Summary
Протокол для разделения внутренней и внешней мембраны от
Abstract
Francisella tularensis является грамотрицательных внутриклеточных коккобактерия и возбудителя туляремии зоонозных заболеваний. По сравнению с другими бактериальными патогенами, крайне низкой инфекционной дозой (<10 КОЕ), быстрое прогрессирование заболевания, а также высокие показатели заболеваемости и смертности показывают, что вирулентных штаммов Francisella кодирования для новых факторов вирулентности. Поверхность, подвергшихся воздействию молекул, а именно внешнюю мембрану белков (ПУД), было показано, что содействие бактериальной клетки-хозяина, связывание, запись, внутриклеточного выживания, вирулентность и иммунной уклонения. Актуальность для изучения ПУД далее подчеркивается тем фактом, что они могут служить в качестве защитных вакцин против ряда бактериальных заболеваний. Принимая во внимание, ПУД могут быть извлечены из грам-отрицательных бактерий через объемной мембранной экстракции методы, в том числе ультразвуком клеток с последующим центрифугированием и / или моющим средством добычи, эти препараты часто бывают загрязнены с периплазматического и / или цитоплазматические (внутренней) оболочки (IM) загрязняющих веществ. На протяжении многих лет «золотым стандартом» метод для биохимических и биофизических разделения грамотрицательных IM и внешней мембраны (ОМ) в том, чтобы предмет бактерий spheroplasting и осмотического лизиса, а затем сахарозу центрифугирования в градиенте плотности. После слоистые на градиенте сахарозы, OMS может быть отделена от чата на основе различий в плавучей плотности, как полагают, в значительной степени основывается на наличии липополисахарида (ЛПС) в ОМ. Здесь мы описываем строгий и оптимизированный метод для извлечения, обогащения и изоляции F. tularensis внешних мембран и связанных с ними ПУД.
Protocol
День 1: Ф. tularensis пластины прививки
- Пластина замороженных культур запас F. tularensis на Мюллера-Хинтон агар с 2,5% (об / об) донора телячьей сыворотки, 2% (об / об) IsoVitaleX, 0,1% (вес / объем) глюкозы и 0,025% (вес / объем) железа пирофосфат. Расти Ф. tularensis при 37 ° C с 5% CO 2 в течение примерно 24 ч.
День 2: F. tularensis жидких сред прививки
- Подготовка и автоклава 1 литр катиона с поправкой на Мюллера-Хинтон среде (содержащей 1,23 мМ кальция дигидрат хлорида и 1,03 мМ хлорид магния гексагидрат). При охлаждении до 37 ° C, далее средний добавка с 0,1% (вес / объем), глюкоза, 0,025% (вес / объем), железа пирофосфат, и 2% (об / об) IsoVitaleX. Фильтр стерилизуют (0,22 μ) среды на две 500-мл аликвоты.
- Удалить 12 мл дополнен Мюллер-Хинтон средних и передачи в стерильные 50-мл трубки Falcon.
- Использование стерильных 10-мкл прививки цикла, царапать большой loopful Ф. tularensis рост с агаром (с День 1) и передача бактерии в 12 мл Мюллер-Хинтон среды (см. Шаг 2). Внесите раствор несколько раз, чтобы распада скоплений и подготовить однородную бактериальной суспензии. Не вихря.
- Использование стерильной пипеткой, привить каждого 500-мл судно с 5 мл бактериальной суспензии с шага 3. Расти бульонных культур при 37 ° С в течение от 14 до 18 ч при осторожном встряхивании (190-200 оборотов в минуту на Нью-Брансуик Innova серии 2300 шейкер).
День 3: Spheroplasting, осмотического лизиса, и сахарозы центрифугирования в градиенте плотности
- Получить F. tularensis культур от тряски инкубатора и удалить 1-мл аликвоту из каждого 500-мл культуры и проверить соответствующие оптические плотности. Мы нашли оптимальное извлечение мембраны и изоляции результатов при использовании F. tularensis клетки в начале логарифмической фазе роста, что коррелирует с OD 600 в диапазоне от 0,2 до 0,4 (~ 10 7 до 10 8 КОЕ / мл). Культуры с OD 600 менее 0,2 не даст достаточного количества всего материала мембраны для последующего градиентах сахарозы. И наоборот, культур с OD 600 больше, чем 0,4 (близится к стационарной фазы) были найдены для получения смешанного мембраны слияний.
- Центрифуга культур в 7500 х г в течение 30 мин при 15 ° С для сбора клеток. Мы рекомендуем центрифугирования культур в четырех 250-мл бутылки центрифуге, потому что это облегчает последующее приостановление гранул.
- Осторожно снимите СМИ супернатант из каждой центрифуги бутылку и постукиванием бутылки на абсорбирующим материалом, чтобы удалить лишнюю средний рост.
- В течение 10 минут после завершения центрифугирования, приостановить каждого бактериальных гранул в 8,75 мл 0,75 М сахарозы (в 5 мМ Трис, рН 7,5). Все четыре бактериальных гранул должно быть приостановлено и передано (35 мл общей бактериальной суспензии) для стерильных 250-мл колбу (с небольшим stirbar) в течение 10 мин.
- Хотя мягко смешивания суспензии клеток на stirplate, медленно добавить 70 мл (2 тома) 10 мМ ЭДТА динатрия (в 5 мМ Трис, рН 7,8) в течение 10 мин. Добавить раствора ЭДТА с кончика пипетки ниже уровня суспензии клеток, чтобы избежать повышенных локальных концентраций ЭДТА. Stirbar должно быть вращающихся со скоростью, достаточной для тщательного перемешивания суспензии клеток, но не достаточно быстро, чтобы вызывать вспенивание или образования пузырьков. После того как раствор ЭДТА был добавлен, инкубировать решение в течение 30 мин при комнатной температуре.
- После 30 мин инкубации, медленно добавить 11 мл (1 / 10-го объема) 2 мг / мл лизоцима решение конечной концентрации 200 мкг / мл. Продолжайте смешивать клеточной суспензии в течение лизоцима того решения. Как отмечалось выше, добавить лизоцим решение с пипетки ниже уровня жидкости суспензии клеток, чтобы избежать повышенных локальных концентраций лизоцима. Сток лизоцима решений (2 мг / мл) могут быть получены в одноразовых аликвоты и хранили при -20 ° С в течение трех-четырех месяцев. Инкубируйте полученный раствор в течение 30 мин при комнатной температуре.
- В 30-минутной инкубации, готовят стерильные 1L колбу с небольшим stirbar и 530 мл комнатной температуре Cellgro молекулярной класса дН 2 O (4,5 тома).
- Осмотически лизис клеточной суспензии (из шага 6) путем медленного разбавления (расход около 11 мл / мин) в 530 мл молекулярной класса дН 2 O (с шага 7) в течение от 10 до 15 мин с нежным смешивания. Из-за большего объема раствора на этом этапе, повышения stirbar скорости для обеспечения правильного смешивания. Stirbar должно быть вращающихся со скоростью, достаточной, чтобы полностью рассеять клеточной суспензии один раз добавляется дН 2 O, но не достаточно быстро, чтобы привести к вспенивания или образования пузырьков. Добавить клеточной суспензии с кончика пипетки покоится на дне колбы, прилегающих к stirbar, чтобы облегчить равномерное разбавления челл подвески. Мы обнаружили, что 25-мл пипетки лучше всего работают на этом этапе. Внимательно следите за процессом разведения и прервать расход по мере необходимости, чтобы разогнать местные скопления клеток, клеточных сгустков, и клеточных клочья. Инкубируйте полученный раствор в течение 30 мин при комнатной температуре. Обратите внимание, что этот шаг, как представляется, одна из самых сложных и критических для общего успеха эксперимента.
- После 30 мин инкубации, передачи 40 мл аликвоты осмотического лизиса решение в 50-мл конические пробирки и центрифуги при 7500 мкг в течение 30 мин при 10 ° С для удаления целых клеток и мусора.
- После центрифугирования, осторожно снимите с 27 по 30 мл супернатант из каждой конической трубе и бассейн супернатанты в стерильной колбе 1L
- Передача 25 мл объединенных супернатант, каждый, на 16 ультрацентрифуге труб и центрифуге при 200000 х г (44 400 оборотов в минуту в F50L-8x39 ротора ультрацентрифуге FiberLite) в течение 2 ч при 4 ° C. Обратите внимание, что каждый ротор имеет 8 труб, так что этот шаг требует два ротора и двух ультрацентрифуги. Кроме того, второй набор из 8 труб должны проводиться при температуре 4 ° С до центрифугировали.
- В течение 10 минут после завершения ультрацентрифуге перспективе подготовить изменения буфера мембраны ресуспендирования. Передача 8 мл мембраны буфер подвески (25% [вес / вес] сахарозы, 5 мМ трис, 30 мМ MgCl 2) в стерильную пробирку и добавьте 1 таблетку ЭДТА без протеазы коктейль ингибиторов и 375 U в Benzonase. Аккуратно перемешайте решение о роспуске таблетки ингибитор протеазы.
- После центрифугирования, тщательно слейте супернатантах, инвертировать ультрацентрифуге трубок на абсорбирующего материала, и твердо водопроводной трубы, чтобы удалить лишнюю супернатант. Марк расположение каждой мембраны гранул с маркером, чтобы помочь в визуализации. Аккуратно ресуспендирования восемь гранул мембраны с 600 мкл буфера изменение ресуспендирования мембраны. Передача каждой мембраны ресуспендирования на следующий набор из восьми труб, аккуратно ресуспендируют эти восемь окатышей, и бассейн в результате resuspensions мембраны в стерильную пробирку. Гранулированной мембраны трудно ресуспендируют, так что продолжить прохождение изменение буфера мембраны ресуспендирования на гранулах, пока он пилинг от стенки трубки. Это часто необходимо использовать микропипетки кончик, чтобы очистить мембраны гранул от стенки трубы и помощь в процессе ресуспендирования. Когда пипетки, избегать вспенивания или образования пузырьков. Обратите внимание, что этот шаг, как представляется, одна из самых сложных и критических для общего успеха эксперимента.
- Когда мембрана гранул были ресуспендировали и удалены из всех 16 труб, мыть каждые четыре трубы с 600 мкл буфера изменение ресуспендирования мембраны. Мытье должно быть сосредоточено вокруг выделенной области (мембраны гранул) каждой трубки. Передача мыть в трубку ресуспендирования мембраны. Повторите мыть шаг для остальных трех наборов из четырех труб.
- Инкубируйте мембраны ресуспендирования с нежным качалке в течение 30 мин при комнатной температуре, чтобы ухудшить ДНК и помощь в снижении хлопьевидный материал.
- Удалить небольшой аликвоты суспензии мембран и выполняют белка количественного определения общего выхода мембраны. Как правило, мы подготовить неразбавленным, 1:1 разводненная (в 2,5% SDS), и 1:3 разводненная (в 2,5% SDS) образцы мембран, тепло образцов при 90 ° С в течение 10 мин, а также использовать BioRad белка DC Анализ количественного мембранного белка ресуспендирования концентрации. Общий выход белка, как правило, от 1,0 мг / мл до 1,6 мг / мл. Использование тепла и SDS требуется освободить ПУД из извлеченных мембран, так что более точное значение белков количественного могут быть получены.
- Подготовка линейных градиентов сахарозы отводками 1,8 мл каждая из сахарозы решений (вес / вес, подготовленный в 5 мМ ЭДТА, рН 7,5) в 14 х 95 мм ультра-Clear ультрацентрифуге труб в следующем порядке: 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%. Расслоение сахарозы градиенты проще всего выполнить при использовании лампы пипетки, а не автоматизированная пипетки.
- На основе мембранного белка ресуспендирования количественного (шаг 16), слоем 1,5 мг мембранного ресуспендирования друг на градиент. Каждый 14 х 95 мм ультрацентрифуге трубка имеет максимальную емкость в 12,5 мл и, учитывая, что 10,8 мл приходится на сахарозу решений от Шаг 17, вы не должны загружать более 1,7 мл мембраны ресуспендирования в градиент. Индивидуально взвесить и тщательно регулировать конечный вес каждой трубы градиенте сахарозы (путем добавления или удаления мембраны ресуспендирования), чтобы все трубы весят одинаково (± 0,01 г).
- Передача сахарозы градиенты в SW-40Ti размахивая ведром и ротора центрифуги на 256000 х г (38 000 оборотов в минуту) в течение минимум 17 ч при 4 ° C.
День 4: Сбор фракций градиенте сахарозы
- Через 17 ч центрифугирования, остановите центрифуги перспективе, и осторожно удалите сахарозы градиенты от SW-40Ti ротора.
- Тщательно очистить дно пробирки градиент сахарозы с 70% этанола, прокалыватьнижнюю часть трубки с иглой 21g, а также сбор последовательных 500 мкл фракций из градиент в стерильные пробирки и отцентрифугировать. Повторите эти действия для последующего градиентов. Градиент должно быть разрешено капельно самотеком, чтобы не мешать градиенте сахарозы. Однако, если перестает капать со дна градиент трубы, небольшое количество давления могут быть применены к верхней части трубки с помощью одного пальца.
- Определите показатель преломления каждой фракции сахарозы градиентом, используя рефрактометра и коррелируют с показателем преломления удельная плотность в г / мл, 1. Оценка белков локализации, подготовив представитель фракции градиенте сахарозы (плотность шагом 0,01, от 1,11 г / мл до 1,26 г / мл) для SDS-PAGE разделения, трансфер в нитроцеллюлозы, и иммуноблоттинга.
Представитель Результаты
При правильном выполнении этой процедуры приводит к полному разделению И. М. и О. М. пузырьки с обеих тип (например, SchuS4) и типа В (например, LVS) штаммов F. tularensis. Как показано на представителя иммуноблотов на рисунке 1, Ф. tularensis ПУД локализовать между плотностью 1,17 и 1,20 г / мл. Для сравнения, ИЛВ локализовать между плотностью 1,13 и 1,14 г / мл.
Рисунок 1. Иммуноблоттинг Ф. tularensis градиенты плотности сахарозы. Последовательные фракции были собраны из градиентов и плотностей (г / мл), были рассчитаны по показателям преломления. Белки были разделены SDS-PAGE, переданы нитроцеллюлозы, и immunoblotted обнаружить ОМП и IMP фракционирования. МВт, prestained молекулярного веса стандарты с размерами (в кДа) отметил, на левой стороне каждого пятна. LVS, целые лизатов ячейки F. tularensis LVS. Соответствующие плотности градиента сахарозы фракции отмечалось выше соответствующих полос. ПУД и бесов, как отмечается в левом поле, были обнаружены с поликлональными, моноспецифических антисывороток. Аналогичные результаты были получены для F. tularensis SchuS4.
Discussion
Этот протокол описывает изменение spheroplasting, осмотического лизиса, и сахарозы центрифугирования в градиенте плотности "золотым стандартом" для физического разделения и обогащения грамотрицательные бактериальные ОМС от других клеточных компонентов 2, 3, 4. В то время как мы ранее описанных применение этого метода для выделения OMS с обеих тип и штаммы типа B Ф. tularensis 5, данная презентация предлагает более подробные и оптимизирована процедура изоляции ОМ. Действительно, это важный шаг вперед для выявления потенциально поверхности, подвергшихся воздействию и предполагаемого факторов вирулентности от этой смертельной возбудителя. Значение этой процедуры была продемонстрирована в исследованиях нашей лаборатории показали, что иммунизация мышей с очищенной ПУД предоставляемой существенную защиту против вирулентных типа F. tularensis легочные проблемы 6. Как отмечалось выше, фазы роста бактериальных клеток, необходим тщательный мониторинг во время осмотического лизиса, и нежный ресуспендирования мембраны гранулы важнейших мер, которые появляются, коррелирует с успеха / неуспеха этой процедуры мембранного разделения. Хотя это оптимизированный метод является строгим и при условии соблюдения некоторых экспериментальных изменчивости, в результате OMS-видимому, в высшей степени чистоты расширенной по сравнению с теми получила от использования моющих средств, хлорида лития, натрия или карбонат 7, 8, 9, 10, 11, 12.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Проекта, описанного была поддержана номера Грант P01 AI055637 и U54 AI057156 из NIAID / NIH. Ее содержание полностью ложится на авторов и не обязательно отражают официальную точку зрения RCE программы Office, NIAID, или НИЗ.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Donor calf serum | Mediatech, Inc. | 35-022-CV | |
| IsoVitaleX | BD Biosciences | 211876 | |
| Cellgro molecular grade dH2O | Mediatech, Inc. | 46-000-CM | |
| 38.5 ml polycarbonate bottle | FiberLite | 010-0514 | |
| F50L-8x39 ultracentrifuge rotor | FiberLite | 096-087051 | |
| Complete mini EDTA-free protease inhibitor cocktail | Roche Group | 04693132001 | |
| Benzonase | Novagen, EMD Millipore | 70664-3 | |
| DC protein assay | Bio-Rad | 500-0116 | |
| Ultra-Clear 14x95mm centrifuge tubes | Beckman Coulter Inc. | 344060 | |
| SW-40Ti swinging bucket rotor | Beckman Coulter Inc. | 331301 | |
| Abbe benchtop refractometer | Fisher Scientific | 13-964-10 |
References
- Price, C. A. Centrifugation in density gradients. , Academic Press. 335-335 (1982).
- Osborn, M. J., Gander, J. E., Parisi, E., Carson, J. Mechanism of assembly of the outer membrane of Salmonella typhimurium. Isolation and characterization of cytoplasmic and outer membrane. J Biol Chem. 247 (12), 3962-3962 (1972).
- Nikaido, H. Isolation of outer membranes. Methods Enzymol. 235, 225-225 (1994).
- Mizuno, T., Kageyama, M. Separation and characterization of the outer membrane of Pseudomonas aeruginosa. J Biochem. 84 (1), 179-179 (1978).
- Huntley, J. F., Conley, P. G., Hagman, K. E., Norgard, M. V. Characterization of Francisella tularensis outer membrane proteins. J Bacteriol. 189, 561-561 (2007).
- Huntley, J. F. Native outer membrane proteins protect mice against pulmonary challenge with virulent type A Francisella tularensis. Infect Immun. 76 (8), 3664-3664 (2008).
- Bevanger, L., Maeland, J. A., Naess, A. I. Agglutinins and antibodies to Francisella tularensis outer membrane antigens in the early diagnosis of disease during an outbreak of tularemia. J Clin Microbiol. 26 (3), 433-433 (1988).
- Hubalek, M. Towards proteome database of Francisella tularensis. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 787 (1), 149-149 (2003).
- Pavkova, I. Francisella tularensis live vaccine strain: proteomic analysis of membrane proteins enriched fraction. Proteomics. 5 (9), 2460-2460 (2005).
- Sandstrom, G., Tarnvik, A., Wolf-Watz, H. Immunospecific T-lymphocyte stimulation by membrane proteins from Francisella tularensis. J Clin Microbiol. 25 (4), 641-641 (1987).
- Sjostedt, A., Tarnvik, A., Sandstrom, G. The T-cell-stimulating 17-kilodalton protein of Francisella tularensis LVS is a lipoprotein. Infect Immun. 59 (9), 3163-3163 (1991).
- Twine, S. M. Francisella tularensis proteome: low levels of ASB-14 facilitate the visualization of membrane proteins in total protein extracts. J Proteome Res. 4 (5), 1848-1848 (2005).
