PAR-Klip - RNA Cilt Proteinler Transcriptome geniş Cilt Siteleri Belirlemek Amacıyla Bir Yöntem

Summary

RNA transkript trans etkili RNA bağlayıcı proteinler (RBPs) çok sayıda aracılığı ile geniş posttranskripsiyonel düzenlemeye tabidir. Burada hassas ve transcriptome geniş bir ölçekte RBPs, RNA bağlayıcı siteleri tanımlamak için genellenememektedir bir yöntem mevcut.

Abstract

RNA transkript yüzlerce RNA bağlayıcı proteinler (RBPs) ve microRNA içeren, genellikle bağımlı bir hücre tipi ifade ribonükleoprotein kompleksleri (miRNPs) ile etkileşim transkripsiyon sonrası gen düzenlemeye tabi Anlamak için bu RNA bağlayıcı faktörlerin etkileşimi bireysel transkript, in vivo protein-RNA etkileşimleri ¹ gerekli olan yüksek çözünürlüklü haritalar yönetmelik nasıl etkiler.

Genetik, biyokimyasal ve hesaplama yaklaşımları bir arada genellikle RNA RBP veya RNA-RNP etkileşimleri belirlemek için uygulanır. Immunopurified RBPs ile ilişkili RNA'lar mikroarray (RIP-Chip) ² transcriptome bir seviyede hedefler tanımlar, ancak uygulaması, kinetik istikrarlı etkileşimler ve sadece nadir ^durumlarda 3,4 RBP tanıma elemanı (RRE tanımlamanıza olanak sağlar karakterizasyonu ile sınırlıdır Uzun hedef RNA içinde). Daha doğrudan RBP hedef site bilgileri, in vivo UV ^crosslinking 5,6 çapraz RNA segment ve cDNA sıralama ^(CLIP) 10 izolasyonu takip ^{immunoprecipitation} 7-9 ile birleştirerek elde edilir . CLIP ^11-17 RBPs bir takım hedefleri tanımlamak için kullanılır oldu. Ancak UV 254 nm RNA-protein çapraz bağlanma, düşük verimlilik, CLIP sınırlıdır ve çapraz bağ yerini zor arka planı olmayan-çapraz UV-çapraz hedef RNA segmentlerinde ayrı, sıralı çapraz parçaları içinde kolayca tanımlanabilir. RNA aynı zamanda örnek mevcut parçaları.

Biz, yüksek çözünürlük ve hücresel RBPs ve miRNPs transcriptome çapında bağlayıcı siteleri belirlemek için güçlü bir hücre tabanlı crosslinking yaklaşım geliştirdi ki dönem PAR-Klip (Photoactivatable ribonükleozit-Geliştirilmiş Crosslinking ve Immunoprecipitation) (Şekil 1A anahat yöntemi). Bu yöntem, canlı hücreler tarafından 4-thiouridine (4-SU) ve 6-thioguanosine (6-SG) olarak photoreactive ribonükleozit analogları, doğmakta olan RNA transkript içine eklenmesi dayanmaktadır. 365 nm UV ışık hücreleri tarafından Işınlama etkileşim RBPs photoreactive nükleozid etiketli hücresel RNA'lar verimli crosslinking neden olur. Ilgi RBP Immunoprecipitation çapraz ve coimmunoprecipitated RNA izolasyonu ile takip edilmektedir. Izole RNA, cDNA kütüphanesi dönüştürülür ve derin Solexa teknoloji kullanarak sıralı. CDNA kütüphaneleri PAR-Klip tarafından hazırlanan bir karakteristik özelliği de crosslinking kesin konumunu sıralı cDNA ikamet eden mutasyonların tespit edilebilir olmasıdır. sitidinin geçiş mutasyonlar adenozin guanozin 6-SG sonuçlarını kullanarak ise 4-SU kullanarak, çapraz dizileri timidin,. Çapraz dizileri mutasyonların varlığı mümkün bol hücresel RNA'lar türetilen dizilerinin arka plan onları ayırmak için yapar.

Çeşitli RNA bağlayıcı proteinler bir dizi yöntem Uygulama Hafner ve ark bildirilmiştir. ¹⁸

Protocol

Aşağıdaki protokol HEK293 hücreleri ifade BAYRAK / doksisiklin ile indüksiyon üzerine IGF2BP1 HA-etiketli PAR-Klip prosedürü açıklamaktadır. Biz anti-BAYRAK antikor immunoprecipitation için kullanacaktır.

PAR-Klip immunoprecipitation için etkin bir antikor varsa, herhangi bir hücre hattı ilgi RNA bağlayıcı protein (RBP) etiketsiz endojen saptanabilir düzeyleri, ifade çalışacaktır.

Genişleyen Hücreler

1. Besi FlpIn-HEK293/TO/FLAG/HA-IGF2BP1 hücreleri genişletin. Biz 100-400 x 10 ⁶ hücre (yaklaşık 10-40 15 cm hücre kültürü plakaları) arasında bir başlangıç ​​noktası olarak kullanmanızı öneririz. Yaklaşık% 80 confluency büyütün.
2. Crosslinking 14 saat önce doğrudan hücre kültür ortamına 100 mcM bir final konsantrasyonu ((1:1000) 1 M 4-thiouridine stok solüsyonu v / v) a) 4-thiouridine eklemek ve b) BAYRAK / HA ifadesi neden doksisiklin (10 mg / ml doksisiklin stok solüsyonu 1:10,000 v / v) 1 mcg / ml ilave edilerek IGF2BP1 etiketli. NOT: 4-thiouridine yerine 6-thioguanosine 100 mcM kullanabilirsiniz.

UV-Crosslinking

1. Plaka başına 10 ml buz gibi soğuk PBS ile hücreler bir kez yıkayın ve tamamen kaldırmak PBS.
2. Buz ve Stratalinker 2400 0.15 J / cm ² 365 nm UV ışığı (Stratagene) veya benzeri bir cihaz ile ortaya çıkarılan ışın tedavisi ile bir tepsi yerleştirin plakalar.
3. Plaka, 50 ml santrifüj tüplerine transferi başına 1 ml PBS içinde lastik bir polis memuru ile hücreleri kazıyın ve 4 ° C'de 5 dakika boyunca 500 xg'de santrifüj yoluyla toplamak ve supernatant atın. 100 x 10 ⁶ HEK293 hücreleri (10 x 15 cm plakaları) yaklaşık verecektir. Islak hücre pelet 1 ml.
4. (Isteğe bağlı) hücre parçalama ile doğrudan devam etmek istemiyorsanız, şok -80 sıvı azot ve mağaza hücre pelletini ° C dondurmak Hücre pelletleri en az 12 ay süreyle saklanabilir.

Hücre parçalama ve RNaseT1 sindirimi

1. 1x NP40 lizis tamponu 3 cilt halinde çapraz hücreleri hücre pelletini alın ve 10 dakika buz üzerinde inkübe.
2. 15 dakika 13.000 xg'de santrifüj 4 Berrak hücreli lizat ° C
3. 0.2 mikron membran şırınga filtresi (Pall Acrodisc veya eşdeğeri) üzerinden filtreleme lizat temizleyin.
4. 1 U / ul ve 15 dakika için bir su banyosunda inkübe at 22 ° C arasında nihai bir konsantrasyona RNaz T1 (Fermentas, 10.000 U / ml) Devam etmeden önce 5 dakika boyunca buz üzerinde sonradan Cool tepki.

Immunoprecipitation kurtarma ve çapraz hedef RNA parçaları

Manyetik ayırıcı

Manyetik boncuklar kurumasını önlemek için numune hazırlama boyunca bu yönergeleri izleyin.

1. 1 2 dakika boyunca manyetik standında boncuklar içeren tüp yerleştirin.
2. Tüp tüp manyetik ayırıcı açıkken tampon ekleyin.
3. Tüp kapağı, manyetik ayırıcı kaldırmak ve boncuklar tekrar süspansiyon. Tüp parmağınızla hafifçe vurarak boncuklar tekrar süspansiyon veya 5 6 vortexer kullanabilirsiniz.
4. Tüp kap kalır herhangi bir boncuk toplamak için kısaca santrifüjleyin.
5. Gerektiği gibi 1 ile 4 arasındaki adımları tekrarlayın.

Manyetik boncuk hazırlanması

1. 10 ul (Invitrogen) Dynabeads Protein G manyetik partiküller ml başına hücre lizat Devret (olması gereken tipik bir deney için yaklaşık 40 50 boncuk ul) 1.5 ml mikrofuge'de tüp. Boncuk iki kez 1 ml sitrat-fosfat tamponu ile yıkayın.
2. Sitrat-fosfat tamponu boncuk süspansiyonu orijinal hacmine göre iki kat daha fazla hacim olarak yeniden süspanse edin.
3. 0.25 mikrogram anti-BAYRAK M2 monoklonal antikor (Sigma), oda sıcaklığında 40 dakika süreyle dönen bir tekerlek başına ml süspansiyon ve inkübe ekleyin.
4. Bağlanmamış antikor kaldırmak için 1 ml sitrat-fosfat tamponu boncuk iki kez yıkayın.
5. Boncuk boncuk süspansiyonu orijinal hacmine göre sitrat-fosfat tamponu iki kez hacmi tekrar

Immunoprecipitation (IP), ikinci RNaz T1 sindirim, ve Defosforilasyon

1. 20 ml başına kısmi RNaz T1 tedavi hücre lizat taze hazırlanmış antikor konjuge manyetik boncuk ul ekleyin ve 4, 1 saat için dönen bir tekerlek üzerinde 15 ml santrifüj tüpleri inkübe ° C
2. 15 ve 50 ml santrifüj tüpleri (Invitrogen) bir manyetik parçacık toplayıcı manyetik boncuk toplayın ve 1,5 ml mikrofuge'de tüpler transfer.
3. IP yıkama tamponu 1 ml boncuk, 3 kere yıkayın.
4. 100 U / ml bir final konsantrasyon RNaseT1 (Fermentas, 10.000 U / ml) ekleyin ve 15 dakika süreyle su banyosunda 22 boncuk süspansiyon inkübe ° C. Buz üzerinde daha sonra soğutun5 dk.
5. 1 ml yüksek tuz yıkama tamponu boncuk, 3 kere yıkayın.
6. Defosforilasyon tampon 1 hacmi içinde süspanse edin boncuk
7. 0.5 U / ml nihai konsantrasyonu buzağı intestinal alkalen fosfataz (CIAP NEB) ekleyin ve 10 dakika süreyle askıya inkübe 37 ° C
8. Fosfataz yıkama tamponu 1 ml boncuk iki kez yıkayın
9. DTT (DTT konsantrasyonu enzimatik reaksiyon için gerekli olan manyetik boncuklar zarar verecek kadar yüksek) olmadan iki kez polinükleotid kinaz (PNK) tampon boncuk yıkayın.
10. PNK tampon bir orijinal boncuk hacmi yeniden süspanse boncuk

Immunoprecipitated proteinlerin çapraz RNA segmentleri, Radyoaktif

1. Yukarıda açıklanan boncuk süspansiyonu, tek bir özgün boncuk hacmi 1 U / ul 0.5 μCi / ml ve T4 PNK nihai konsantrasyonu (NEB) ^Υ-32 P-ATP eklemek . 37 30 dakika süspansiyon inkübe ° C
2. 100 mcM son bir konsantrasyon elde etmek ve 37 başka bir 5 dakika boyunca inkübe non-radyoaktif ATP ° C
3. DTT olmadan PNK tampon 800 ul manyetik boncuk 5 kez yıkayın.
4. SDS-PAGE yükleme tamponu 70 ul boncuk süspanse edin.

SDS-PAGE jel dilimleri ve çapraz RNA-protein kompleksleri, electroelution

1. Radyoaktif süspansiyon bir ısı bloğu 5 dakika 95 ° C'de denatüre ve çapraz bağlı RNA ve vorteks immunoprecipitated RBP bırakın.
2. Ayırıcı manyetik boncuk çıkarın ve temiz bir 1.5 ml mikrofuge'de tüp süpernatantı transfer.
3. 40 süpernatantı ul için iyi bir Novex Bis-Tris% 4-12 (Invitrogen) prekast poliakrilamid jel yerleştirin ve 55 dakika süreyle 200 jel çalıştırmak V.
4. Jel odasının sökün ve bir plaka üzerine monte bırakarak, jel sökmeye. Phosphorimager kağıt çıktısı jel uyum kolaylaştırmak için, jel dört bir köşesinden üç asimetrik üç küçük radyoaktif jel parçaları implante tavsiye ederiz. Radyoaktif jel parçaları önceden radyoaktif sentetik oligonükleotidler arındırmak için kullanılan jeller toplanabilir. Kontaminasyonu önlemek için plastik film (örneğin, Saran wrap) jel sarın.
5. 1 saat blanked phosphorimager ekran jel ortaya çıkarmak ve bir phosphorimager görselleştirmek.
6. Yönelim implante jel parçaları kullanılarak phosphorimager çıktının üst jel hizalayın. RBP beklenen boyutu (IGF2BP1, yaklaşık 75 kDa) karşılık gelen ve D-Tube diyalizer Midi Tüp transfer ve 800 ul 1x SDS çalışan tampon bantları kesin.
7. 2 saat için 100 V tampon çalışan 1x SDS çapraz RNA RBP kompleksi Electroelute jel eksize ve üreticinin talimatlarına göre 800 ul SDS çalışan tampon D-Tube diyalizer Midi (Novagen) electroeluted.

Proteinaz K sindirimi

1. Proteinaz K (Roche), son konsantrasyonu 1.2 mg / ml 'lik bir ek tarafından takip electroeluate açısından eşit bir ses, 2x Proteinaz K Tampon ekleyin. 55 az 30 dakika boyunca inkübe ° C.
2. Asidik fenol / kloroform / IAA çıkarımı (25:24:1, pH 4.0), kloroform ekstraksiyon takip RNA kurtarın. 1 ul glikojen (10 mg / ml stok) 3 hacim etanol eklenerek RNA hızlandırabilir. Pelet 10.5 ul suda eritin.

cDNA kütüphanesi hazırlama ve derin sıralama

Başlangıçta küçük düzenleyici RNA'lar ¹⁹ klonlama açıklanan standart bir cDNA kütüphanesi hazırlık protokolü aracılığıyla kurtarılan RNA taşır. Kurtarılan RNA 10.5 ul kullanarak 20 ul ölçekte açıklandığı gibi ilk adım, 3 'adaptörü ligasyonu, gerçekleştirildi. Solexa sıralama adaptörü açıklanan ayarlar kullanın. Iyileşti RNA miktarını bağlı olarak, ekler olmadan 5'-adaptör-3'-adaptör ürünleri, ek PCR bantları gibi cDNA amplifikasyonu sonra tespit edilebilir. Bu gibi durumlarda, beklenen büyüklüğü% 3 NuSieve uzun PCR ürününün tüketim düşük erime noktası agaroz jel, Solexa teknolojisini kullanarak GelElute kiti (Qiagen) ve sırası ile jel parçalarından PCR ürünü Zehir. Bir Solexa sıralama çalıştırmak genellikle sırası 6 ve 10 milyon arasında tanıyor, RNA bağlayıcı proteinlerin bağlanma yerleri bir transcriptome geniş kapsama alanı için yeterli olduğunu okur.

Biyoinformatik analizi

Dikkatli biyoinformatik analiz dizisi dizisi vs çevrilmemiş kodlama ihtiyaçlarına incelenen RBP, RNA tanıma elemanı, RBP tercih edilen bağlayıcı bölgeleri (exonic vs intronik gibi RNA bağlayıcı siteleri, anlamlı anlayışlar elde etmek için yapılması gereken okur dizisi). Okuma sırası genom ve EST veritabanlarının karşı uyumlu hale getirilmesi gerekir. Biz genellikle okuma mappibir uyumsuzluk, ekleme veya silme sırası kümeleri oluşturmak için benzersiz genom ng daha sonra analiz edilebilir okur. Kümelenmiş sıralı frekans karakteristik mutasyonlar, C geçişler 6-SG kullanırken bir geçişler 4-SU ve G kullanırken, T okur başarıyla çapraz dizilerinin göstergesidir. Bizim tecrübelerimize göre bir arka plan mutasyon oranı yaklaşık% 20 4-SU ile etiketlenmiş uncrosslinked RNA'lar göstermektedir. Bu oran yaklaşık artar. Crosslinking üzerine% 50-80.

Biyoinformatik analizi ayrıntılı bir açıklama Hafner ve arkadaşları tarafından yayın Ek malzeme bulundu. ¹⁸

İsteğe bağlı adımlar

Toplam RNA içine 4-thiouridine dahil düzeylerinin belirlenmesi

100 mcM hasattan önce 4SU 16 saat ile desteklenmiş ortamda büyüyen sonra stabil bir şekilde ilgi RBP ifade hücre hattı toplam RNA izole edin. Kontrol olarak, hasat hücreler 4SU ilave edilmeden büyüdü. Ayrıca üreticinin talimatlarına izleyerek yıkanmış hücre granül Trizol reaktifi (Sigma) 3 cilt toplam RNA izole edin. Ayrıca üreticinin protokole göre Qiagen RNeasy kullanarak toplam RNA arındırmak oldu. 4SU, RNA izolasyonu ve analizi sırasında oksitlenmeyi önlemek için, yıkama tamponları ve enzimatik adımdan sonraki 0.1 mM dithiothreitol (DTT) ekleyin. Digest ve HPLC analizi için tek nükleosidlerin A'ya defosforilize toplam RNA ²⁰ önce nitelendirdi. Kısaca, 30 ul hacmi, 37, 16 saat, toplam RNA saflaştırılmış 40 mikrogram idi inkübe ° C 0.4 U bakteriyel alkalin fosfataz (Biyokimyasal Worthington) ve 0.09 U yılan zehiri fosfodiesteraz (Worthington Biyokimyasal). Bir referans standart olarak, 4SU etiketli sentetik RNA (standart CGUACGCGGAAUACUUCGA (4SU) U) ve enzimatik sindirimi tamamlamak için maruz kullanın. Bir Supelco Discovery C18 (gümrüklü faz silika 5 mcM parçacık, 250 x 4.6 mm) ters faz kolon (Bellefonte PA, USA) HPLC ile ribonucleosides çıkan karışımları ayırın. HPLC tamponlar% 3 asetonitril (A) ve% 90 su asetonitril (B) 0,1 M TEAA. 15 dakika, 20 dakika 0 -% 10 B, 30 dakika 10 ila% 100 B: 0% B izokratik degrade kullanın. Arasında uygulanan yıkama HPLC kolon temizlemek için çalışan bir 5 dakika% 100 B uygulayın.

Temsilcisi Sonuçlar

Şekil 1 (sağ panel) hücre hatları BAYRAK / 4-SU ve 6-SG ile IGF2BP1 HA etiketli ifade ile yapılan bir PAR-Klip temsili bir sonuç göstermektedir. IGF2BP1 6-SG crosslinking verimliliği 4-SU crosslinking verimliliği daha düşük olduğunu unutmayın. Düşük crosslinking verimliliği daha yüksek bir arka planda bol hücresel RNA parçaları elde dizilerinin neden olacaktır ve bu nedenle daha az verimli photoreactive nükleosidlerin kullanırken deneme ölçeklendirme düşünmelisiniz.

Şekil 1 sol panelindeki potansiyel geleneksel UV 254 nm crosslinking göre PAR-Klip için kullanılan olabilir farklı photoreactive üridin analogları kullanarak bir karşılaştırma gösterir.

Doğru uzunlukta radyoaktif bant yoğunluğu PAR-Klip deney küçük bir RNA sıralama protokolü (küçük cDNA kütüphanesi hazırlamak için adım adım açıklaması ile çalıştı ve taşımak için yeterli RNA izole olup olmadığını iyi bir fikir verir RNA'lar sıralama) ¹⁹ bulunabilir. 6-SG kullanarak bir geçişler 4-SU ve G ile C geçişler için sıralı okuma, T karakteristik mutasyonlar, frekans, başarılı bir şekilde çapraz dizilerinin göstergesidir. Bizim tecrübelerimize göre bir arka plan mutasyon oranı yaklaşık% 20 4-SU ile etiketlenmiş uncrosslinked RNA'lar göstermektedir. Bu oran yaklaşık artar. Crosslinking üzerine% 50-80.

Materials

Buffers and reagents

Growth medium HEK293 cells

DMEM 10% FBS 2 mM L-Glutamine 100 U/ml penicillin 100 U/ml streptomycin 100 μg/ml hygromycin 15 μg/ml blasticidin

4-thiouridine stock solution (1 M)

260.27 mg 4-thiouridine 1 ml DMSO

Doxycyclin stock (10 mg/ml)

10 mg doxycyclin 1 ml DMSO

1x NP40 lysis buffer

Prepare a stock of 5x buffer without DTT and protease inhibitors. Add DTT and protease inhibitor directly before the experiment.

50 mM HEPES, pH 7.5 150 mM KCl 2 mM EDTA 1 mM NaF 0.5% (v/v) NP40 0.5 mM DTT complete EDTA-free protease inhibitor cocktail (Roche)

Citrate-Phosphate buffer

4.7 g/l citric acid 9.2 g/l Na2HPO4 pH 5.0

IP-wash buffer

50 mM HEPES-KOH, pH 7.5 300 mM KCl 0.05% (v/v) NP40 0.5 mM DTT (add directly before experiment) complete EDTA-free protease inhibitor cocktail (Roche) (add directly before experiment)

High-salt wash buffer

50 mM HEPES-KOH, pH 7.5 500 mM KCl 0.05% (v/v) NP40 0.5 mM DTT (add directly before the experiment) complete EDTA-free protease inhibitor cocktail (Roche) (add directly before the experiment)

Dephosphorylation buffer

50 mM Tris-HCl, pH 7.9 100 mM NaCl 10 mM MgCl2 1 mM DTT

Phosphatase wash buffer

50 mM Tris-HCl, pH 7.5 20 mM EGTA 0.5% (v/v) NP40

Polynucleotide kinase (PNK) buffer without DTT

50 mM Tris-HCl, pH 7.5 50 mM NaCl 10 mM MgCl2

PNK buffer

50 mM Tris-HCl, pH 7.5 50 mM NaCl 10 mM MgCl2 5 mM DTT

SDS PAGE loading buffer

10% glycerol (v/v) 50 mM Tris-HCl, pH 6.8 2 mM EDTA 2% SDS (w/v) 100 mM DTT 0.1% bromophenol blue

2x Proteinase K buffer

100 mM Tris-HCl, pH 7.5 150 mM NaCl 12.5 mM EDTA 2% (w/v) SDS