Summary
Ein Protokoll für die Trennung von innerer und äußerer Membranen aus
Abstract
Francisella tularensis ist ein Gram-negative intrazelluläre Coccobacillus und der Erreger der Zoonose Tularämie. Wenn mit anderen bakteriellen Erregern, die extrem niedrige infektiöse Dosis (<10 CFU), schnelle Progression der Erkrankung und eine hohe Morbidität und Mortalität nahe, dass die Stämme von Francisella für neue Virulenzfaktoren kodieren verglichen. Oberflächen-exponierten Moleküle, nämlich Proteine der äußeren Membran (OMPs), haben gezeigt, dass bakterielle Wirtszelle binden, eingang, intrazelluläre Überleben, Virulenz und Immunevasion fördern. Die Relevanz für das Studium OMPs wird durch die Tatsache, dass sie als schützende Impfstoffe gegen eine Reihe von bakteriellen Krankheiten dienen unterstrichen. Während OMPs aus gram-negative Bakterien durch Bulk-Membran-Extraktion Techniken, einschließlich Beschallung von Zellen durch Zentrifugation und / oder Detergensextraktion gefolgt extrahiert werden, sind diese Präparate oft mit periplasmatischen und / oder zytoplasmatische (innen)-Membran (IM) Verunreinigungen kontaminiert. Seit Jahren der "Goldstandard"-Methode für die biochemische und biophysikalische Trennung von gram-negative IM und äußeren Membranen (OM) hat vorbehaltlich Bakterien Spheroplasting und osmotische Lyse, gefolgt von Saccharose-Dichtegradientenzentrifugation. Einmal auf einer Saccharose-Gradienten können OMs von IMs auf der Grundlage der Unterschiede in der lebhaften Dichten getrennt werden, die vermutlich größtenteils auf das Vorhandensein von Lipopolysaccharid (LPS) in der OM ausgesagt werden. Hier beschreiben wir eine strenge und optimierte Methode zu extrahieren, zu bereichern und zu isolieren F. tularensis äußeren Membranen und die damit verbundenen OMPs.
Protocol
Tag 1: F. tularensis Platte Impfung
- Platte eingefroren Stammkulturen von F. tularensis auf Mueller-Hinton-Agar mit 2,5% (vol / vol) Donor Kälberserum, 2% (vol / vol) IsoVitaleX, 0,1% (wt / vol) Glucose und 0,025% (wt / vol) Eisenpyrophosphat ergänzt. Wachsen F. tularensis bei 37 ° C mit 5% CO 2 für ca. 24 h.
Tag 2: F. tularensis flüssigen Medien Impfung
- Vorbereiten und Autoklaven 1 Liter Kationen-eingestellt Mueller-Hinton-Medium (mit 1,23 mm Calciumchloriddihydrat und 1,03 mM Magnesiumchlorid-Hexahydrat). Nach dem Abkühlen auf 37 ° C, weiter ergänzen Medium mit 0,1% (wt / vol) Glukose, 0,025% (wt / vol) Eisenpyrophosphat, und 2% (vol / vol) IsoVitaleX. Filter sterilisieren (0,22 μ)-Medium in zwei 500-ml-Portionen.
- Nehmen Sie 12 ml ergänzt Mueller-Hinton-Medium und Überführung in eine sterile 50-ml-Falcon-Röhrchen.
- Mit einer sterilen 10-ul Impföse, kratzen eine große Öse F. tularensis Wachstum von Agarplatten (ab Tag 1) und übertragen die Bakterien in 12 ml Mueller-Hinton-Medium (siehe Schritt 2). Pipettenlösung mehrfach den Break-up Klumpen und bereiten homogene Bakteriensuspension. Nicht vortexen.
- Mit einer sterilen Pipette impfen jedes 500-ml-Gefäß mit 5 ml Bakteriensuspension aus Schritt 3. Wachsen Brühe Kulturen bei 37 ° C für 14 bis 18 h unter leichtem Schütteln (190-200 rpm auf einem New Brunswick Innova 2300 Serie Schüttler).
Tag 3: Spheroplasting, osmotische Lyse und Saccharose-Dichtegradientenzentrifugation
- Erhalten F. tularensis Kulturen aus dem Schüttelinkubator und entfernen Sie eine 1-ml-Aliquot aus jedem 500-ml-Kultur in den jeweiligen optischen Dichten zu überprüfen. Wir haben eine optimale Membran-Extraktion und Isolierung Ergebnisse bei der Verwendung von F. tularensis Zellen in der frühen logarithmischen Phase des Wachstums, die mit einer OD 600 korreliert zwischen 0,2 bis 0,4 (~ 10 Juli - 10 August CFU / ml). Kulturen mit einer OD 600 von weniger als 0,2 wird nicht nachgeben ausreichende Menge von insgesamt Membranmaterial für nachfolgende Saccharosegradienten. Umgekehrt haben Kulturen mit einer OD 600 von mehr als 0,4 (kurz vor der stationären Phase) wurde festgestellt, mixed-Membran-Fusionen ergeben.
- Centrifuge Kulturen bei 7.500 x g für 30 min bei 15 ° C zu sammeln der Zellen. Wir empfehlen Zentrifugation der Kulturen in vier 250-ml Zentrifugenbecher, weil es nachfolgenden Pellets Aufhängung erleichtert.
- Entfernen Sie vorsichtig den Medien Überstand aus jeder Zentrifugenflasche und fest tippen Sie auf die Flaschen auf saugfähigen Material, um überschüssige Wachstumsmedium zu entfernen.
- Innerhalb von 10 min nach Beendigung der Zentrifugation auszusetzen jeder Bakterienpellet in 8,75 ml von 0,75 M Saccharose (in 5 mM Tris, pH 7,5). Alle vier Bakterienpellets ausgesetzt und übertragen werden (35 ml insgesamt Bakteriensuspension) in eine sterile 250-ml-Flasche (mit einem kleinen Rührerstab) innerhalb von 10 min.
- Während sanft Mischen der Zellsuspension auf einer stirplate, langsam 70 ml (2 Bände) von 10 mM EDTA (in 5 mM Tris, pH 7,8) im Laufe von 10 min. Fügen Sie die EDTA-Lösung mit der Spitze der Pipette unter der Zellsuspension Ebene zu erhöhten lokalen Konzentrationen von EDTA zu vermeiden. Die Rührerstab sollte mit einer ausreichenden Geschwindigkeit zu durchmischen die Zellsuspension, aber nicht schnell genug, um zu Schaumbildung führen oder Blasenbildung sein dreht. Nach der EDTA-Lösung hinzugefügt wurde, inkubieren Sie die Lösung für 30 min bei Raumtemperatur.
- Nach der 30 min Inkubation langsam zugeben 11 ml (1 / 10 th Volumen) einer 2 mg / ml Lysozym-Lösung auf eine Endkonzentration von 200 ug / ml. Fahren Sie mit der Zellsuspension während der Lysozym-Lösung zusätzlich zu mischen. Wie oben erwähnt, fügen Sie den Lysozym-Lösung mit der Pipettenspitze unterhalb der Zellsuspension Flüssigkeitsstand zu erhöhten lokalen Konzentrationen von Lysozym zu vermeiden. Lager Lysozym-Lösungen (2 mg / ml) kann in Einzel-Portionen zubereitet werden und bei -20 ° C für drei Minuten vor vier Monaten. Inkubieren Sie die resultierende Lösung für 30 min bei Raumtemperatur.
- Während der 30 min Inkubation Vorbereitung eines sterilen 1L Flasche mit einem kleinen Rührerstab und 530 ml Raumtemperatur CellGro Molecular Grade dH 2 O (4,5 Volumen).
- Osmotisch lysiert die Zellsuspension (aus Schritt 6) durch langsame Verdünnung (Flussrate von ca. 11 ml / min) in 530 ml für Molekulare Grade dH 2 O (aus Schritt 7) im Laufe der 10 bis 15 min unter leichtem Mischen. Wegen der größeren Volumen der Lösung in diesem Schritt erhöhen Rührerstab Geschwindigkeit, um eine ordnungsgemäße Durchmischung zu gewährleisten. Die Rührerstab sollte mit einer ausreichenden Geschwindigkeit, um gründlich zu dispergieren die Zellsuspension einmal, um die dH 2 O hinzugefügt werden rotierende aber nicht schnell genug, um Schaumbildung oder Blasenbildung führen. Fügen Sie die Zellsuspension mit der Spitze der Pipette ruht auf dem Boden des Kolbens, angrenzend an die Rührerstab, um eine gleichmäßige Verdünnung der cel erleichternl Suspension. Wir haben festgestellt, dass 25-ml-Pipetten beste Arbeit in diesem Schritt. Sorgfältig überwachen die Verdünnung Prozess und unterbrechen den Durchfluss wie nötig, um lokale Ansammlungen von Zellen, Zellklumpen, und die Zelle Strähnen verteilen. Inkubieren Sie die resultierende Lösung für 30 min bei Raumtemperatur. Beachten Sie, dass dieser Schritt zu einer der anspruchsvollsten und entscheidend für den Gesamterfolg des Experiments zu sein scheint.
- Nach der 30 min Inkubation Transfer 40 ml Aliquots der osmotische Lyse-Lösung in 50-ml konische Röhrchen und zentrifugieren bei 7500 xg für 30 min bei 10 ° C an intakte Zellen und Ablagerungen zu entfernen.
- Nach der Zentrifugation vorsichtig von 27 bis 30 ml Überstand aus jeder konischen Rohr und Pool Überstände in einem sterilen 1L Flasche
- Transfer 25 ml gepoolt Überstand, die jeweils in 16 Ultrazentrifuge-und Zentrifugenröhrchen bei 200.000 x g (44.400 rpm in F50L-8x39 Fiberlite Ultrazentrifuge Rotor) für 2 h bei 4 ° C. Beachten Sie, dass jeder Rotor 8 Röhrchen hält, so dass dieser Schritt erfordert zwei Rotoren und zwei Ultrazentrifugen. Alternativ sollte der zweite Satz von 8 Röhrchen bei 4 ° C aufbewahrt werden, bis zentrifugiert.
- Innerhalb von 10 min nach Beendigung der Ultrazentrifuge laufen, bereiten Membran Resuspensionspuffer geändert. Transfer-8 ml Membransuspension Puffer (25% [w / w] Saccharose, 5 mM Tris, 30 mM MgCl 2), um ein steriles Röhrchen geben und 1 Tablette EDTA-freie Protease Inhibitor Cocktail und 375 U Benzonase. Vorsichtig mischen Lösung Protease-Inhibitor Tablette auflösen.
- Nach Ultrazentrifugation, sorgfältig abgießen Überstände, Invertzucker Ultrazentrifuge Rohre auf saugfähigen Material, und fest Leitungswasser Röhren, um überschüssige Überstand zu entfernen. Markieren Sie die Position der einzelnen Membran-Pellet mit einem Marker, um die Visualisierung zu helfen. Vorsichtig resuspendieren acht Membran-Pellets mit 600 ul jeweils modifizierte Membran Resuspensionspuffer. Übertragen Sie jede Membran Resuspension auf den nächsten Satz von acht Röhren vorsichtig resuspendieren diese acht Pellets, und der Pool der resultierenden Membran resuspensions in einem sterilen Röhrchen. Die pelletierten Membranen sind schwer zu suspendieren, so auch weiterhin das Bestehen der modifizierten Membran Resuspensionspuffer über das Pellet bis es weg von der Wand des Rohres schält. Es ist oft notwendig, die Mikropipette Spitze verwenden, um die Membran Pellet aus der Rohrwand und Hilfe kratzen in der Resuspension Prozess. Beim Pipettieren vermeiden Aufschäumen oder Blasenbildung. Beachten Sie, dass dieser Schritt zu einer der anspruchsvollsten und entscheidend für den Gesamterfolg des Experiments zu sein scheint.
- Wenn die Membran-Pellets wurden resuspendiert und aus allen 16 Röhren, waschen alle vier Röhren mit 600 ul der modifizierten Membran Resuspensionspuffer. Die Wäsche sollte um den markierten Bereich (Membran Pellet) jeder Röhre fokussiert werden. Übertragen Sie die Wäsche in die Membran Resuspension Röhre. Wiederholen Sie den Waschvorgang für die restlichen drei Sätze von vier Röhren.
- Inkubieren Sie die Membran Resuspension unter leichtem Schütteln für 30 min bei Raumtemperatur zu DNA und Hilfe bei der Reduktion von flockiges Material zersetzen.
- Nehmen Sie eine kleine Teilmenge der Membransuspension und führen Protein Quantifizierung auf insgesamt Membran Ertrag. Wir bereiten in der Regel unverdünnt, verdünnt 1:1 (in 2,5% SDS), und 1:3 verdünnt (in 2,5% SDS)-Membran-Proben, Wärme die Proben bei 90 ° C für 10 min, und die Verwendung des BioRad DC Protein Assay zur Quantifizierung die Membran Resuspension Proteinkonzentration. Insgesamt Proteinausbeute ist in der Regel zwischen 1,0 mg / ml und 1,6 mg / ml. Die Nutzung von Wärme und SDS sind erforderlich, um OMPs aus dem extrahierten Membranen, so dass eine genauere Quantifizierung Protein-Wert erhalten werden kann loslassen.
- Bereiten linear Saccharosegradienten durch Schichtung 1,8 ml jeder der Saccharose-Lösungen (wt / wt, bereitete in 5 mM EDTA, pH 7,5) in 14 x 95 mm Ultra-Clear Ultrazentrifuge Rohre in der folgenden Reihenfolge: 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%. Layering von Saccharosegradienten ist am einfachsten zu führen, wenn Sie eine Glühbirne Pipette und nicht ein automatisiertes Pipette.
- Basierend auf der Membran Resuspension Protein Quantifizierung (Schritt 16), Layer 1,5 mg Membran Resuspension übereinander Gradienten. Jede 14 x 95 mm Ultrazentrifuge Rohr hat eine maximale Kapazität von 12,5 ml und, da die 10,8 ml für durch die Saccharose-Lösungen von Step 17 zu bilanzieren, sollten Sie nicht mehr als 1,7 ml Membran Resuspension pro Gradienten. Individuell abwägen und sorgfältig einstellen das Endgewicht der einzelnen Sucrosegradienten Rohr (durch Hinzufügen oder Entfernen Membran Resuspension), so dass alle Rohre gleich (± 0,01 g) wiegen.
- Transfer Saccharosegradienten in eine SW-40Ti Ausschwingrotor und Zentrifuge bei 256.000 x g (38.000 rpm) für mindestens 17 h bei 4 ° C.
Tag 4: Sammlung von Saccharose-Gradienten-Fraktionen
- Nach 17 h Zentrifugation, stoppen Sie die Zentrifuge laufen, und entfernen Sie vorsichtig Saccharosegradienten aus dem SW-40Ti Rotor.
- Reinigen Sie die Unterseite des Saccharose-Gradienten Rohr mit 70% Ethanol, Punktion derBoden des Röhrchens mit einer 21g Nadel, und sammeln Sie sequenzielle 500 ul-Fraktionen aus dem Gradienten in sterile Mikrozentrifugenröhrchen. Wiederholen Sie dies für nachfolgende Gradienten. Die Steigung erlaubt sein sollte, durch die Schwerkraft fließen Tropf sein, um nicht zu stören, die Saccharose-Gradienten. Wenn jedoch das tropfenden hört aus dem Boden des Gradienten Rohr, kann eine kleine Menge von Druck auf das obere Ende des Rohres mit dem Finger aufgetragen werden.
- Bestimmen Sie den Brechungsindex jeder Sucrosegradienten Bruchteil mit einem Refraktometer und korrelieren den Brechungsindex mit einer spezifischen Dichte in g / ml 1. Beurteilen Proteinlokalisierung durch die Vorbereitung Vertreter Sucrosegradienten Fraktionen (Dichte Schritten von 0,01; von 1,11 g / ml bis 1,26 g / ml) für die SDS-PAGE-Trennung, Transfer auf Nitrozellulose und Immunoblot.
Repräsentative Ergebnisse
Wenn korrekt durchgeführt, die Ergebnisse dieses Verfahrens in der vollständigen Trennung von IM und OM Vesikel aus beiden Typ A (zB SchuS4) und Typ B (zB LVS) Stämme von F. tularensis. Wie in repräsentativen Immunoblots in Abbildung 1, F. gezeigt tularensis OMPs lokalisieren zwischen Dichten von 1,17 und 1,20 g / ml. Im Vergleich zu lokalisieren IMPs zwischen Dichten von 1,13 und 1,14 g / ml.
Abbildung 1. Immunoblotting von F. tularensis Saccharose-Dichtegradienten. Sequential Fraktionen wurden aus Steigungen und Dichten (g / ml) wurden basierend auf Brechungsindizes berechnet gesammelt. Die Proteine wurden durch SDS-PAGE aufgetrennt, auf Nitrozellulose übertragen und immunogeblottet zu OMP und IMP Fraktionierung zu erkennen. mw, prestained Molekulargewichtsstandards mit Größen (in kDa) stellte fest, auf der linken Seite eines jeden Fleck. LVS, Ganzzelllysaten von F. tularensis LVS. Die entsprechenden Sucrosegradienten Bruchteil Dichten sind über ihre jeweiligen Fahrspuren zur Kenntnis genommen. OMPs und IMPs, wie in den linken Rand vermerkt, wurden mit polyklonalen, monospezifischen Antiseren erkannt. Ähnliche Ergebnisse wurden für F. erhalten tularensis SchuS4.
Discussion
Dieses Protokoll beschreibt eine Variation des Spheroplasting, osmotische Lyse und Saccharose-Dichtegradientenzentrifugation "Goldstandard" für die physikalische Trennung und Anreicherung von Gram-negativen Bakterien OMs aus anderen zellulären Komponenten 2, 3, 4. Während wir zuvor beschrieben die Anwendung dieser Methode zur Isolierung von OMs aus beiden Typ A und Typ B-Stämme von F. tularensis 5, bietet diese Präsentation einen detaillierteren und optimierte Verfahren für OM Isolation. Tatsächlich ist dies ein wichtiger Fortschritt für die Identifizierung potenziell an der Oberfläche ausgesetzt und mutmaßlichen Virulenzfaktoren von dieser tödlichen Erreger. Die Bedeutung dieser Verfahren wurde in Studien, die von unserem Labor zeigen, dass die Immunisierung von Mäusen mit gereinigtem OMPs gewährt wesentlichen Schutz gegen virulenten Typ A F. nachgewiesen tularensis pulmonalen Herausforderung 6. Wie oben erwähnt, Wachstumsphase der Bakterienzellen, die sorgfältige Überwachung während osmotischen Lyse und schonende Resuspension von Membran-Pellets sind wichtige Schritte, die mit Erfolg / Misserfolg dieser Membrantrennverfahren Verfahren korrelieren scheint. Während diese optimierte Methode ist streng und unterliegt einigen experimentellen Variabilität scheinen die daraus resultierenden OMs auf der bemerkenswert verbesserten Reinheit sein, dass diejenigen sammelte aus der Verwendung von Waschmitteln, Lithiumchlorid, oder Natriumcarbonat 7, 8, 9, 10, 11 verglichen, 12.
Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Das beschriebene Projekt wurde von Grant Numbers P01 AI055637 und U54 AI057156 von NIAID / NIH unterstützt. Sein Inhalt sind ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und stellen nicht notwendigerweise die offizielle Meinung des RCE Programme Office, NIAID oder NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Donor calf serum | Mediatech, Inc. | 35-022-CV | |
| IsoVitaleX | BD Biosciences | 211876 | |
| Cellgro molecular grade dH2O | Mediatech, Inc. | 46-000-CM | |
| 38.5 ml polycarbonate bottle | FiberLite | 010-0514 | |
| F50L-8x39 ultracentrifuge rotor | FiberLite | 096-087051 | |
| Complete mini EDTA-free protease inhibitor cocktail | Roche Group | 04693132001 | |
| Benzonase | Novagen, EMD Millipore | 70664-3 | |
| DC protein assay | Bio-Rad | 500-0116 | |
| Ultra-Clear 14x95mm centrifuge tubes | Beckman Coulter Inc. | 344060 | |
| SW-40Ti swinging bucket rotor | Beckman Coulter Inc. | 331301 | |
| Abbe benchtop refractometer | Fisher Scientific | 13-964-10 |
References
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