Summary
פרוטוקול להפרדת הקרומים הפנימיים והחיצוניים של
Abstract
Francisella tularensis הוא coccobacillus גראם שליליים תאיים ואת סוכן סיבתי של tularemia המחלה zoonotic. כאשר בהשוואה לפתוגנים חיידקים אחרים, המינון זיהומיות נמוך מאוד (<10 CFU), התקדמות המחלה מהירה, ותחלואה גבוהה ושיעורי תמותה מראים כי זנים אלימים של Francisella לקודד גורמים ארסיות רומן. משטח חשוף מולקולות, חלבונים בממברנה החיצונית כלומר (OMPs), הוכחו לקדם התא המארח חיידקי הכניסה מחייב, הישרדות תאיים, ארסיות והעלמת החיסונית. הרלוונטיות לחקר OMPs מודגשת עוד יותר על ידי העובדה כי הם יכולים לשמש מגן חיסונים נגד מספר מחלות חיידקים. בעוד OMPs ניתן להפיק חיידקים גראם שליליים דרך בתפזורת מיצוי טכניקות קרום, כולל sonication של תאים ואחריו צנטריפוגה ו / או מיצוי חומרי ניקוי, הכנות אלה מזוהמים לעיתים קרובות עם periplasmic ו / או cytoplasmic (פנימי) קרום (IM) מזהמים. במשך שנים, את "תקן הזהב" שיטה להפרדת ביוכימיות biophysical של IM גראם שליליים הקרומים החיצוניים (OM) כבר לחיידקים כפוף תמוגה spheroplasting ו האוסמוטי, ואחריו צנטריפוגה צפיפות סוכרוז הדרגתי. לאחר שכבתית על שיפוע סוכרוז, OMS ניתן להפריד IMS מבוסס על ההבדלים בצפיפות קליל, האמין להיות מבוססת במידה רבה על נוכחות של lipopolysaccharide (LPS) של OM. כאן אנו מתארים שיטה קפדני אופטימיזציה כדי לחלץ, להעשיר, ולבודד פ הקרומים החיצוניים ו tularensis OMPs הקשורים בהם.
Protocol
יום 1: פ tularensis חיסון צלחת
- קפוא פלייט מניות תרבויות פ tularensis על אגר מולר-Hinton בתוספת 2.5% (כרך / כרך) התורם עגל בסרום, 2% (כרך / כרך) IsoVitaleX, 0.1% (wt / כרך) גלוקוז, ו 0.025% (wt / כרך) pyrophosphate ברזל. לגדול פ tularensis ב 37 ° C עם 5% CO 2 למשך כ 24 ח
יום 2: פ tularensis התקשורת חיסון נוזלי
- הכן החיטוי 1 ליטר בינוני מותאם קטיון מולר-Hinton (המכיל 1.23 mM סידן כלוריד dihydrate ו 1.03 מגנזיום כלוריד hexahydrate mM). כאשר מקורר 37 ° C, תוספת בינוני נוסף עם גלוקוז 0.1% (wt / כרך), pyrophosphate ברזל 0.025% (wt / כרך), ו -2% (כרך / כרך) IsoVitaleX. סנן לעקר (0.22 μ) בינוני לתוך aliquots two-500 מ"ל.
- הסרה של 12 מ"ל של מדיום מולר-Hinton בתוספת ולהעביר לתוך צינור סטרילי פלקון 50 מ"ל.
- באמצעות לולאה סטרילי 10-μl חיסון, לגרד loopful גדול של פ tularensis צמיחה של צלחות אגר (מיום 1) וחיידקים להעביר לתוך 12 מ"ל של מולר-Hinton בינוני (ראו שלב 2). פעמים פיפטה פתרון מרובים התפרקות גושים ולהכין ההשעיה חיידקי הומוגנית. אל מערבולת.
- בעזרת פיפטה סטרילית, לחסן כל כלי של 500 מ"ל עם 5 מ"ל של חיידקי השעיה מ שלב 3. לגדול תרבויות מרק ב 37 מעלות צלזיוס במשך 14-18 שעות עם רעד עדין (190-200 סל"ד על ניו ברונסוויק Innova 2300 סדרה שייקר).
יום 3: תמוגה Spheroplasting, אוסמוטי, וצפיפות סוכרוז צנטריפוגה שיפוע
- השג פ תרבויות tularensis מן האינקובטור רועד להסיר aliquot 1-ml מתרבות 500 מ"ל כל אחת כדי לבדוק את צפיפות אופטית, בהתאמה. מצאנו מיצוי אופטימלי קרום תוצאות הבידוד בעת השימוש פ tularensis תאים בשלב מוקדם לוגריתמי של צמיחה, אשר תואמת OD 600 בין 0.2-0.4 (~ 10 יולי - 10 אוגוסט CFU / ml). תרבויות עם 600 OD פחות מ 0.2 לא תניב בכמות מספקת של חומר הממברנה הכולל הדרגתיים סוכרוז הבאים. לעומת זאת, תרבויות עם 600 OD יותר מ 0.4 (מתקרבים לשלב נייח) נמצאו תשואה מעורב קרום fusions.
- צנטריפוגה תרבויות ב 7500 x ג'למשך 30 דקות ב 15 ° C כדי לאסוף את התאים. אנו ממליצים צנטריפוגה של תרבויות בבקבוקים של 250 מ"ל four צנטריפוגות, כי זה מאפשר הבאים ההשעיה גלולה.
- הסר בזהירות את supernatant התקשורת מבקבוק כל צנטריפוגה ובתקיפות הברז בקבוקים על חומר סופג כדי להסיר בינוני צמיחה עודף.
- בתוך 10 דקות לאחר סיום של צנטריפוגה, להשעות כל גלולה חיידקים מ"ל של 8.75 M 0.75 סוכרוז (ב 5 מ"מ טריס, pH 7.5). כל ארבעת כדורי חיידקי צריך להיות מושעה והועברו (35 מ"ל סך של השעיה חיידקים) על בקבוק של 250 מ"ל סטרילי (עם stirbar קטן) בתוך 10 דקות.
- בעוד ערבוב בעדינות את ההשעיה על תא stirplate, לאט להוסיף 70 מ"ל (2 כרכים) של 10 mM EDTA disodium (ב 5 מ"מ טריס, pH 7.8) במשך 10 דקות. מוסיפים את פתרון EDTA עם קצה פיפטה מתחת לרמת ההשעיה התא, כדי למנוע ריכוז מקומי גבוה של EDTA. Stirbar צריך להיות מסתובב בקצב מספיק כדי לערבב היטב את ההשעיה התא אך לא מהר מספיק כדי לגרום מקציף או היווצרות בועה. לאחר פתרון EDTA נוספה, דגירה הפתרון למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
- לאחר דגירה 30 דקות, לאט לאט להוסיף 11 מ"ל (1 / 10 נפח ה) של פתרון ליזוזים 2 מ"ג / מ"ל ריכוז סופי של 200 מיקרוגרם / מ"ל. ממשיכים לערבב את התא במהלך ההשעיה בנוסף הפתרון ליזוזים. כפי שצוין לעיל, להוסיף את הפתרון ליזוזים עם קצה פיפטה מתחת לרמת ההשעיה נוזל התא, כדי למנוע ריכוז מקומי גבוה של ליזוזים. מאגר פתרונות ליזוזים (2 מ"ג / מ"ל) אפשר להכין לשימוש יחיד aliquots ומאוחסנים ב -20 ° C במשך שלושה עד ארבעה חודשים. דגירה הפתרון שהתקבל למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
- במהלך הדגירה 30 דקות, להכין בקבוק 1 ליטר סטרילי עם stirbar קטן 530 מ"ל של בטמפרטורת החדר Cellgro מולקולרית כיתה DH 2 O (4.5 כרכים).
- אוסמוטי lyse ההשעיה תא (משלב 6) על ידי דילול איטי (קצב זרימה של כ -11 מ"ל / דקה) לתוך 530 מ"ל מולקולרית כיתה DH 2 O (מ שלב 7) במשך 10-15 דקות עם ערבוב עדין. בגלל נפח גדול יותר הפתרון בשלב זה, להגדיל את המהירות stirbar כדי להבטיח ערבוב ראויה. Stirbar צריך להיות מסתובב בקצב מספיק ביסודיות לפזר את ההשעיה תא פעם הוסיפו 2 DH O, אך לא מהר מספיק כדי להוביל מקציף או היווצרות בועה. מוסיפים את ההשעיה תא עם קצה פיפטה מונח על החלק התחתון של הבקבוק, סמוך stirbar, כדי להקל על דילול אחיד של celאני ההשעיה. מצאנו כי 25 מ"ל pipettes העבודה הטובה ביותר במהלך שלב זה. בזהירות לפקח על תהליך דילול לקטוע את קצב הזרימה על פי הצורך לפזר הצטברויות מקומיות של תאים, גושים התא, אניצי התא. דגירה הפתרון שהתקבל למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. שים לב כי בשלב זה נראה כי אחד מאתגר ביותר קריטי להצלחה הכוללת של הניסוי.
- לאחר דגירה 30 דקות, להעביר aliquots 40 מ"ל של התמיסה תמוגה אוסמוטי לתוך 50 מ"ל צינורות חרוטי ו צנטריפוגות XG ב 7500 למשך 30 דקות ב -10 ° C כדי להסיר תאים שלמים ופסולת.
- בעקבות צנטריפוגה, להסיר בזהירות 27-30 מ"ל של supernatant מהצינור כל חרוטי ו supernatants בריכה בבקבוק 1 ליטר סטרילית
- העברת 25 מ"ל של supernatant ונקווה, כל אחד, תוך 16 צינורות ultracentrifuge ו צנטריפוגות ב 200.000 x g (44,400 סל"ד הרוטור F50L ב-8x39 ultracentrifuge FiberLite) עבור 2 שעות על 4 ° C. שים לב כי הרוטור כל בעל 8 צינורות, ולכן שלב זה דורש שני הרוטורים ושני ultracentrifuges. לחלופין, להגדיר את השני של 8 צינורות צריך להיות שנערך 4 ° C עד centrifuged.
- בתוך 10 דקות של השלמת בטווח ultracentrifuge, להכין שונה resuspension חוצץ קרום. העברת 8 מ"ל של חיץ ההשעיה קרום (25% [wt / wt] סוכרוז, 5 מ"מ טריס, 30 מ"מ MgCl 2) אל צינור סטרילי להוסיף 1 טבלית של קוקטייל EDTA ללא מעכב פרוטאז ו 375 U של Benzonase. לערבב בעדינות פתרון לפזר מעכב פרוטאז הלוח.
- בעקבות ultracentrifugation, יוצקים בזהירות את supernatants, להפוך צינורות ultracentrifuge על חומר סופג, ובתקיפות ברז צינורות להסיר supernatant עודף. סמן את מיקומו של כל גלולה קרום בטוש לסייע להדמיה. בעדינות resuspend eight כדורי קרום עם μl 600 כל אחד חוצץ שונה resuspension הממברנה. העברת כל resuspension קרום להגדיר הבא של שמונה שפופרות, בעדינות resuspend בשמונה כדורי, ואת הבריכה resuspensions קרום וכתוצאה מכך צינור סטרילי. ממברנות pelleted קשה resuspend, כך ממשיכים להעביר resuspension שונה חוצץ קרום על גלולה עד קליפות מהקיר של הצינור. זה לעתים קרובות יש צורך להשתמש קצה micropipette כדי לגרד את גלולה קרום מהקיר צינור וסיוע בתהליך resuspension. כאשר pipetting, להימנע מקציף או היווצרות בועה. שים לב כי בשלב זה נראה כי אחד מאתגר ביותר קריטי להצלחה הכוללת של הניסוי.
- כאשר כדורי קרום כבר resuspended ומנותק מכל 16 צינורות, לשטוף כל ארבעה צינורות עם 600 μl של חיץ שונה resuspension הממברנה. לשטוף את צריכה להיות ממוקדת סביב האזור המסומן (קרום כדורית) של צינור אחד. העברת הכביסה לתוך הצינור resuspension הממברנה. חזור על השלב לשטוף את שלוש מערכות הנותרים של ארבעה צינורות.
- דגירה resuspension קרום עם נדנדה עדין למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר כדי לבזות DNA וסיוע לירידה של החומר הצמרי.
- הסרת aliquot קטנה של ההשעיה קרום ולבצע כימות חלבון כדי לקבוע תשואה קרום מוחלט. אנחנו בדרך כלל להכין חי, מדולל 1:1 (ב -2.5% SDS), ו 01:03 מדולל (ב -2.5% SDS) בדגימות קרום, החום דגימות ב 90 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, ולהשתמש Assay חלבון BioRad DC לכמת resuspension קרום חלבון ריכוז. סה"כ תשואה חלבון הוא בדרך כלל בין 1.0 מ"ג / מ"ל ו - 1.6 מ"ג / מ"ל. השימוש בחום SDS נדרשים לשחרר OMPs מן הקרומים חילוץ כך כימות מדויק יותר ערך חלבון ניתן להשיג.
- הכן הדרגתיים סוכרוז ליניארי על ידי 1.8 מ"ל כל שכבות של פתרונות סוכרוז (wt / wt, שהוכנו 5 mM EDTA, pH 7.5) תוך 14 x 95 mm-Ultra Clear צינורות ultracentrifuge לפי הסדר הבא: 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%. Layering של gradients סוכרוז היא הקלה ביותר לבצע בעת שימוש pipettor הנורה, לא pipettor אוטומטיות.
- מבוסס על כימות resuspension חלבון קרום (שלב 16), שכבה 1.5 מ"ג resuspension קרום על גבי שיפוע כל אחד. לכל 14 x 95 מ"מ ultracentrifuge צינור בעל קיבולת מקסימלית של 12.5 מ"ל ו, בהתחשב בעובדה 10.8 מ"ל היא מוסברת על ידי הפתרונות סוכרוז משלב 17, אתה לא צריך להעמיס יותר מ 1.7 מ"ל של resuspension קרום לכל צבע. בנפרד לשקול בזהירות להתאים את המשקל הסופי של כל שפופרת צבע סוכרוז (על ידי הוספה או הסרה של resuspension קרום), כך כל צינורות לשקול אותו (± 0.01 גרם).
- העברת הדרגתיים סוכרוז לתוך הרוטור SW-40Ti דלי נדנוד צנטריפוגות ב 256.000 x g (38,000 סל"ד) למשך תקופה מינימלית של 17 שעות ב 4 ° C.
יום 4: אוסף של שברים שיפוע סוכרוז
- לאחר 17 שעות של צנטריפוגה, להפסיק להפעיל צנטריפוגות, ובזהירות להסיר הדרגתיים סוכרוז מן הרוטור SW-40Ti.
- נקי בזהירות את החלק התחתון של צינור מפל סוכרוז עם אתנול 70%, לנקב אתהחלק התחתון של הצינור עם מחט 21g, ולאסוף שברים רציפים 500 μl של שיפוע לתוך צינורות microfuge סטרילית. חזור על הדרגתיים הבאים. שיפוע צריך להיות מותר לטפטף על ידי זרימת כוח הכבידה, כדי לא להפריע את שיפוע סוכרוז. עם זאת, אם נוטף חדל מהחלק התחתון של הצינור שיפוע, כמות קטנה של לחץ יכול להיות מיושם על החלק העליון של הצינור באמצעות אצבע אחת.
- קבע את מקדם השבירה של כל חלק סוכרוז הדרגתי באמצעות refractometer ו לתאם את השבירה עם צפיפות מסוימת גרם / מ"ל 1. הערכת לוקליזציה חלבון ידי הכנת נציג שיפוע סוכרוז שברים (במרווחים של צפיפות של 0.01, מ 1.11 גרם / מ"ל ל 1.26 גרם / מ"ל) הפרדה SDS-PAGE, להעביר nitrocellulose ו immunoblotting.
נציג תוצאות
כאשר מבוצע כהלכה, הליך זה תוצאות הפרדה מוחלטת של צ'אט שלפוחית OM מן סוג הן סוג (למשל SchuS4) ו-B (לדוגמא: LVS) זנים של פ tularensis. כפי שמוצג באיור 1, פ 'ב immunoblots נציג OMPs tularensis בתרגום בין צפיפויות של 1.17 ו - 1.20 גרם / מ"ל. לשם השוואה, שדונים בתרגום בין צפיפויות של 1.13 ו - 1.14 גרם / מ"ל.
באיור 1. Immunoblotting פ סוכרוז tularensis צפיפות הדרגתיים. שברים סדרתית נאספו הדרגתיים וצפיפות (g / ml) חושבו בהתבסס על המדדים השבירה. החלבונים הופרדו על ידי SDS-PAGE, הועבר nitrocellulose ו immunoblotted לזהות OMP ו חלוקה IMP. MW, prestained סטנדרטים משקל מולקולרי עם הגדלים (ב KDA) ציינה בצד שמאל של כל כתם. LVS, תא lysates שלם של פ tularensis LVS. שיפוע המתאים סוכרוז הצפיפויות הן חלק שצוין לעיל נתיבים בהתאמה. OMPs ו IMPS, כפי שמצוין לשוליים השמאליים, התגלו עם antisera, polyclonal monospecific. תוצאות דומות התקבלו עבור פ tularensis SchuS4.
Discussion
פרוטוקול זה מתאר וריאציה של תמוגה, spheroplasting האוסמוטי, וצפיפות סוכרוז שיפוע צנטריפוגה "תקן הזהב" עבור ההפרדה הפיזית והעשרה של גראם שליליים OMS חיידקי מרכיבים תאיים אחרים 2, 3, 4. הואיל ואנו בעבר תיאר את היישום של שיטה זו לבידוד OMS מן סוג שני זני A ו-B סוג של פ tularensis 5, מצגת זה מציע נוהל מפורט יותר אופטימיזציה עבור בידוד OM. ואכן, זוהי מקדמה חשובה לזיהוי פוטנציאל משטח חשוף גורמים ארסיות משוערת של הפתוגן הקטלני הזה. המשמעות של הליך זה הודגם על ידי מחקרים במעבדה שלנו מראה כי החיסון של עכברים עם OMPs מטוהרים העניקה הגנה ניכרת נגד סוג ארסית פ tularensis אתגר ריאתי 6. כפי שצוין לעיל, שלב הצמיחה של תאים חיידקיים, למעקב קפדני במהלך תמוגה האוסמוטי, ואת resuspension עדין של כדורי הממברנה הם צעדים קריטיים שנראים לתאם עם להצלחה / כישלון של הליך זה הפרדה הממברנה. אמנם שיטה זו אופטימיזציה היא קפדני ובכפוף השתנות כמה ניסויים, OMS וכתוצאה מכך נראה טוהר משופר להפליא לעומת אלה צבר משימוש של דטרגנטים, ליתיום כלוריד, סודיום קרבונט או 7, 8, 9, 10, 11, 12.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
הפרויקט מתואר נתמכה על ידי מספרים גרנט P01 AI055637 ו U54 AI057156 מ NIAID / NIH. תוכנו הם באחריות הבלעדית של הכותבים ואינם מייצגים בהכרח את הדעות הרשמיות של תוכניות RCE Office, NIAID, או NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Donor calf serum | Mediatech, Inc. | 35-022-CV | |
| IsoVitaleX | BD Biosciences | 211876 | |
| Cellgro molecular grade dH2O | Mediatech, Inc. | 46-000-CM | |
| 38.5 ml polycarbonate bottle | FiberLite | 010-0514 | |
| F50L-8x39 ultracentrifuge rotor | FiberLite | 096-087051 | |
| Complete mini EDTA-free protease inhibitor cocktail | Roche Group | 04693132001 | |
| Benzonase | Novagen, EMD Millipore | 70664-3 | |
| DC protein assay | Bio-Rad | 500-0116 | |
| Ultra-Clear 14x95mm centrifuge tubes | Beckman Coulter Inc. | 344060 | |
| SW-40Ti swinging bucket rotor | Beckman Coulter Inc. | 331301 | |
| Abbe benchtop refractometer | Fisher Scientific | 13-964-10 |
References
- Price, C. A. Centrifugation in density gradients. , Academic Press. 335-335 (1982).
- Osborn, M. J., Gander, J. E., Parisi, E., Carson, J. Mechanism of assembly of the outer membrane of Salmonella typhimurium. Isolation and characterization of cytoplasmic and outer membrane. J Biol Chem. 247 (12), 3962-3962 (1972).
- Nikaido, H. Isolation of outer membranes. Methods Enzymol. 235, 225-225 (1994).
- Mizuno, T., Kageyama, M. Separation and characterization of the outer membrane of Pseudomonas aeruginosa. J Biochem. 84 (1), 179-179 (1978).
- Huntley, J. F., Conley, P. G., Hagman, K. E., Norgard, M. V. Characterization of Francisella tularensis outer membrane proteins. J Bacteriol. 189, 561-561 (2007).
- Huntley, J. F. Native outer membrane proteins protect mice against pulmonary challenge with virulent type A Francisella tularensis. Infect Immun. 76 (8), 3664-3664 (2008).
- Bevanger, L., Maeland, J. A., Naess, A. I. Agglutinins and antibodies to Francisella tularensis outer membrane antigens in the early diagnosis of disease during an outbreak of tularemia. J Clin Microbiol. 26 (3), 433-433 (1988).
- Hubalek, M. Towards proteome database of Francisella tularensis. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 787 (1), 149-149 (2003).
- Pavkova, I. Francisella tularensis live vaccine strain: proteomic analysis of membrane proteins enriched fraction. Proteomics. 5 (9), 2460-2460 (2005).
- Sandstrom, G., Tarnvik, A., Wolf-Watz, H. Immunospecific T-lymphocyte stimulation by membrane proteins from Francisella tularensis. J Clin Microbiol. 25 (4), 641-641 (1987).
- Sjostedt, A., Tarnvik, A., Sandstrom, G. The T-cell-stimulating 17-kilodalton protein of Francisella tularensis LVS is a lipoprotein. Infect Immun. 59 (9), 3163-3163 (1991).
- Twine, S. M. Francisella tularensis proteome: low levels of ASB-14 facilitate the visualization of membrane proteins in total protein extracts. J Proteome Res. 4 (5), 1848-1848 (2005).
