Summary
から内側と外側の膜を分離するためのプロトコル
Abstract
野兎病菌は、グラム陰性細胞内球桿菌と人獣共通感染症の野兎病の原因物質です。他の細菌性病原体と比較すると、極めて低い感染量（<10 CFU）、急激な病気の進行、および高い罹患率と死亡率は、 野兎の病原性菌株が新規な病原因子をコードすることを示唆している。表面に露出した分子、すなわち外膜タンパク質（OMPS）は、細菌宿主細胞結合、エントリ、細胞生存、病原性と免疫回避を促進することが示されている。 OMPSを研究するための妥当性は、さらに彼らは、細菌性疾患の数に対する保護ワクチンとして機能するという事実によって強調される。 OMPSを遠心分離および/または界面活性剤抽出に続いて細胞の超音波処理を含むバルク膜の抽出技術、を通じてグラム陰性細菌から抽出することができるのに対し、これらの製剤は多くの場合、ペリプラズムおよび/または細胞質（インナー）膜（IM）の汚染物質で汚染されている。長年にわたり、グラム陰性IMと外膜の生化学および生物物理学的分離のための"ゴールドスタンダード"方法は（OM）ショ糖密度勾配遠心分離に続いて、spheroplastingと浸透圧溶解されることが細菌になっている。一度、ショ糖勾配上に重ね、OMSが好調な密度の差に基づいて、IMSから分離することができる、主にOMのリポ多糖の存在（LPS）を前提としていると考えられ。ここで、我々は、抽出豊かに、そしてFを分離するために厳格な最適化方法を説明します病菌外膜とその関連OMPS。
Protocol
1日目：F.病菌のプレートの接種
- F.のプレート冷凍ストック培養ミューラーヒントン寒天培地上に病菌は 2.5％（vol / vol）のドナー仔ウシ血清、2％（vol / vol）のIsoVitaleX、0.1％（wt / vol）のグルコース、および0.025％（wt / vol）のピロリン酸鉄を補充した。 F.を拡大° C、5％CO 2で約24時間で37 病菌
2日目：F.病菌の液体培地の接種
- 陽イオン調整ミューラーヒントン培地（1.23 mMの塩化カルシウム二水和物および1.03 mMの塩化マグネシウム六水和物を含む）の1リットルを調製し、オートクレーブ。 37冷却する際° C、0.1％（wt / vol）のグルコース、0.025％（wt / vol）のピロリン酸鉄、および2％（vol / vol）のIsoVitaleXでさらに補足媒体。 2つの500 - mlのアリコートに（0.22μ）培地を滅菌フィルタします。
- 滅菌50 mlのファルコンチューブに補充ミューラーヒントン培地と転送12 mlのを削除します。
- 滅菌10μL接種ループを使用して、Fの大きな白金耳をこすり落とすミューラーヒントン培地（ステップ2を参照）12 mlの寒天プレート（1日目から）と、転送細菌から病菌の増殖。ピペット溶液を複数回は、塊を分割し、均一な細菌懸濁液を準備する。ボルテックスしないでください。
- 滅菌ピペットを用いて、ステップ3からの細菌懸濁液5mlで各500mlの容器に接種する。 37℃でブロス培養を拡大° C穏やかに振盪しながら（ニューブランズウィック州イノーバ2300シリーズシェーカーで190〜200 rpm）を持つ14〜18時間。
3日目：Spheroplasting、浸透圧溶解、およびショ糖密度勾配遠心分離
- F.を入手する病菌の振盪培養器からの文化とは、それぞれの光学濃度を確認するには、各500mlの培養液から1mlのアリコートを削除します。 F.を使用するときに我々は、最適な膜抽出と分離の結果を発見した0.2〜0.4（10 8 CFU / mlから〜10 7）にOD 600と相関して成長の初期対数増殖期における病菌の細胞、。 0.2 OD 600未満と文化は、その後のショ糖勾配の合計膜材料の十分な量を得られません。逆に、0.4より大きくOD 600との培養物は、（固定相に近づいている）、混合膜の融合をもたらすことが判明している。
- ° C、細胞を回収するために15で30分間7,500 × gでの培養を心する。それはその後のペレットの懸濁液を容易にするので、私たちは、4 250 mlの遠心ボトルに文化の遠心分離をお勧めします。
- 慎重に各遠心ボトルからメディア上清を除去し、しっかりと過剰増殖培地を除去する吸収材でボトルをタップします。
- 遠心分離の完了後10分以内に、0.75 Mスクロースの8.75ミリリットル（5mMのトリスで、pH7.5）に各細菌ペレットを中断。すべての4つの細菌のペレットを懸濁させ、10分以内に滅菌250 mlのフラスコ（小さな撹拌棒付き）に（細菌懸濁液の35mlの合計）転送する必要があります。
- そっとstirplateに細胞懸濁液を混合しながら、ゆっくり10分かけて10 mMのEDTA二ナトリウムを70ml（2倍量）を（5 mMトリス、pH 7.8）に追加します。 EDTAの上昇局所濃度を避けるために、細胞懸濁液のレベル以下にピペットの先端にEDTA溶液を加える。撹拌棒は、十分に泡や気泡の形成を引き起こすのに十分な高速細胞懸濁液を混ぜるだけではないのに十分な速度で回転する必要があります。 EDTA溶液を添加された後、室温で30分間のソリューションをインキュベートする。
- 30分間のインキュベーションの後、ゆっくりと200μg/ mlの最終濃度が2 mg / mlのリゾチーム溶液11ミリリットル（1 / 10量 ）を追加します。リゾチーム溶液の添加時に細胞懸濁液を混合し続ける。上述のように、リゾチームの上昇局所濃度を避けるために、細胞懸濁液の液レベル以下のピペットチップをリゾチーム溶液を添加する。株式リゾチーム溶液（2 mg / mlの）シングルユースのアリコートで準備し、3〜4か月-20℃で保存することができます。室温で30分間得られた溶液をインキュベートする。
- 30分間のインキュベーション中に、小さな撹拌棒及び室温Cellgro分子グレードのdH 2 O（4.5巻）の530 mlの滅菌1Lフラスコを準備。
- 浸透穏やかに混合しながら10〜15分の経過とともに分子グレードのdH 2 O（ステップ7から）530 mlにゆっくりと希釈（約11 ml / minの流量）で細胞懸濁液を（ステップ6から）溶解。ため、この手順では大規模なソリューションのボリュームから、適切な混合を確実にするために撹拌棒の速度を増加させる。撹拌棒は、徹底的に一度泡立ちや泡の形成につながるのに十分な速さのdH 2 Oに追加されただけではない細胞懸濁液を分散させるために十分な速度で回転する必要があります。セルの均一な希釈を促進するために、撹拌棒に隣接し、フラスコの底で休んでピペットの先端で細胞懸濁液を、追加します。lのサスペンション。我々は、25 mlのピペットは、このステップの間に最もよく機能することを見出した。慎重に希釈プロセスを監視し、細胞、細胞塊、そして細胞の切れ間のローカル蓄積を分散させるために必要に応じて流量を中断。室温で30分間得られた溶液をインキュベートする。このステップが最も難しいと実験の全体の成功にとって重要なの一つであるように見えることに注意してください。
- 30分のインキュベーション後、10℃30分間7500 × gで50 mlコニカルチューブと遠心分離機に浸透圧溶解液を40mlのアリコートを転送° Cが無傷の細胞や残渣を除去する。
- 遠心分離に続いて、慎重に滅菌1Lフラスコ内の各コニカルチューブとプールの上清から上清を27〜30mlを削除する
- 4℃で2時間、200,000 × gで（F50L - 8x39 FiberLite超遠心ローターで44400回転）℃で16超遠心チューブと遠心分離機に、、それぞれにプールされた上清25 mlをこのステップは2つのローター二超遠心機を必要とするように、各ローターは、チューブを8本保持していることに注意してください。また、8本の2番目のセットは、遠心分離° Cまで4℃で保持する必要があります。
- 超遠心の実行の終了の10分以内に、変更された膜の再懸濁バッファーを準備します。滅菌チューブに膜懸濁液の緩衝液8ml（25％[重量/重量]スクロース、5mMのトリス、30mMのMgCl 2を ）転送するとEDTA -フリープロテアーゼ阻害剤カクテルとベンゾナーゼの375 Uの1錠を追加。ゆっくりとプロテアーゼ阻害剤のタブレットを溶解する溶液を混合。
- 超遠心分離に続いて、慎重に、上清を捨て、吸収性材料の超遠心チューブを反転させ、しっかりと余分な上清を除去するためにチューブをタップします。可視化を支援するためのマーカーを持つ各膜ペレットの位置をマークします。静かに600μlの改変膜の再懸濁バッファーの各8つの膜ペレットを再懸濁します。優しく滅菌チューブにこれらの8つのペレット、およびプール得られた膜のresuspensionsを再懸濁し、8つのチューブの次のセットに、各膜の再懸濁を転送する。ペレット化膜が再懸濁するのが困難なので、離れて管の壁から剥離するまでペレットを介して修正された膜の再懸濁バッファーを渡し続ける。それは頻繁に再懸濁過程で管壁と援助から膜ペレットをこすり取る際には、マイクロピペットの先端を使用する必要があります。ピペッティングする場合は、泡または泡の形成を避けること。このステップが最も難しいと実験の全体の成功にとって重要なの一つであるように見えることに注意してください。
- 膜ペレットを再懸濁し、16個すべてのチューブから削除されたときは、変更された膜の再懸濁バッファー600μlの持つすべての4本のチューブを洗浄する。洗浄は、各チューブのマークされた領域（膜ペレット）の周りに集中するべきである。膜の再懸濁のチューブに洗浄液を移す。 4本のチューブの残りの3つのセットのための洗浄ステップを繰り返します。
- 綿状物質の削減にDNAと援助を分解するために室温で30分間緩やかに振盪しながら膜の再懸濁をインキュベートする。
- 膜懸濁液の小アリコートを取り出して、合計膜の収率を決定するためにタンパク質定量を行う。我々は一般的に原液の準備、1:1（2.5％SDSで）希釈し、そして1:3 90（2.5％SDSで）膜試料、熱サンプルを希釈℃で10分間、および定量化するためにバイオラッドDCプロテインアッセイを使用するためのC膜の再懸濁のタンパク質濃度。総タンパク質収量は1.0 mg / mlのと1.6 mg / mlの間で一般的です。熱およびSDSの使用は、より正確なタンパク質定量値が得られるように抽出された膜からOMPSを解放する必要があります。
- 55％、50％、45％、：次の順序で14 × 95ミリメートル超クリア超遠心管にレイヤー1.8ミリリットルのスクロース溶液の各々（重量/重量、5mMのEDTA、pHを7.5に調製）で線形スクロース勾配を準備40％、35％、30％。ショ糖勾配の階層化は、電球のピペッターではなく、自動ピペッターを使用する際に実行するための最も簡単です。
- 膜の再懸濁のタンパク質の定量化（ステップ16）、層ごとに勾配の上に膜懸濁1.5mgのに基づく。各14 × 95 mmの超遠心管は10.8 mlのステップ17からショ糖溶液で占めていることを考えれば、最大12.5ミリリットルの容量とを、持っている、グラデーションあたりの膜懸濁以上の1.7mlをロードしないでください。すべてのチューブが（± 0.01 g）を同じ重量を量るように各ショ糖密度勾配管の最終重量を（膜の再懸濁を追加または削除）を個別に重量と慎重に調整します。
- 4℃で17時間の最低256000 × gで（38,000 rpm）で℃でSW - 40Tiスイングバケットローターと遠心機にショ糖勾配を転送する
4日目：ショ糖密度勾配分画のコレクション
- 遠心分離の17時間後、遠心分離の実行を停止し、慎重にSW - 40Tiローターからショ糖勾配を削除します。
- 穿刺、70％エタノールでショ糖勾配管の底部を慎重にクリーニング21グラム針とチューブの底部、および滅菌マイクロチューブに勾配からシーケンシャル500μlの分画を集める。その後の勾配のために繰り返します。勾配は、ショ糖勾配を邪魔しないように、重力流により点滴を許可する必要があります。滴下が勾配管の底からやめる場合は、圧力の少量は自分の指を使ってチューブの上に適用してもよい。
- 屈折計を使用して、各ショ糖勾配分画の屈折率を決定し、g / mlの1の特定の密度と屈折率の相関関係を。 SDS - PAGEの分離、ニトロセルロースへの転送、およびイムノブロッティングのために、代表的なショ糖密度勾配分画を（1.11 g / mlの〜1.26 g / mlの0.01の密度の増分）準備することによって、タンパク質の局在を評価する。
代表的な結果
ときは、両方のタイプ（例えばSchuS4）とタイプB（例：LVS）F.の菌株からIMとOM小胞の完全な分離では、この手順の結果、正常に実行病菌 。図1に、Fの代表的な免疫ブロットで示すように病菌の OMPSは1.17と1.20 g / mlの密度の間にローカライズする。比較することで、IMPSは1.13と1.14グラム/ mlの密度の間にローカライズ。
図1。F.のイムノブロット病菌のショ糖密度勾配。シーケンシャル画分を勾配と密度（g / mlの）屈折率に基づいて計算されてから収集された。タンパク質は、SDS - PAGEで分離し、ニトロセルロースに移され、OMPとIMPの分画を検出する免疫ブロットした。 MW、サイズの分子量標準をジウムは、（分子量で）各ブロットの左側に注目。 LVS、F.の全細胞溶解物病菌の LVS。対応するショ糖勾配分画の密度は、それぞれのレーンの上に記載されています。として、左余白に記載OMPSとIMPSは、、ポリクローナル、単一特異性抗血清で検出された。同様の結果がF.が得られた病菌 SchuS4。
Discussion
このプロトコルはspheroplasting、浸透圧溶解の変化、および他の細胞成分2、3、4からグラム陰性細菌のOMSの物理的な分離と濃縮のためのショ糖密度勾配遠心分離"ゴールドスタンダード"を説明します。我々は以前に、両方のタイプとFのB型株からOMSを単離するためのこの方法の応用を説明したのに対し、 病菌 5は 、このプレゼンテーションは、OMの分離のための詳細かつ最適化された手順を提供しています。確かに、これはこの致命的な病原体から潜在的に表面に露出し、推定される病原性因子を特定するための重要な進歩である。この手順の重要性は、病原性のタイプF.に対する実質的な保護が与えOMPSを精製したマウスの免疫を示す私たちの研究室での研究で実証された病菌肺課題6。細菌細胞、浸透圧溶解時には特に注意して監視、および膜ペレットの穏やかな再懸濁の上記のように、成長期には、この膜分離の手続きの成功/失敗と相関して出現の重要なステップです。この最適化されたメソッドは厳しいといくつかの実験的なばらつきの対象となっている間、結果OMSは、洗剤、塩化リチウム、または炭酸ナトリウム7、8、9、10、11の使用から獲得に比べて格段に強化された純度のもののように見える12。
Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
説明されているプロジェクトは、NIAID / NIHから助成番号P01 AI055637とU54 AI057156によってサポートされていました。その内容はもっぱら著者の責任であり、必ずしもRCEプログラムオフィス、NIAID、またはNIHの公式見解を示すものではありません。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Donor calf serum | Mediatech, Inc. | 35-022-CV | |
| IsoVitaleX | BD Biosciences | 211876 | |
| Cellgro molecular grade dH2O | Mediatech, Inc. | 46-000-CM | |
| 38.5 ml polycarbonate bottle | FiberLite | 010-0514 | |
| F50L-8x39 ultracentrifuge rotor | FiberLite | 096-087051 | |
| Complete mini EDTA-free protease inhibitor cocktail | Roche Group | 04693132001 | |
| Benzonase | Novagen, EMD Millipore | 70664-3 | |
| DC protein assay | Bio-Rad | 500-0116 | |
| Ultra-Clear 14x95mm centrifuge tubes | Beckman Coulter Inc. | 344060 | |
| SW-40Ti swinging bucket rotor | Beckman Coulter Inc. | 331301 | |
| Abbe benchtop refractometer | Fisher Scientific | 13-964-10 |
References
- Price, C. A. Centrifugation in density gradients. , Academic Press. 335-335 (1982).
- Osborn, M. J., Gander, J. E., Parisi, E., Carson, J. Mechanism of assembly of the outer membrane of Salmonella typhimurium. Isolation and characterization of cytoplasmic and outer membrane. J Biol Chem. 247 (12), 3962-3962 (1972).
- Nikaido, H. Isolation of outer membranes. Methods Enzymol. 235, 225-225 (1994).
- Mizuno, T., Kageyama, M. Separation and characterization of the outer membrane of Pseudomonas aeruginosa. J Biochem. 84 (1), 179-179 (1978).
- Huntley, J. F., Conley, P. G., Hagman, K. E., Norgard, M. V. Characterization of Francisella tularensis outer membrane proteins. J Bacteriol. 189, 561-561 (2007).
- Huntley, J. F. Native outer membrane proteins protect mice against pulmonary challenge with virulent type A Francisella tularensis. Infect Immun. 76 (8), 3664-3664 (2008).
- Bevanger, L., Maeland, J. A., Naess, A. I. Agglutinins and antibodies to Francisella tularensis outer membrane antigens in the early diagnosis of disease during an outbreak of tularemia. J Clin Microbiol. 26 (3), 433-433 (1988).
- Hubalek, M. Towards proteome database of Francisella tularensis. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 787 (1), 149-149 (2003).
- Pavkova, I. Francisella tularensis live vaccine strain: proteomic analysis of membrane proteins enriched fraction. Proteomics. 5 (9), 2460-2460 (2005).
- Sandstrom, G., Tarnvik, A., Wolf-Watz, H. Immunospecific T-lymphocyte stimulation by membrane proteins from Francisella tularensis. J Clin Microbiol. 25 (4), 641-641 (1987).
- Sjostedt, A., Tarnvik, A., Sandstrom, G. The T-cell-stimulating 17-kilodalton protein of Francisella tularensis LVS is a lipoprotein. Infect Immun. 59 (9), 3163-3163 (1991).
- Twine, S. M. Francisella tularensis proteome: low levels of ASB-14 facilitate the visualization of membrane proteins in total protein extracts. J Proteome Res. 4 (5), 1848-1848 (2005).
