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Biology

Chemotaktische Reaktion der marinen Mikroorganismen zu Micro-Scale Nutrient Layers

doi: 10.3791/203 Published: May 28, 2007

Summary

Die Herstellung von mikrofluidischen Kanälen und deren Umsetzung in Experimenten zur Untersuchung der chemotaktischen Jagdverhalten von marinen Mikroben innerhalb eines lückenhaft Nährstoff seascape und das Schwimmverhalten der Bakterien innerhalb Scherströmung beschrieben sind.

Abstract

Der Grad der planktonischen Mikroben mikroskaligen Ressource Patches nutzen können, haben erhebliche Auswirkungen auf ozeanischen trophodynamics und biogeochemischen Fluss. Doch die Vorteile der Nährstoff-Patches in den Ozean, Schwimmen Mikroben müssen die Einflüsse der physischen Kräfte, einschließlich der molekularen Diffusion und turbulente Scherung, die die Verfügbarkeit von Patches und die Fähigkeit der Bakterien, um sie ausfindig zu begrenzen überwinden. Bis vor kurzem haben methodische Einschränkungen direkten Untersuchungen der mikrobiellen Verhalten innerhalb lückenhaft Lebensräume und realistische kleinen Strömungsverhältnisse ausgeschlossen. Daher hat viel von unseren derzeitigen Kenntnissen in Bezug auf mikrobielle Verhalten in den Ozean von den theoretischen Vorhersagen wurden beschafft. Um neue Informationen über mikrobielle Jagdverhalten in den Ozean wir weichen lithographischen Herstellungstechniken angewendet haben bis 2 mikrofluidischen Systemen, die wir zur Erstellung haben (i) mikroskaligen Nährstoff-Patches mit den Abmessungen und diffusive relevanten Eigenschaften ozeanischer Prozesse und (ii) mikroskaligen entwickeln zu erhalten Wirbel mit Scherraten entsprechend denen in den Ozean erwartet. Diese mikrofluidischen Bauteilen haben eine erste direkte Untersuchung der mikrobiellen Schwimmen und chemotaktische Verhalten innerhalb einer heterogenen und dynamischen seascape gestattet. Der kombinierte Einsatz von Epifluoreszenz und Phasenkontrast-Mikroskopie erlauben den direkten Untersuchungen der physikalischen Abmessungen und diffusive Eigenschaften der Nährstoff-Patches, unter Beachtung der Bevölkerung Ebene aggregative Reaktion, zusätzlich zu den Swimming-Verhalten der einzelnen Mikroben. Diese Experimente haben gezeigt, dass einige Arten von Phytoplankton, heterotrophen Bakterien und phagotrophic Protisten geschickt im Auffinden und die Nutzung diffundierende mikroskaligen Ressource Patches innerhalb sehr kurzer Fristen sind. Wir haben auch gezeigt, dass bis zu Schergeschwindigkeiten moderate sind marinen Bakterien in der Lage, den Fluss und schwimmen durch ihre Umwelt aus eigenem Antrieb zu kämpfen. Doch jenseits einer Schwelle hohe Scher-Ebene, sind die Bakterien in der Scherströmung ausgerichtet sind und weniger in der Lage zu schwimmen, ohne Störung durch den Fluss. Mikrofluidik steht für ein neuartiges und kostengünstigen Ansatz für die Untersuchung aquatischer mikrobielle Ökologie, und aufgrund ihrer Eignung für die genaue realistische Strömungsfelder und Substratgradienten im Mikrobereich, ist ideal für Untersuchungen der mikrobiellen Verhalten bei der kleinsten Skalen der Interaktion. Wir schlagen daher vor, dass Mikrofluidik ein wertvolles Instrument für die Erlangung eines besseren Verständnisses der Ökologie von Mikroorganismen im Meer darstellt.

Protocol

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Vorbereitung

1. Erstellen Sie eine Maske

Mit Hilfe eines CAD-Software, Design der Kanal für den hochauflösenden Druck auf Transparenz. Dies wird die "Maske" werden.

Im Reinraum:

2. Saubere und backen den Wafer

Zuerst spritzt der Wafer mit Aceton, dann schnell mit Methanol, dann mit Isopropanol. Zum Schluß wird der Wafer mit Stickstoff.

Backen Sie die Wafer in den Ofen (130 ° C) für 5 min.

3. Die Beschichtung der Wafer

Legen Sie die Wafer in der Mitte der Spin-Coating-Maschine. Gießen Photolack (SU-8) aus der Flasche auf den Wafer. Lassen Sie die SU-8 fließen und entspannen Sie sich für ~ 10 s. Schalten Sie den Spin-Coater und Rampe seine Geschwindigkeit bis 0 bis 500 Umdrehungen pro Minute mehr als 5 s; halten bei 500 rpm für 10 s; Rampe bis zur endgültigen Geschwindigkeit über 10 s und unterhalten auf Endgeschwindigkeit für 30 s. Die Endgeschwindigkeit hängt von der gezielten Schichtdicke und dem SU-8 verwendet. Die Details finden Sie unter http://www.microchem.com/

4. Soft-backen

Nach der Beschichtung der Wafer, backen sie zunächst bei 65 ° C und dann bei 95 ° C. Die Backzeit variiert mit gezielten Dicke und Art des verwendeten Photolack. Dann lassen Sie den Wafer bei Raumtemperatur stehen lassen für mindestens 5 min.

5. Belichtung

Legen Sie die Maske auf dem Wafer und setzen die Wafer mit UV-Licht für die Zeit in der SU-8 Bedienungsanleitung empfohlen.

6. Post-Exposure Bake

Backen Sie die Wafer bei 65 ° C und dann 95 ° C im Anschluss an die SU-8 Beschreibung in der Bedienungsanleitung.

7. Die Entwicklung der Wafer auf die "Master" (Schimmel) zu erhalten

Bereiten Sie ein Becherglas mit dem Entwickler (PMMA) ausgefüllt. Tauchen Sie die Wafer in den Becher, während sehr sanft schwingenden das Becherglas, bis die unbelichteten Teil der Fotolack wird weggespült.

In unserem Labor:

8. Bereiten PDMS und gieße es auf den Wafer

Mischen Sie die PDMS mit seinen Härter im Verhältnis 10:1 in eine Tasse. Umrühren und mischen Sie es homogen: Dies wird viele Blasen zu erzeugen und die Mischung Blick undurchsichtig. Gießen Sie die Mischung auf dem "Master".

9. De-Blase in der Vakuumkammer

Zum Entfernen der Blasen, legte der Meister und PDMS-Mischung, die für sie in einer Vakuumkammer, bis alle Luftblasen verschwunden sind.

10. Backen im Ofen

Backen Sie für mindestens 12 Stunden in einem Ofen bei 65 ° C zum Aushärten des PDMS.

11. Lochen

Ziehen Sie das PDMS von der Master-und Lochung für Ein-und Auslässe der Kanäle.

Im Reinraum (nicht abgebildet)

12. Plasma Bindung

Die Kanäle werden auf einem Glasträger nach der Behandlung sowohl die PDMS-Schicht und der Objektträger aus Glas mit Sauerstoff-Plasma für 1 min verbunden.

Experimente:

Exp # 1: Untersuchung der chemotaktischen Reaktion der marinen Mikroben zu Mikro-Maßstab Nährstoff-Schichten

1) Einrichten des Tests

  1. Add Organismen und Substrate Glasspritzen
  2. Legen Sie mikrofluidischen Kanal auf Mikroskop-Bühne und legen Schläuche, geeignete Ein-und Auslässe
  3. Die Leitungen zum Speicher verschwenden. Stellen Sie sicher, Schlauch vollständig in der Flüssigkeit in Abfallbehälter untergetaucht, um Druckschwankungen zu vermeiden
  4. Legen Spritzen auf Spritzenpumpe und die Ventile und Schläuche verbinden
  5. Set up Mikroskop: Lichtverhältnisse, Vergrößerung, etc.
  6. Konzentrieren Sie sich auf entsprechende Position in den Kanal
  7. De-bubble-Kanal mit größeren Spritze mit künstlichem Meerwasser gefüllt
  8. Festlegen geeigneter Durchflussrate auf Spritzenpumpe. In diesem Fall 2 ml / min, was einer mittleren Strömungsgeschwindigkeit von 220 um s -1 entspricht in den Kanal

2) Ausführung des Experiments

  1. Starten Spritzenpumpe ein Nährstoff-Gradienten in den Kanal zu etablieren
  2. Sobald flow hat sich stabilisiert und eine Bande von Nährstoffen entwickelt hat, stoppen Sie den Fluss auf die Spritzenpumpe und beginnt die Aufnahme an diesem Punkt
  3. Nutrient Band beginnt seitlich diffuse
  4. In regelmäßigen Zeitabständen, verwenden Bildanalyse-Software, um Sequenzen von Bildern aufnehmen zu "Filme" zu schaffen
  5. Diskriminieren Schwimmen Organismen, indem sie Zeit-Differenz Bilder zwischen zwei aufeinander folgenden Frames, so dass nur bewegte Objekte sind nun sichtbar, so dass wir bewegliche Zellen aus nicht-bewegenden Teilchen und Hintergrundgeräuschen unterscheiden
  6. Nehmen Sie Filme auf Positionen von Zellen in den Kanal mit Verweis auf die p bestimmenosition des Nährstoffs Patch
  7. Nehmen Sie die Videos in regelmäßigen Abständen für 10-20 min zur Analyse der Positionen und Schwimmen Muster von Organismen
  8. Mit Hilfe der Bildanalyse-Software, um die Positionen von Organismen in verschiedenen Frames (Zuordnung, die jedem Pixel die maximale Lichtintensität in diesem Pixel über die Dauer des Films aufgezeichnet) überlagern, können wir Flugbahn Informationen zum Schwimmen Zellen zu erhalten

Exp # 2: Untersuchung der Auswirkungen der Scherung auf marinen Bakterien schwimmen in einem vortexZ

  1. Mit verschiedenen Kanalgeometrie, können wir beobachten das Verhalten von Bakterien schwimmen in einem Wirbel bei unterschiedlichen Schergeschwindigkeiten

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Discussion

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Ein Verständnis davon, wie marine Mikroben Interaktion mit den lokalen chemischen und physikalischen Umwelt ist für eine vollständige und genaue Wahrnehmung der Rolle der planktonischen Mikroorganismen in den Ozeanen Nährstoff-und Kohlenstoff-Zyklen (Azam und Malfatti 2007) unbedingt erforderlich. Aufgrund der kleinen Skalen (<mm), über die viele wichtige mikrobielle Interaktionen stattfinden, technischen Einschränkungen haben detaillierte Untersuchungen der mikrobiellen Verhalten innerhalb der heterogenen bio-physikalisch-chemischen Landschaft verhindert voraussichtlich um Schwimmen Mikroben im Meer erlebt werden. Jüngste Fortschritte in der Mikrofluidik (Whitesides et al. 2001) haben detaillierte Analysen der mikrobiellen Ökologie innerhalb komplexer Mikrohabitate aktiviert (Mao et al. 2003, Park et al. 2003, Keymer et al. 2006, Marcos und Stocker 2006). Die mikrofluidischen Bauteilen hier beschriebenen uns erlaubt, sowohl die chemotaktische Reaktion der marinen Mikroben zu einer Verbreitung von Nährstoff-Patch zu untersuchen (Blackburn et al. 1997, 1998) und das Schwimmverhalten von Mikroben in turbulenten Scher, in einer einzelnen Zelle Ebene.

Die weichen lithographischen Herstellungsprozess bei der Herstellung der mikrofluidischen Kanälen beteiligt ermöglicht komplizierten Details innerhalb des Channel-Architektur erstellt werden, ermöglichen die präzise Steuerung der Migrationsströme und Gradienten innerhalb der Kanäle. Flexibilität durch die Herstellungstechnik geboten ermöglicht Kanäle in verschiedenen Größen für vergleichende Studien erstellt werden. Die Bildanalyse-System angewendet hier ermöglicht die Visualisierung der einzelnen Zellen und Nährstoff-Gradienten, eine Plattform für die detaillierte quantitative Analyse mikrobieller Schwimmen und chemotaktische Verhalten sowohl auf Single-Cell-und der Ebene der Bevölkerung.

Wir haben diese mikrofluidischen Kanal als sensibles Chemotaxis-Assay für eine Vielzahl von Baden Meeresmikroben angewendet und haben festgestellt, dass viele Arten in der Lage schnell zu reagieren, um eine Streuscheibe Patch von Nährstoffen sind, bilden dichte Ansammlungen von Zellen innerhalb des hohen Nährstoff-Konzentrationen in den Patch. Während der chemotaktischen Ansammlung von Zellen innerhalb des Nährstoff-Patch wurden einige Arten zeigten auch Verhaltens-Veränderungen, einschließlich Änderungen im Schwimmen Geschwindigkeit und Dreh-Frequenz markiert. Unsere Beobachtungen liefern experimentelle Unterstützung für die Hypothese, dass Meeresmikroben kurzlebige Nährstoff-Patches in den Ozean als wichtigen Wachstumsmarkt Lebensräume zu nutzen.

Mit verschiedenen Kanalgeometrie, sind wir in der Lage, stabile Mikrowirbeln auf Skalen relevante mikrobielle Dynamik in der aquatischen Umwelt zu erzeugen. Dieser Aufbau ermöglicht es uns, das Verhalten von Bakterien schwimmen in Reaktion auf verschiedene Schergeschwindigkeiten zu beobachten. Im Gegensatz zu den zufälligen Schwimmen Verhalten unter Nulldurchfluß Zustand, unter dem Einfluss eines starken Scher-, Bakterien folgen beide Stromlinien der Strömung und sind mit ihnen abgestimmt. Dieses Setup bietet wertvolle Einblicke in die grundlegenden Wechselwirkungen zwischen Mikroorganismen und deren strömungstechnische Umwelt.

In jedem dieser Versuche hat Mikrofluidik sich als effektives Werkzeug zur Untersuchung der mikrobiellen Verhalten innerhalb dynamischen Mikrohabitate werden. Mit einer zunehmenden Anerkennung der Bedeutung der mikrobiellen Dynamik in natürlichen Lebensräume sowie neuartige Anwendungen der Mikrofluidik-Technologie, schlagen wir vor, dass die weitere Kopplung von Mikrofluidik mit mikrobiellen Ökologie wird wichtige neue Erkenntnisse ergeben.

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Acknowledgments

Wir möchten Microsystems Technology Laboratories am MIT für die Erlaubnis, Film Teil dieses Video in den Reinraum zu danken.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
PDMS, Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit Dow Corning http://www.ellsworth.com/sylgard.html
SU8-2100 Photoresist MicroChem Corp. www.microchem.com
Nikon Eclipse TE2000-E inverted microscope Microscope Nikon Instruments
PEEK tubing (0.762 mm ID, 1.59 mm OD) Tool Upchurch Scientific www.upchurch.com
Syringes (Luer-Lok Tip) Tool BD Biosciences
Fitting Part P-704-01 Tool Upchurch Scientific To connect tubing to Luer-Lok Tip Syringes
Syringe Pump (PHD 2000 Programmable) Equipment Harvard Apparatus
CCD Camera (PCO 1600) Equipment Cook

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References

  1. Azam, F., Malfatti, F. Microbial structuring of marine ecosystems. Nature Reviews Microbiology. 5, 782-791 (2007).
  2. Blackburn, N., Azam, F., Hagstrom, A. Spatially explicit simulations of a microbial food web. Limnology and Oceanography. 42, 613-622 (1997).
  3. Blackburn, N., Fenchel, T., Mitchell, J. G. Microscale nutrient patches in plankton habitats shown by chemotactic bacteria. Science. 282, 2254-2256 (1998).
  4. Keymer, J. E., Galajda, P., Muldoon, C., Park, S., Austin, R. H. Bacterial metapopulations in nanofabricated landscapes. Proceedings of the National Academy of Science. 103, 17290-17295 (2006).
  5. Mao, H., Cremer, P. S., Manson, M. D. A sensitive, versatile microfluidic assay for bacterial chemotaxis. Proceedings of the National Academy of Science. 100, 5449-5454 (2003).
  6. Marcos,, Stocker, R. Microorganisms in vortices: a microfluidic setup. Limnology and Oceanography: Methods. 4, 392-398 (2006).
  7. Park, S., Wolanin, P. M., Yuzbahyan, E. A., Lin, H., Darnton, N. C., Stock, J. B., Silberzan, P., Austin, R. Influence of topology on bacterial social interaction. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100, 13910-13915 (2003).
  8. Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. Soft lithography in biology and biochemistry. Annual Review of Biomedical Engineering. 3, 335-373 (2001).
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Seymour, J. R., Marcos, Stocker, R. Chemotactic Response of Marine Micro-Organisms to Micro-Scale Nutrient Layers. J. Vis. Exp. (4), e203, doi:10.3791/203 (2007).More

Seymour, J. R., Marcos, Stocker, R. Chemotactic Response of Marine Micro-Organisms to Micro-Scale Nutrient Layers. J. Vis. Exp. (4), e203, doi:10.3791/203 (2007).

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