Summary
Un protocollo per la separazione di membrane interna ed esterna da
Abstract
Francisella tularensis è un batterio Gram-negativo coccobacillus intracellulare e l'agente eziologico della tularemia zoonosi. Rispetto ad altri batteri patogeni, la dose infettiva estremamente basso (<10 CFU), malattia a progressione rapida e alta morbilità e mortalità indicano che i ceppi virulenti di Francisella codificano per fattori di virulenza romanzo. Superficie esposta molecole, proteine di membrana e cioè esterna (OMP), hanno dimostrato di promuovere la cellula batterica ospite vincolante, entrata, sopravvivenza intracellulare, la virulenza e l'evasione del sistema immunitario. La rilevanza per lo studio OMP è ulteriormente sottolineata dal fatto che essi possono servire come vaccini protettivi contro una serie di malattie batteriche. Mentre OMP può essere estratto da batteri gram-negativi attraverso le tecniche di estrazione di massa della membrana, tra cui sonicazione di cellule seguita da centrifugazione e / o estrazione detergente, questi preparati sono spesso contaminati da periplasmatico e / o citoplasmatica (interno) della membrana (IM) i contaminanti. Per anni, il "gold standard" metodo per la separazione biochimica e biofisica della gram-negativi IM e membrane esterne (OM) è stato quello di batteri sottoposti a lisi spheroplasting e osmotica, seguita da centrifugazione in gradiente di densità di saccarosio. Una volta stratificato su un gradiente di saccarosio, OM può essere separata da IMS sulla base delle differenze nella densità di galleggiamento, crede di essere in gran parte basata sulla presenza di lipopolisaccaride (LPS) in OM. Qui, descriviamo un metodo rigoroso e ottimizzato per estrarre, arricchire, e isolare F. tularensis membrane esterne e le loro OMP associati.
Protocol
Giorno 1: F. tularensis piastra inoculazione
- Piastra colture base congelate di F. tularensis su Mueller-Hinton agar integrato con il 2,5% (vol / vol) donatore nel siero di vitello, 2% (vol / vol) IsoVitaleX, 0,1% (peso / volume) di glucosio, e 0,025% (peso / volume) pirofosfato di ferro. Crescere F. tularensis a 37 ° C con 5% di CO 2 per circa 24 h.
Giorno 2: F. tularensis inoculazione liquido dei media
- Preparare e autoclave 1 litro di cationi regolato Mueller-Hinton medio (1,23 contenente cloruro di calcio diidrato mM e 1,03 mM cloruro di magnesio esaidrato). Quando sono raffreddati a 37 ° C, media ulteriore supplemento con 0,1% (peso / volume) di glucosio, pirofosfato di ferro 0,025% (peso / volume), e il 2% (vol / vol) IsoVitaleX. Filtro sterilizzare (0,22 μ) di media in due aliquote da 500 ml.
- 12 ml di rimuovere integrato Mueller-Hinton media e il trasferimento in una sterile da 50 ml tubo Falcon.
- Usando una sterile 10 microlitri ansa da inoculo, raschiare un'ansata grande di F. crescita tularensis da piastre di agar (dal giorno 1) e batteri trasferimento in 12 ml di Mueller-Hinton medio (vedi punto 2). Volte la soluzione più pipetta di break-up grumi e preparare omogenea sospensione batterica. Non vortice.
- Utilizzando una pipetta sterile, inoculare ciascuna da 500 ml vaso con 5 ml di sospensione batterica dal punto 3. Grow culture brodo a 37 ° C per 14 a 18 h agitando delicatamente (190-200 giri al minuto su un Brunswick New Innova serie 2300 shaker).
3 ° giorno: Spheroplasting, la lisi osmotica, e la densità centrifugazione gradiente di saccarosio
- Ottenere F. culture tularensis dal agitazione incubatore e rimuovere una da 1 ml aliquota da ogni 500 ml di cultura per verificare la densità rispettive ottiche. Abbiamo trovato l'estrazione ottimale della membrana e dei risultati quando si usa l'isolamento F. cellule tularensis all'inizio fase logaritmica di crescita, che si correla con un diametro esterno 600 tra 0,2 e 0,4 (~ 10 LUGLIO - 10 AGOSTO UFC / ml). Culture, con un diametro esterno 600 inferiore a 0,2 non produrrà quantità sufficiente di materiali membrana totale per le sfumature saccarosio successive. Al contrario, le culture con un diametro esterno 600 superiore a 0,4 (in via di fase stazionaria) sono stati trovati per produrre misto membrana fusioni.
- Centrifugare culture a 7.500 x g per 30 minuti a 15 ° C per raccogliere le cellule. Si consiglia di centrifugazione di culture in quattro bottiglie da 250 ml centrifuga, perché facilita successiva sospensione a pellet.
- Rimuovere con attenzione il sopranatante media da ogni bottiglia centrifuga e picchiettare le bottiglie in materiale assorbente per eliminare l'eccesso di crescita medio.
- Entro 10 minuti dopo il completamento della centrifugazione, ogni sospensione batterica pellet in 8,75 ml di saccarosio 0,75 M (in 5 mM Tris, pH 7,5). Tutti e quattro i pellet batterico deve essere sospeso e trasferito (35 totale ml di sospensione batterica) ad una sterile pallone da 250 ml (con un piccolo stirbar) entro 10 minuti.
- Mentre dolcemente mescolando la sospensione cellulare su un stirplate, aggiungere lentamente 70 ml (2 volumi) di 10 mm disodico EDTA (in 5 mM Tris, pH 7.8) nel corso di 10 min. Aggiungere la soluzione di EDTA con la punta della pipetta di sotto del livello di sospensione cellulare al fine di evitare elevate concentrazioni locali di EDTA. Il stirbar dovrebbe essere a rotazione ad una velocità sufficiente per mescolare completamente la sospensione cellulare, ma non abbastanza veloce da provocare la formazione di schiuma o bolle. Dopo la soluzione di EDTA è stato aggiunto, incubare la soluzione per 30 minuti a temperatura ambiente.
- Dopo l'incubazione 30 minuti, aggiungere lentamente 11 ml (° 1 / 10 del volume) di un mg / ml 2 soluzione di lisozima alla concentrazione finale di 200 mg / ml. Continuare a mescolare la sospensione cellulare durante l'aggiunta soluzione di lisozima. Come notato sopra, aggiungere la soluzione di lisozima con la punta della pipetta di sotto del livello del liquido cellulare sospensione per evitare elevate concentrazioni locali di lisozima. Soluzioni madre lisozima (2 mg / ml) possono essere preparati in monouso aliquote e conservati a -20 ° C per 3-4 mesi. Incubare la soluzione così ottenuta per 30 minuti a temperatura ambiente.
- Durante l'incubazione 30 minuti, preparare un pallone sterile 1L con un piccolo stirbar e 530 ml di temperatura ambiente Cellgro Molecolare Grado dH 2 O (4,5 volumi).
- Osmoticamente lisare la sospensione cellulare (a partire dal punto 6) per diluizione lenta (velocità di flusso di circa 11 ml / min) in 530 ml di dH Molecolare Grado 2 O (dal punto 7) nel corso di 10 a 15 minuti con miscelazione delicata. A causa del volume della soluzione più grandi in questa fase, aumentare la velocità stirbar per garantire la corretta miscelazione. Il stirbar dovrebbe essere a rotazione ad una velocità sufficiente a disperdere completamente la sospensione cellulare, una volta aggiunti ai 2 dH O, ma non abbastanza veloce per portare alla formazione di schiuma o bolle. Aggiungere la sospensione cellulare con la punta della pipetta appoggiato sul fondo del pallone, adiacente al stirbar, per facilitare la diluizione uniforme del cell sospensione. Abbiamo scoperto che da 25 ml pipette funzionano meglio durante questa fase. Monitorare attentamente il processo di diluizione e interrompere il flusso, se necessario, per disperdere gli accumuli locali di cellule, ammassi di cellule, e ciuffi cellulare. Incubare la soluzione così ottenuta per 30 minuti a temperatura ambiente. Si noti che questo passo sembra essere una delle più difficili e critici per il successo globale di questo esperimento.
- Dopo l'incubazione 30 minuti, trasferire 40 ml di soluzione di lisi osmotica in tubi conici da 50 ml e centrifugare a 7500 xg per 30 minuti a 10 ° C per rimuovere le cellule intatte e detriti.
- Dopo la centrifugazione, rimuovere con cautela 27-30 ml di surnatante da ogni tubo conico e surnatanti piscina in un recipiente sterile 1L
- Trasferire 25 ml di surnatante in pool, ciascuna, in 16 tubi ultracentrifuga e centrifugare a 200.000 g (44.400 rpm in F50L-8x39 rotore Fiberlite ultracentrifuga) per 2 ore a 4 ° C. Si noti che ogni rotore contiene 8 tubi, così questo passo richiede due rotori e due ultracentrifughe. In alternativa, la seconda serie di 8 tubi dovrebbero essere tenute a 4 ° C fino centrifugato.
- Entro 10 minuti della fine del percorso ultracentrifuga, preparare modificato risospensione del buffer membrana. Trasferimento 8 ml di tampone membrana sospensione (25% [wt / wt] saccarosio, 5 mM Tris, 30 mM MgCl 2) in una provetta sterile e aggiungere 1 compressa di EDTA-free cocktail inibitori della proteasi e 375 U di benzonasi. Mescolare delicatamente la soluzione per sciogliere inibitore della proteasi compressa.
- A seguito di ultracentrifugazione, accuratamente versare off surnatanti, invertire i tubi ultracentrifuga su materiale assorbente e picchiettare tubi per rimuovere il surnatante in eccesso. Segnare la posizione di ciascun pellet membrana con un pennarello per aiutare nella visualizzazione. Risospendere delicatamente otto pellet membrana con 600 microlitri di tampone ogni membrana modificata risospensione. Trasferimento di ogni risospensione membrana per la prossima serie di otto tubi, risospendere delicatamente questi otto pellet, e la piscina resuspensions membrana risultante in un tubo sterile. Le membrane di pellet sono difficili da riportare in sospensione, in modo da continuare a passare la modifica tampone risospensione membrana sopra il pellet fino a quando non si stacca dalla parete del tubo. Spesso è necessario utilizzare la punta micropipetta per raschiare il pellet membrana al largo della parete del tubo e gli aiuti nel processo di risospensione. Quando pipettaggio, evitare la formazione di schiuma o formazione di bolle. Si noti che questo passo sembra essere una delle più difficili e critici per il successo globale di questo esperimento.
- Quando la membrana pellet sono stati risospesi e rimosso da tutti i 16 tubi, lavare ogni quattro tubi con 600 ml di buffer di membrana modificata risospensione. Il lavaggio dovrebbe essere focalizzata intorno alla zona segnata (membrana pellet) di ciascun tubo. Trasferire il lavaggio nel tubo risospensione membrana. Ripetere la fase di lavaggio per i restanti tre serie di quattro tubi.
- Incubare la risospensione membrana con dondolo dolce per 30 minuti a temperatura ambiente per degradare il DNA e l'aiuto nella riduzione del materiale flocculante.
- Rimuovere una piccola aliquota della sospensione membrana ed eseguire la quantificazione di proteine per determinare la resa totale della membrana. Noi di solito preparare non diluito, diluito 1:1 (nel 2,5% SDS), e 1:3 diluito (nel 2,5% SDS) i campioni di membrana, i campioni di calore a 90 ° C per 10 minuti, e utilizzare il BioRad DC Protein Assay per quantificare la membrana risospensione concentrazione proteica. Resa di proteine totali è generalmente compreso tra 1,0 mg / ml e 1,6 mg / ml. L'utilizzo di calore e di SDS sono tenuti a rilasciare OMP dalle membrane estratte in modo che una più accurata quantificazione del valore proteico può essere ottenuto.
- Preparare gradienti di saccarosio lineare stratificazione 1,8 ml ognuna delle soluzioni di saccarosio (peso / peso, preparata in 5 mM EDTA, pH 7,5) in 14 x 95 mm Ultra-Clear tubi ultracentrifuga nel seguente ordine: 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%. Stratificazione di gradienti di saccarosio è più facile da eseguire quando si utilizza una pipetta a bulbo, non un pipettatore automatico.
- Basato sulla quantificazione delle proteine di membrana risospensione (Step 16), strato di 1,5 mg di risospensione membrana in cima ad ogni pendenza. Ogni x 14 95 tubo ultracentrifuga mm ha una capacità massima di 12,5 ml e, visto che 10,8 ml è rappresentata dalle soluzioni di saccarosio a partire dal punto 17, non si deve caricare più di 1,7 ml di risospensione membrana per gradiente. Peso individuale e regolare con cura il peso finale di ogni tubo gradiente di saccarosio (aggiungendo o rimuovendo risospensione membrana) in modo che tutti i tubi pesano uguali (± 0,01 g).
- Trasferimento gradienti di saccarosio in una SW-40Ti rotore oscillante e centrifugare a 256.000 x g (38.000 rpm) per un minimo di 17 ore a 4 ° C.
Giorno 4: Raccolta delle frazioni gradiente di saccarosio
- Dopo 17 h di centrifugazione, fermare la corsa centrifuga, e rimuovere attentamente gradienti di saccarosio dalla SW-40Ti rotore.
- Pulire accuratamente la parte inferiore del tubo gradiente di saccarosio con il 70% di etanolo, la punturafondo della provetta con un ago 21G, e raccogliere frazioni sequenziale 500 microlitri dal gradiente in provette sterili microcentrifuga. Ripetere l'operazione per gradienti successive. Il gradiente dovrebbe essere consentito a gocciolare dal flusso di gravità, in modo da non disturbare il gradiente di saccarosio. Tuttavia, se il gocciolamento cessa dalla parte inferiore del tubo di pendenza, una piccola quantità di pressione può essere applicato alla parte superiore del tubo usando un dito.
- Determinare l'indice di rifrazione di ogni frazione gradiente di saccarosio utilizzando un rifrattometro e correlare l'indice di rifrazione con una densità specifica in g / ml 1. Valutare la localizzazione delle proteine con la preparazione rappresentante frazioni gradiente di saccarosio (incrementi di densità di 0,01, da 1,11 g / ml a 1,26 g / ml) per SDS-PAGE la separazione, il trasferimento di nitrocellulosa, e immunoblotting.
Rappresentante Risultati
Quando eseguito correttamente, questa procedura comporta la completa separazione di IM e vescicole OM sia da Tipo A (ad esempio SchuS4) e di tipo B (per esempio LVS) ceppi di F. tularensis. Come mostrato in immunoblot rappresentante nella Figura 1, F. OMP tularensis localizzare tra densità di 1,17 e 1,20 g / ml. In confronto, PIM localizzare tra densità di 1,13 e 1,14 g / ml.
Figura 1. Immunoblotting di F. tularensis gradienti di densità di saccarosio. Frazioni sequenziali sono stati raccolti da sfumature e densità (g / ml) sono stati calcolati sulla base degli indici di rifrazione. Le proteine sono state separate mediante SDS-PAGE, trasferite su nitrocellulosa, e immunoblotted per rilevare OMP e frazionamento IMP. mw, prestained standard di peso molecolare con dimensioni (in kDa) ha notato sul lato sinistro di ogni macchia. LVS, lisati di cellule intera F. tularensis LVS. La densità di saccarosio corrispondente frazione del gradiente sono notati sopra le loro rispettive corsie. OMP e PIM, come indicato sul margine sinistro, sono stati rilevati con policlonali, antisieri monospecifici. Risultati simili sono stati ottenuti per F. tularensis SchuS4.
Discussion
Questo protocollo descrive una variazione del spheroplasting, la lisi osmotica, e la densità del gradiente di saccarosio "gold standard" centrifuga per la separazione fisica e l'arricchimento di batteri Gram-negativi OM da altri componenti cellulari 2, 3, 4. Mentre noi precedentemente descritto l'applicazione di questo metodo per isolare OM da entrambi i ceppi di tipo A e tipo B di F. tularensis 5, questa presentazione offre una procedura più dettagliata e ottimizzata per l'isolamento OM. In effetti, questo è un importante passo avanti per identificare potenzialmente superficie esposta e fattori di virulenza presuntiva da questo patogeno mortale. Il significato di questa procedura è stata dimostrata in studi dal nostro laboratorio mostrano che l'immunizzazione di topi con OMP purificata garantita una sostanziale protezione contro la virulenta Tipo A F. tularensis sfida polmonare 6. Come notato sopra, fase di crescita delle cellule batteriche, un attento monitoraggio durante la lisi osmotica e risospensione del pellet delicata membrana sono passaggi critici che sembrano correlare con successo / insuccesso di questa procedura di separazione a membrana. Mentre questo metodo ottimizzato è rigorosa e soggetta a variabilità sperimentale, il conseguente OM sembrano essere di purezza molto maggiore rispetto a quelli ottenuto dall'uso di detergenti, cloruro di litio, sodio o carbonato di 7, 8, 9, 10, 11, 12.
Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Il progetto descritto è stato sostenuto da numeri di Grant P01 AI055637 e U54 AI057156 dal NIAID / NIH. I suoi contenuti sono di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale dei Programmi RCE Office, NIAID, o NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Donor calf serum | Mediatech, Inc. | 35-022-CV | |
| IsoVitaleX | BD Biosciences | 211876 | |
| Cellgro molecular grade dH2O | Mediatech, Inc. | 46-000-CM | |
| 38.5 ml polycarbonate bottle | FiberLite | 010-0514 | |
| F50L-8x39 ultracentrifuge rotor | FiberLite | 096-087051 | |
| Complete mini EDTA-free protease inhibitor cocktail | Roche Group | 04693132001 | |
| Benzonase | Novagen, EMD Millipore | 70664-3 | |
| DC protein assay | Bio-Rad | 500-0116 | |
| Ultra-Clear 14x95mm centrifuge tubes | Beckman Coulter Inc. | 344060 | |
| SW-40Ti swinging bucket rotor | Beckman Coulter Inc. | 331301 | |
| Abbe benchtop refractometer | Fisher Scientific | 13-964-10 |
References
- Price, C. A. Centrifugation in density gradients. , Academic Press. 335-335 (1982).
- Osborn, M. J., Gander, J. E., Parisi, E., Carson, J. Mechanism of assembly of the outer membrane of Salmonella typhimurium. Isolation and characterization of cytoplasmic and outer membrane. J Biol Chem. 247 (12), 3962-3962 (1972).
- Nikaido, H. Isolation of outer membranes. Methods Enzymol. 235, 225-225 (1994).
- Mizuno, T., Kageyama, M. Separation and characterization of the outer membrane of Pseudomonas aeruginosa. J Biochem. 84 (1), 179-179 (1978).
- Huntley, J. F., Conley, P. G., Hagman, K. E., Norgard, M. V. Characterization of Francisella tularensis outer membrane proteins. J Bacteriol. 189, 561-561 (2007).
- Huntley, J. F. Native outer membrane proteins protect mice against pulmonary challenge with virulent type A Francisella tularensis. Infect Immun. 76 (8), 3664-3664 (2008).
- Bevanger, L., Maeland, J. A., Naess, A. I. Agglutinins and antibodies to Francisella tularensis outer membrane antigens in the early diagnosis of disease during an outbreak of tularemia. J Clin Microbiol. 26 (3), 433-433 (1988).
- Hubalek, M. Towards proteome database of Francisella tularensis. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 787 (1), 149-149 (2003).
- Pavkova, I. Francisella tularensis live vaccine strain: proteomic analysis of membrane proteins enriched fraction. Proteomics. 5 (9), 2460-2460 (2005).
- Sandstrom, G., Tarnvik, A., Wolf-Watz, H. Immunospecific T-lymphocyte stimulation by membrane proteins from Francisella tularensis. J Clin Microbiol. 25 (4), 641-641 (1987).
- Sjostedt, A., Tarnvik, A., Sandstrom, G. The T-cell-stimulating 17-kilodalton protein of Francisella tularensis LVS is a lipoprotein. Infect Immun. 59 (9), 3163-3163 (1991).
- Twine, S. M. Francisella tularensis proteome: low levels of ASB-14 facilitate the visualization of membrane proteins in total protein extracts. J Proteome Res. 4 (5), 1848-1848 (2005).
