Summary
内层和外层膜分离议定书
Abstract
弗朗西斯tularensis是一种革兰氏阴性细胞内coccobacillus和人畜共患病兔热病的病原体。当与其他细菌病原体的感染剂量极低（<10 CFU），疾病进展迅速，高发病率和死亡率表明， 弗朗西斯的毒株为新的致病因素的编码相比。暴露于表面的分子，即外膜蛋白（OMPS），已被证明是促进细菌宿主细胞结合，条目，细胞内生存，毒力和免疫逃避。进一步强调的事实，他们可以作为对一些细菌性疾病的保护疫苗研究外膜蛋白的相关性。鉴于可以从革兰氏阴性菌中提取的，通过批量膜萃取技术，包括超声离心和/或洗涤剂提取细胞的外膜蛋白，这些准备工作往往与周质和/或细胞质（内）膜（IM）污染物污染。多年来，为革兰氏阴性IM和外膜的生化和生物物理分离方法的“金标准”（OM），已受细菌spheroplasting和渗透裂解，蔗糖密度梯度离心。一旦蔗糖梯度层，OMS可以从IMS分离的基础上浮力密度的差异，被认为在很大程度上存在在OM脂多糖（LPS）的前提。在这里，我们描述了一个严谨和优化的方法来提取，丰富和隔离楼tularensis外膜和其相关的外膜蛋白。
Protocol
1天：F tularensis板接种
- 板冻结的股票文化楼tularensis上的Mueller - Hinton琼脂辅以2.5％（体积/体积）捐助小牛血清，2％（体积/体积）IsoVitaleX，葡萄糖0.1％（WT /卷），和0.025％（WT /卷）铁焦。成长楼在37℃，5％的CO 2约24小时的 tularensis
第2天：F tularensis液体介质接种
- 准备和反应釜1公升阳离子调整穆勒韩丁中等（含1.23毫米二水氯化钙和1.03毫米的镁氯化）。当冷却到37℃，进一步补充液，葡萄糖0.1％（WT /卷），0.025％（WT /卷）焦磷酸铁，和2％（体积/体积）IsoVitaleX。过滤消毒（0.22μ）分为两个500毫升分装的介质。
- 取出50毫升的无菌猎鹰管12毫升补充穆勒韩丁中期和转让。
- 使用10μL无菌接种环，刮楼大loopful穆勒韩丁中等（见步骤2）到12毫升的琼脂（从第1天）和转让细菌 tularensis增长。液多次打破团块，并准备同质的菌悬液。不要旋涡。
- 使用无菌吸管，接种5毫升菌悬液从第3步，每500毫升的容器。增长肉汤培养37℃，14日至18 h，轻轻摇动在新不伦瑞克省伊诺2300系列振动筛（190-200 RPM）。
第3天：Spheroplasting，渗透裂解，和蔗糖密度梯度离心
- 获得F。从摇床tularensis文化和删除1毫升等分检查各自的光密度从每500毫升的文化。使用楼时，我们已经找到了最佳的膜萃取和隔离的结果tularensis年初增长0.2至0.4之间（〜10 7 10 8 CFU /毫升），这与OD 600相关的对数生长期的细胞。外径600小于0.2的文化就不会产生足够数量为后续的蔗糖梯度膜材料。相反，外径600比0.4（接近固定相）更大的文化已发现产生混合膜融合。
- 7500 X克文化离心30分钟，15 ° C至收集细胞。我们建议在4个250毫升的离心瓶离心文化，因为它有利于以后的颗粒悬浮。
- 小心取出离心瓶从每个媒体上清和坚决自来水吸水材料的瓶子，以除去多余的生长介质。
- 离心10 min内完成后，暂停在8.75毫升的蔗糖（5毫米的Tris，pH值7.5）0.75米，每个菌体。应暂停所有四个细菌颗粒（共35毫升菌悬液）10分钟内转移到无菌的250毫升的瓶（一个小stirbar）。
- 在stirplate细胞悬液轻轻混匀，慢慢超过10分钟的过程中添加70毫升的10毫米乙二胺四乙酸二钠（2卷）（5毫米三，pH值7.8）。加入EDTA溶液与细胞悬液水平以下的移液器提示，以避免局部浓度升高的EDTA。 stirbar应旋转的速度足够充分混合细胞悬液，但速度还不够快，造成起泡或气泡的形成。已加入EDTA溶液后，孵育在室温下30分钟的解决方案。
- 30分钟潜伏期后，慢慢加入11毫升2毫克/毫升溶菌酶溶液的终浓度为200微克/毫升（1 / 10卷）。继续在溶菌酶的解决方案，除了混合细胞悬液。如上所述，添加下面的细胞悬浮液水平的枪头溶菌酶的解决方案，以避免局部浓度升高，溶菌酶。股票溶菌酶的解决方案（2毫克/毫升）可准备一次性使用的分装和储存在-20 ° C三至四个月。孵育在室温下30分钟的最终的解决方案。
- 在30分钟的孵化，准备一个小stirbar室温Cellgro分子级的dh 2 O（4.5卷）和530毫升的无菌1L容量瓶中。
- 渗透溶解缓慢稀释（流速约11毫升/分钟）的分子级DH 2 O（步骤7）在10至15分钟，轻轻搅拌成530毫升细胞悬液（步骤6） 。因为在这一步溶液的体积较大，增加stirbar的速度，以确保适当的混合。 stirbar应旋转的速度足以彻底驱散细胞悬液，一旦添加到DH 2 O，但不够快，导致泡沫或气泡的形成。加入烧瓶底部，毗邻的stirbar休息枪头的细胞悬液，以利统一的CEL稀释升停牌。我们发现，25毫升的吸液管工作在这一步中最好的。仔细监测稀释过程和中断必要分散的细胞，细胞团块，和细胞缕缕当地积累的流量。孵育在室温下30分钟的最终的解决方案。请注意，这一步看来是最具挑战性和实验的整体成功的关键之一。
- 经过30分钟的孵化，转移到50毫升锥形管和离心渗透裂解液40毫升分装在30在10分钟XG 7500 ° C，移除了完整的细胞和碎片。
- 离心后，小心地从每一个锥形管和池上清液在无菌1L容量瓶中27至30毫升上清液
- 转让25毫升，每池上清液，到16超速离心机管和离心机在200,000 X克（44400 RPM在F50L 8x39 FiberLite超速离心机转子）为2小时4 ° C。请注意，每个转子可容纳8管的，所以这一步需要两个转子和两个ultracentrifuges。另外，第二组8管应在4℃直至离心。
- 超速离心机运行后10分钟内，准备修改膜再悬浮液。 8毫升膜悬浮液（25％[WT / WT]蔗糖，三5毫米，30毫米氯化镁2）转移到无菌管中，并添加1片EDTA无蛋白酶抑制剂的鸡尾酒和375 Benzonase ü。轻轻混合溶液溶解蛋白酶抑制剂片。
- 经过离心，小心地倒出上清液，超速离心机管倒置在吸水材料，并坚决自来水管，除去多余的上清液。每个膜颗粒标记一个标记，以帮助在可视化的位置。改性膜再悬浮缓冲各600μL，轻轻重悬八个膜颗粒。每个膜再悬浮转移到下一组八管，轻轻悬浮在无菌管这八个小球，和游泳池膜resuspensions。颗粒膜是很难重悬，所以继续通过对颗粒的改性膜再悬浮缓冲，直到它果皮远离管壁。这是经常要使用微量提示，在再悬浮过程中的膜颗粒刮去管壁和援助。移液时，应避免泡沫或泡沫的形成。请注意，这一步看来是最具挑战性和实验的整体成功的关键之一。
- 当膜颗粒已重悬，并从所有16个管拆除，600改性膜再悬浮缓冲液冲洗，每四个管子。应重点围绕标记的区域，每个管（膜颗粒）洗。转移到膜的再悬浮管清洗。其余的三四个管子套重复清洗步骤。
- 孵育膜在室温降解减少絮状物质DNA和援助为30分钟的温和的摇摆再悬浮。
- 删除膜悬挂小等份，并进行蛋白定量，以确定总膜产量。我们通常准备未稀释，1:1稀释（2.5％SDS）和1:3稀释（2.5％SDS）膜样品，加热样品在90 ° C为10分钟，用BioRad公司的DC蛋白测定量化膜再悬浮的蛋白浓度。总蛋白的产量一般在1.0 mg / ml和1.6毫克/毫升。热和SDS的使用要求释放使一个更准确的蛋白定量值可从提取的膜的外膜蛋白。
- 准备到14 × 95毫米超清晰的，按下列顺序超速离心机管的线性蔗糖梯度分层蔗糖溶液1.8毫升（WT / WT，准备在5毫米EDTA，pH值7.5）：55％，50％，45％， 40％，35％，30％。蔗糖梯度分层是最简单的方法执行时，使用一个灯泡移液器，而不是自动移液器。
- 基于膜再悬浮蛋白定量（16步），每个梯度顶部的膜再悬浮层1.5毫克。每个14 × 95毫米超速离心机管的最大容量为12.5毫升，从第17步的蔗糖溶液占10.8毫升，你不应该负载超过1.7毫升每梯度再悬浮膜。单独权衡和仔细调整每个蔗糖密度梯度管的最终重量（添加或删除膜再悬浮），使所有的管子的重量相同（± 0.01克）。
- 转移到一个SW - 40Ti水平转头和离心蔗糖梯度256000 X克（38,000 RPM）至少17小时在4 ° C。
第4天：收集蔗糖梯度分数
- 离心后17 h，停止离心机的运行，并仔细清除SW - 40Ti转子蔗糖梯度。
- 仔细清洁用70％乙醇的蔗糖密度梯度管的底部，穿刺与21克针管的底部，并收集到无菌的离心管连续500μL分数梯度。重复随后的梯度。渐变应允许重力流滴，所以尽量不要去打扰蔗糖梯度。然而，如果梯度管的底部不再滴水，少量的压力可能会适用于使用的手指管。
- 确定使用验光仪的分数每个蔗糖梯度折射率和折射率用 1克/毫升的密度相关。蛋白定位评估准备代表蔗糖梯度组分（密度为0.01增量由1.11克/毫升1.26克/毫升），进行SDS - PAGE分离，转移至硝酸纤维素和免疫印迹。
代表性的成果
当正确执行，这一过程的结果，在IM和OM囊泡从两种类型的完全分离（如SchuS4）和B型（例如，LVS）株楼tularensis。代表免疫印迹显示在图1，F。 tularensis外膜蛋白本地化之间的密度为1.17和1.20克/毫升。相比之下，IMPS本地化之间的密度为1.13和1.14克/毫升。
图1免疫楼tularensis蔗糖密度梯度。从梯度和密度（克/毫升），根据折射率计算连续分数。蛋白经SDS - PAGE分离，转移到硝酸纤维素，和immunoblotted检测OMP和IMP的分馏。兆瓦，预染标准分子量大小（kDa）的左侧的每一个印迹指出。 LVS的，整个楼的细胞裂解液tularensis LVS的。相应的蔗糖梯度分数密度如上所述各自的车道。外膜蛋白和IMPS，在左旁指出，多克隆，单特异性抗血清检测。类似的结果，获得了楼tularensis SchuS4。
Discussion
这个协议描述一个spheroplasting，渗透裂解变化，和蔗糖密度梯度离心“金标准”的其他细胞成分2，3，4，革兰阴性细菌OMS的物理分离和浓缩。而我们前面描述的这种方法的应用，为隔离两种类型OMS A和B型株的楼tularensis 5，此演示，提供了奥姆隔离更详细和优化的过程。事实上，这是一个从这种致命的病原体识别潜在的表面暴露和推定致病因素的重要进展。在此过程中的意义是表明我们给予实质性的保护，对剧毒A型楼纯化的外膜蛋白，免疫小鼠的实验室研究tularensis肺挑战6。如上所述，细菌细胞，在渗透裂解仔细监测，和温柔的再悬浮膜颗粒的生长阶段出现的关联，这种膜分离过程中的成功/失败的关键步骤。虽然这种优化方法是严谨和一些实验性的变异，导致OMS相比，从使用的洗涤剂，氯化锂，钠碳酸盐7，8，9，10，11囊括出现显着提高纯度 ， 12。
Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
授权号码P01 AI055637和NIAID / NIH U54 AI057156描述该项目的支持。其内容完全是作者的责任，并不一定代表办公室的RCE的程序，NIAID的，或美国国立卫生研究院的官方意见。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Donor calf serum | Mediatech, Inc. | 35-022-CV | |
| IsoVitaleX | BD Biosciences | 211876 | |
| Cellgro molecular grade dH2O | Mediatech, Inc. | 46-000-CM | |
| 38.5 ml polycarbonate bottle | FiberLite | 010-0514 | |
| F50L-8x39 ultracentrifuge rotor | FiberLite | 096-087051 | |
| Complete mini EDTA-free protease inhibitor cocktail | Roche Group | 04693132001 | |
| Benzonase | Novagen, EMD Millipore | 70664-3 | |
| DC protein assay | Bio-Rad | 500-0116 | |
| Ultra-Clear 14x95mm centrifuge tubes | Beckman Coulter Inc. | 344060 | |
| SW-40Ti swinging bucket rotor | Beckman Coulter Inc. | 331301 | |
| Abbe benchtop refractometer | Fisher Scientific | 13-964-10 |
References
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