Summary
La realizzazione di canali di microfluidica e la loro attuazione in esperimenti per studiare il comportamento chemiotattica foraggiamento dei microbi marini all'interno di un paesaggio marino irregolare dei nutrienti e il comportamento di nuoto di batteri all'interno del flusso di taglio sono descritti.
Abstract
Il grado con cui i microbi planctonici possono sfruttare le patch risorsa microscala avrà notevoli implicazioni per trophodynamics oceaniche e flussi biogeochimici. Tuttavia, per sfruttare le patch nutrienti nell'oceano, microbi nuoto devono superare le influenze delle forze fisiche inclusa la diffusione molecolare e turbolenta di taglio, che limiterà la disponibilità di patch e la capacità dei batteri di individuarli. Fino a poco tempo, le limitazioni metodologiche hanno precluso esami diretta del comportamento microbica all'interno di habitat macchia di leopardo e realistico di piccole dimensioni condizioni di flusso. Quindi, gran parte delle nostre attuali conoscenze sul comportamento microbica negli oceani è stata ottenuta da previsioni teoriche. Per ottenere nuove informazioni sul comportamento alimentare microbica in mare abbiamo applicato morbido tecniche di fabbricazione litografica per sviluppare 2 dispositivi microfluidica, che abbiamo usato per creare (i) microscala patch nutrienti con dimensioni e caratteristiche diffusive rilevanti per i processi oceanici e (ii) microscala vortici, con tassi di taglio corrispondenti a quelle previste nel mare. Questi dispositivi microfluidici hanno permesso un primo esame diretto di nuoto microbica e del comportamento chemiotattici all'interno di un paesaggio marino eterogeneo e dinamico. L'uso combinato di epifluorescenza e microscopio a contrasto di fase permette esami diretta delle dimensioni fisiche e le caratteristiche diffusive di patch nutrienti, nel rispetto della popolazione risposta a livello aggregativo, in aggiunta al comportamento di nuoto di microbi individuali. Questi esperimenti hanno rivelato che alcune specie di fitoplancton, batteri e protisti eterotrofi phagotrophic sono abili a individuare e sfruttare le risorse microscala diffondere le patch in tempi molto brevi. Abbiamo inoltre dimostrato che fino a moderati tassi di taglio, batteri marini in grado di combattere il flusso e nuotare attraverso il loro ambiente a loro spontanea volontà. Tuttavia, al di là di un alto livello di soglia di taglio, i batteri sono allineati nel flusso di taglio e sono meno in grado di nuotare senza disturbi dal flusso. Microfluidica rappresenta un approccio nuovo e poco costoso per lo studio dell'ecologia microbica acquatica, e grazie alla sua idoneità con precisione la creazione di campi di flusso e gradienti di substrato realistico alla microscala, è perfettamente applicabile agli esami di comportamento microbica a scale più piccole di interazione. Pertanto suggeriamo che microfluidica rappresenta uno strumento prezioso per ottenere una migliore comprensione dell'ecologia della microrganismi nell'oceano.
Protocol
Preparazione
1. Creare una maschera
Utilizzando un software CAD, la progettazione del canale per la stampa ad alta risoluzione su un lucido. Questa sarà la "maschera".
Nella camera bianca:
2. Pulire e cuocere la cialda
In primo luogo, spruzzare il wafer con acetone, poi rapidamente con metanolo, poi con isopropanolo. Infine, asciugare le fette che utilizzano azoto.
Cuocere i wafer in forno (130 ° C) per 5 min.
3. Rivestimento del wafer
Posizionare il wafer al centro dello spin-coating macchina. Versare photoresist (SU-8) dalla bottiglia sul wafer. Lasciate che il SU-8 di flusso e rilassarsi per circa 10 s. Accendere lo spin-verniciatore e la sua velocità rampa salita da 0 a 500 rpm per 5 s; tenere a 500 rpm per 10 s; rampa fino alla velocità finale di oltre 10 s e mantenere a velocità finale per 30 s. La velocità finale dipende dallo spessore del rivestimento mirati e il SU-8 utilizzati. I dettagli sono disponibili all'indirizzo http://www.microchem.com/
4. Soft-cuocere
Dopo il rivestimento del wafer, cuocere prima a 65 ° C e poi a 95 ° C. Il tempo di cottura varia a seconda dello spessore e del tipo di mirati photoresist utilizzato. Poi, lasciare che il wafer a temperatura ambiente per almeno 5 minuti.
5. Esposizione
Collocare la maschera sulla parte superiore del wafer e di esporre il wafer alla luce UV per il tempo indicato nel SU-8 manuale.
6. Post-esposizione cuocere
Cuocere il wafer a 65 ° C e poi 95 ° C in seguito alla SU-8 manuale di istruzioni.
7. Sviluppare la wafer per ottenere il "master" (muffe)
Preparare un bicchiere riempito con lo sviluppatore (PMMA). Immergere il wafer nel becher mentre molto dolcemente oscillanti il bicchiere fino a quando la parte non esposta del photoresist viene lavato via.
Nel nostro laboratorio:
8. Preparare PDMS e versarlo sul wafer
Mescolare il PDMS con il suo catalizzatore nel rapporto 10:1 in una tazza. Mescolare e mescolare in maniera omogenea: questo genererà un sacco di bolle e di rendere la miscela aspetto opaco. Versare il composto sul "master".
9. De-bolla nel vuoto da camera
Per rimuovere le bolle, ha messo la miscela master e PDMS che si copre in una camera a vuoto fino a quando tutte le bolle sono scomparse.
10. Cottura in forno
Cuocere in forno per almeno 12 ore in un forno a 65 ° C per indurire il PDMS.
11. Perforare
Staccare il PDMS dal master e perforare per ingressi e le uscite dei canali.
In camera bianca (non mostrato)
12. Plasma incollaggio
I canali sono legati ad una lastra di vetro dopo aver trattato sia il livello PDMS e il vetrino con plasma di ossigeno per 1 min.
Esperimenti:
Exp # 1: Indagare la risposta chemiotattica dei microbi marini a strati nutrienti micro-scala
1) Impostare l'esperimento
- Aggiungi organismi e substrati di siringhe di vetro
- Luogo canale microfluidica sul palco microscopio e allegare tubi di ingressi appropriati e le prese
- Collegare il tubo di rifiuti serbatoio. Assicurarsi tubi è completamente immerso nel liquido nel serbatoio dei rifiuti per evitare oscillazioni di pressione
- Siringhe posto sulla pompa a siringa e collegare alle valvole e tubi
- Impostare microscopio: le condizioni di luce, ingrandimento, ecc
- Focus sulla posizione appropriata nel canale
- De-bolla canale usando più grandi siringa riempita con acqua di mare artificiale
- Impostare la velocità di flusso adeguato di pompa a siringa. In questo caso 2 ml / min, che corrisponde ad una velocità di flusso medio di -1 220 micron s nel canale
2) Eseguire l'esperimento
- Avvio pompa a siringa per stabilire un gradiente di nutrienti nel canale
- Una volta che il flusso si è stabilizzata e una banda di sostanze nutritive è sviluppato, fermare il flusso della pompa siringa e iniziare a registrare il tempo da questo punto
- Banda nutrienti comincia a diffondere lateralmente
- A intervalli di tempo regolari, utilizzare software di analisi dell'immagine per registrare le sequenze di fotogrammi per creare 'film'
- Discriminare gli organismi nuoto prendendo tempo-differenza immagini tra due fotogrammi successivi, in modo che solo gli oggetti in movimento sono ora visualizzate, che ci permette di differenziare le cellule mobili da non-particelle in movimento e il rumore di fondo
- Prendete i film per determinare le posizioni di cellule nel canale con riferimento al posizione della patch nutrienti
- Registrazione di filmati ad intervalli regolari di 10-20 minuti per analizzare le posizioni e modelli di nuoto di organismi
- Usando il software di analisi dell'immagine per sovrapporre le posizioni degli organismi a diversi frame (assegnando ad ogni pixel l'intensità massima della luce registrata in quel pixel per tutta la durata del film), possiamo ottenere informazioni traiettoria per le cellule di nuoto
Exp # 2: Indagare gli effetti del taglio sui batteri marini nuotare in un vortexZ
- Utilizzando la geometria canale diverso, siamo in grado di osservare il comportamento dei batteri nuotare in un vortice a diversi tassi di taglio
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Discussion
La comprensione di come i microbi marini interagiscono con i loro chimica locale e l'ambiente fisico è fondamentale per una percezione più completa e precisa del ruolo dei microrganismi planctonici nel nutrienti oceani e cicli di carbonio (Azam e Malfatti 2007). Tuttavia, a causa delle piccole scaglie (mm <) su cui molte interazioni microbiche si svolgono, limitazioni tecniche hanno impedito esami dettagliata del comportamento microbica all'interno dell'eterogeneo bio-fisico-chimiche del paesaggio previsto per essere sperimentato dai microbi nuotare nell'oceano. I recenti progressi nella microfluidica (Whitesides et al. 2001) hanno permesso un'analisi dettagliata di ecologia microbica all'interno di microhabitat complesso (Mao et al. 2003, Park et al. 2003, Keymer et al. 2006, Marcos e Stocker 2006). I dispositivi microfluidici qui descritta ci ha permesso di esaminare sia la risposta chemiotattica dei microbi marini a diffondere una patch nutrienti (Blackburn et al. 1997, 1998) e il comportamento di nuoto di microbi all'interno di taglio turbolento, a livello di singola cellula.
Il processo di fabbricazione morbido litografico connessi a tali canali microfluidica permette di intricati dettagli da creare all'interno dell'architettura di canale, permettendo il controllo preciso dei flussi e gradienti all'interno dei canali. La flessibilità offerta dalla tecnica di fabbricazione permette di canali di varie dimensioni da creare per studi comparativi. Il sistema di analisi delle immagini consente di applicare qui la visualizzazione delle singole cellule e gradienti di nutrienti, che fornisce una piattaforma per l'analisi dettagliata quantitativa di nuoto microbica e del comportamento chemiotattici sia a cella singola e livello di popolazione.
Abbiamo applicato questo canale microfluidica come un test chemiotassi sensibile per una varietà di nuoto microbi marini e hanno trovato che molte specie sono in grado di rispondere rapidamente a una patch diffusione di sostanze nutritive, formando aggregazioni dense di cellule all'interno delle concentrazioni elevate di nutrienti all'interno della patch. Durante l'accumulo chemiotattica di cellule all'interno della patch nutrienti, alcune specie hanno anche mostrato marcati cambiamenti comportamentali, incluse le variazioni di velocità nel nuoto e girando frequenza. Le nostre osservazioni forniscono il supporto sperimentale per l'ipotesi che i microbi marini in grado di utilizzare le patch nutrienti di breve durata nel mare come habitat di crescita importante.
Utilizzando diverse geometrie di canale, siamo in grado di generare microvortices stabile su scale relative alle dinamiche microbiche per l'ambiente acquatico. Questa configurazione ci permette di osservare il comportamento dei batteri nuoto in risposta a diversi gradienti di velocità. In contrasto con il comportamento di nuoto a caso in condizioni di flusso di riposo, sotto l'influenza di un taglio forte, i batteri sia seguire snellisce del campo di moto e sono allineati con loro. Questa configurazione offre informazioni preziose sulla interazione fondamentale tra microrganismi e il loro ambiente fluidodinamici.
In ognuno di questi esperimenti, microfluidica ha dimostrato di essere uno strumento efficace per lo studio del comportamento dinamico microbica all'interno di microhabitat. Con una crescente consapevolezza dell'importanza della dinamica microbica all'interno degli habitat naturali, e nuove applicazioni della tecnologia microfluidica, suggeriamo che l'accoppiamento ulteriore microfluidica con l'ecologia microbica porterà nuove importanti informazioni.
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Acknowledgments
Vorremmo ringraziare Microsystems Technology Laboratories al MIT per averci permesso di parte pellicola di questo video nella struttura camera pulita.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| PDMS, Sylgard 184 | Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | http://www.ellsworth.com/sylgard.html | |
| SU8-2100 | Photoresist | MicroChem Corp. | www.microchem.com | |
| Nikon Eclipse TE2000-E inverted microscope | Microscope | Nikon Instruments | ||
| PEEK tubing (0.762 mm ID, 1.59 mm OD) | Tool | Upchurch Scientific | www.upchurch.com | |
| Syringes (Luer-Lok Tip) | Tool | BD Biosciences | ||
| Fitting Part P-704-01 | Tool | Upchurch Scientific | To connect tubing to Luer-Lok Tip Syringes | |
| Syringe Pump (PHD 2000 Programmable) | Equipment | Harvard Apparatus | ||
| CCD Camera (PCO 1600) | Equipment | Cook |
References
- Azam, F., Malfatti, F. Microbial structuring of marine ecosystems. Nature Reviews Microbiology. 5, 782-791 (2007).
- Blackburn, N., Azam, F., Hagstrom, A. Spatially explicit simulations of a microbial food web. Limnology and Oceanography. 42, 613-622 (1997).
- Blackburn, N., Fenchel, T., Mitchell, J. G. Microscale nutrient patches in plankton habitats shown by chemotactic bacteria. Science. 282, 2254-2256 (1998).
- Keymer, J. E., Galajda, P., Muldoon, C., Park, S., Austin, R. H. Bacterial metapopulations in nanofabricated landscapes. Proceedings of the National Academy of Science. 103, 17290-17295 (2006).
- Mao, H., Cremer, P. S., Manson, M. D. A sensitive, versatile microfluidic assay for bacterial chemotaxis. Proceedings of the National Academy of Science. 100, 5449-5454 (2003).
- Marcos,, Stocker, R. Microorganisms in vortices: a microfluidic setup. Limnology and Oceanography: Methods. 4, 392-398 (2006).
- Park, S., Wolanin, P. M., Yuzbahyan, E. A., Lin, H., Darnton, N. C., Stock, J. B., Silberzan, P., Austin, R. Influence of topology on bacterial social interaction. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100, 13910-13915 (2003).
- Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. Soft lithography in biology and biochemistry. Annual Review of Biomedical Engineering. 3, 335-373 (2001).
