v) NP40
  • 0.5 mM DTT
  • complete EDTA-free protease inhibitor cocktail (Roche)

Citrate-Phosphate buffer
  • 4.7 g/l citric acid
  • 9.2 g/l Na2HPO4
  • pH 5.0

IP-wash buffer
  • 50 mM HEPES-KOH, pH 7.5
  • 300 mM KCl
  • 0.05% (v/v) NP40
  • 0.5 mM DTT (add directly before experiment)
  • complete EDTA-free protease inhibitor cocktail (Roche) (add directly before experiment)

High-salt wash buffer
  • 50 mM HEPES-KOH, pH 7.5
  • 500 mM KCl
  • 0.05% (v/v) NP40
  • 0.5 mM DTT (add directly before the experiment)
  • complete EDTA-free protease inhibitor cocktail (Roche) (add directly before the experiment)

Dephosphorylation buffer
  • 50 mM Tris-HCl, pH 7.9
  • 100 mM NaCl
  • 10 mM MgCl2
  • 1 mM DTT

Phosphatase wash buffer
  • 50 mM Tris-HCl, pH 7.5
  • 20 mM EGTA
  • 0.5% (v/v) NP40

Polynucleotide kinase (PNK) buffer without DTT
  • 50 mM Tris-HCl, pH 7.5
  • 50 mM NaCl
  • 10 mM MgCl2

PNK buffer
  • 50 mM Tris-HCl, pH 7.5
  • 50 mM NaCl
  • 10 mM MgCl2
  • 5 mM DTT

SDS PAGE loading buffer
  • 10% glycerol (v/v)
  • 50 mM Tris-HCl, pH 6.8
  • 2 mM EDTA
  • 2% SDS (w/v)
  • 100 mM DTT
  • 0.1% bromophenol blue

2x Proteinase K buffer
  • 100 mM Tris-HCl, pH 7.5
  • 150 mM NaCl
  • 12.5 mM EDTA
  • 2% (w/v) SDS

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References

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  19. Hafner, M. Identification of microRNAs and other small regulatory RNAs using cDNA library sequencing. Methods. 44 (1), 3-3 (2008).
  20. Andrus, A., Kuimelis, R. G. Base composition analysis of nucleosides using HPLC. Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry. Chapter 10 (Unit 10.6), (2001).

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सेलुलर जीवविज्ञान 41 अंक यूवी crosslinking शाही सेना बंधनकारी प्रोटीन शाही सेना बाध्यकारी आकृति 4 thiouridine 6-thioguanosine
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Hafner, M., Landthaler, M., Burger,… More

Hafner, M., Landthaler, M., Burger, L., Khorshid, M., Hausser, J., Berninger, P., Rothballer, A., Ascano, M., Jungkamp, A., Munschauer, M., Ulrich, A., Wardle, G. S., Dewell, S., Zavolan, M., Tuschl, T. PAR-CliP - A Method to Identify Transcriptome-wide the Binding Sites of RNA Binding Proteins. J. Vis. Exp. (41), e2034, doi:10.3791/2034 (2010).

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