Summary
Un protocolo para la separación de membranas internas y externas de
Abstract
Francisella tularensis es un cocobacilo Gram-negativa intracelular y el agente causante de la tularemia enfermedad zoonótica. En comparación con otros patógenos bacterianos, la dosis infecciosa muy baja (<10 UFC), la progresión rápida de la enfermedad, y la morbilidad y mortalidad sugieren que las cepas virulentas de Francisella codifican factores de virulencia de la novela. Superficie expuesta moléculas, las proteínas de membrana externa a saber (OMP), se ha demostrado que promover la unión de la célula huésped bacteriana, de entrada, la supervivencia intracelular, la virulencia y la evasión inmune. La relevancia para el estudio de OMPs es aún más por el hecho de que pueden servir como vacunas de protección contra una serie de enfermedades bacterianas. Mientras que OMPs se puede extraer de bacterias gram-negativas a través de técnicas de mayor extracción de la membrana, incluyendo la sonicación de las células, seguido de centrifugación y / o extracción con detergente, estas preparaciones son a menudo contaminados con periplásmico y / o citoplásmica (interior) de la membrana (IM) los contaminantes. Durante años, el "patrón oro" método para la separación de bioquímica y biofísica de bacterias gram-negativas de mensajería instantánea y las membranas externa (OM) ha sido el de las bacterias sometidas a lisis osmótica y spheroplasting, seguido por centrifugación en gradiente de densidad de sacarosa. Una vez en capas en un gradiente de sacarosa, la OMS puede ser separado de mensajes instantáneos basados en las diferencias en la densidad de flotación, que se cree basa en gran medida de la presencia de lipopolisacárido (LPS) de la OM. Aquí se describe un método riguroso y optimizado para extraer, enriquecer y aislar F. tularensis membranas externas y sus asociados OMPs.
Protocol
Día 1: F. tularensis inoculación placa
- Cultivos en placa de valores congelados de F. tularensis en agar Mueller-Hinton suplementado con 2,5% (vol / vol) de los donantes de suero de ternera, 2% (vol / vol) IsoVitaleX, el 0,1% (wt / vol) de glucosa, y el 0,025% (wt / vol) de pirofosfato de hierro. Crecer F. tularensis a 37 ° C con 5% de CO 2 durante aproximadamente 24 h.
Día 2: F. líquido tularensis medios de inoculación
- Preparar y autoclave de 1 litro de cationes ajustados Mueller-Hinton (que contiene calcio 1,23 mM de dihidrato de cloruro de magnesio hexahidratado y 1,03 mM de cloruro). Cuando se enfría a 37 ° C, medio complementar aún más con el 0,1% (wt / vol) de glucosa, 0.025% (wt / vol) de pirofosfato de hierro, y el 2% (vol / vol) IsoVitaleX. Filtro de esterilización (0,22 μ) medio en dos alícuotas de 500 ml.
- Quitar 12 ml de Mueller-Hinton complementado medio y la transferencia en una estéril de 50 ml tubo Falcon.
- Utilizando una aguja estéril de 10 l asa de siembra, raspar un asa grande de F. tularensis crecimiento de las placas de agar (a partir del día 1) y las bacterias de transferencia en 12 ml de Mueller-Hinton (ver paso 2). Adición de la solución de múltiples ocasiones de ruptura de grupos y preparar la suspensión bacteriana homogénea. No vórtice.
- Con una pipeta estéril, inocular cada buque de 500 ml con 5 ml de suspensión bacteriana desde el paso 3. Los cultivos de caldo a 37 ° C durante 14 a 18 h con agitación suave (190 a 200 rpm en un agitador New Brunswick Innova serie 2300).
Día 3: lisis Spheroplasting, osmótico y la centrifugación en gradiente de densidad de sacarosa
- Obtener F. culturas tularensis de la incubadora de agitación y eliminar una alícuota de 1 ml de cada cultivo de 500 ml para comprobar la densidad óptica correspondiente. Hemos encontrado la extracción de la membrana y los resultados óptimos cuando se utiliza el aislamiento F. tularensis células en una fase inicial de crecimiento logarítmico, que se correlaciona con una OD 600 entre 0,2 y 0,4 (~ 07 10 hasta 08 10 UFC / ml). Culturas con un OD 600 a menos de 0,2 no dará la suficiente cantidad de material de la membrana total de gradientes de sacarosa posteriores. Por el contrario, las culturas con una OD 600 superior a 0,4 (cerca de la fase estacionaria) se ha encontrado que el rendimiento mixto membrana fusiones.
- Centrifugar los cultivos a 7.500 x g durante 30 minutos a 15 ° C para recoger las células. Se recomienda la centrifugación de las culturas de cada cuatro botellas de centrífuga de 250 ml, ya que facilita la posterior suspensión de pellets.
- Retire con cuidado el sobrenadante los medios de comunicación de cada botella de centrífuga y golpear firmemente las botellas en material absorbente para eliminar el exceso de medio de cultivo.
- Dentro de la terminación de 10 minutos después de la centrifugación, suspender cada sedimento bacteriano en 8,75 ml de sacarosa 0,75 M (en 5 mM Tris, pH 7,5). Los cuatro pellets bacteriana debe ser suspendido y transferido (35 total de ml de suspensión bacteriana) a un recipiente estéril de 250 ml frasco (con una pequeña stirbar) en 10 minutos.
- Mientras mezclar suavemente la suspensión celular en un stirplate, agregue lentamente 70 ml (2 volúmenes), de 10 mM EDTA disódico (en 5 mM Tris, pH 7,8) a lo largo de 10 min. Añadir la solución de EDTA con la punta de la pipeta por debajo del nivel de suspensión de células para evitar la elevación de las concentraciones locales de EDTA. El stirbar debería estar girando a una velocidad suficiente para mezclar completamente la suspensión de células, pero no lo suficientemente rápido para producir espuma o la formación de burbujas. Después de la solución de EDTA se ha añadido, se incuba la solución durante 30 minutos a temperatura ambiente.
- Después de la incubación de 30 minutos, agregue lentamente 11 ml (volumen 1 / 10 º) de 2 mg / ml de solución de lisozima a una concentración final de 200 mg / ml. Continúe mezclando la suspensión celular durante la adición de solución de lisozima. Como se señaló anteriormente, añadir la solución de lisozima con la punta de la pipeta por debajo del nivel de células de fluido de suspensión para evitar la elevación de las concentraciones locales de la lisozima. Soluciones madre lisozima (2 mg / ml) se puede preparar en un solo uso alícuotas y almacenado a -20 ° C durante tres a cuatro meses. Incube la solución resultante durante 30 minutos a temperatura ambiente.
- Durante la incubación de 30 minutos, prepare un frasco de 1 litro estéril con una pequeña stirbar y 530 ml de la temperatura ambiente Cellgro molecular Grado dH 2 O (4,5 volúmenes).
- Osmóticamente lisis de la suspensión celular (del paso 6) por la dilución lenta (velocidad de flujo de aproximadamente 11 ml / min) en 530 ml de Biología Molecular Grado dH 2 O (del paso 7) en el transcurso de 10 a 15 minutos con una mezcla suave. Debido al volumen de la solución más importante en este paso, aumentar la velocidad stirbar para asegurar una mezcla adecuada. El stirbar debería estar girando a una velocidad suficiente para dispersar completamente la suspensión de células, una vez añadido a la DH 2 O, pero no lo suficientemente rápido para dar lugar a formación de espuma o la formación de burbujas. Añadir la suspensión de células con la punta de la pipeta descansando en el fondo del frasco, junto a la stirbar, para facilitar la dilución uniforme del cell de la suspensión. Hemos encontrado que 25 ml pipetas funcionan mejor durante esta etapa. Que observe cuidadosamente el proceso de dilución y de interrumpir el caudal necesario para dispersar a la acumulación local de las células, grupos de células, y mechones de la célula. Incube la solución resultante durante 30 minutos a temperatura ambiente. Tenga en cuenta que este paso parece ser uno de los más difíciles y críticos para el éxito global de la prueba.
- Después de la incubación de 30 minutos, la transferencia de alícuotas de 40 ml de la solución de lisis osmótica en 50 ml tubos cónicos y se centrifuga a 7500 xg durante 30 min a 10 ° C para eliminar las células intactas y los escombros.
- Tras la centrifugación, retire con cuidado 27 a 30 ml de sobrenadante de cada tubo cónico y sobrenadantes de la piscina en un frasco estéril de 1 litro
- 25 ml de sobrenadante agrupados, cada uno, en 16 tubos de ultracentrífuga y centrifugar a 200.000 xg (44.400 rpm en F50L-8x39 rotor ultracentrífuga Fiberlite) durante 2 horas a 4 ° C. Tenga en cuenta que cada rotor con capacidad para 8 tubos, por lo que este paso requiere de dos rotores y ultracentrífugas dos. Por otra parte, el segundo conjunto de 8 tubos deben mantenerse a 4 ° C hasta que se centrifuga.
- Dentro de los 10 minutos de la finalización de la ejecución de ultracentrifugación, preparar modificado buffer membrana resuspensión. Transferencia de 8 ml de tampón de suspensión de membrana (25% [p / p] sacarosa, 5 mM Tris, 30 mM MgCl 2) a un tubo estéril y añadir 1 tableta de EDTA libre de cóctel inhibidor de la proteasa y 375 U de Benzonase. Mezclar suavemente la solución para disolver la tableta inhibidor de la proteasa.
- Después de ultracentrifugación, cuidadosamente vierta sobrenadantes, invertir los tubos de ultracentrífuga con material absorbente, y golpear firmemente los tubos para eliminar el exceso de sobrenadante. Marca la ubicación de cada pastilla de membrana con un marcador para ayudar en la visualización. Resuspenda suavemente ocho pastillas de membrana de 600 l cada uno de buffer modificado la resuspensión de la membrana. La transferencia de cada resuspensión de membrana para la siguiente serie de ocho tubos, resuspender suavemente estos ocho pastillas, y la piscina resuspensiones membrana que resulta en un tubo estéril. Las membranas de pellets son difíciles de volver a suspender, por lo que seguirá pasando el buffer de resuspensión de la membrana modificada por la pastilla hasta que se desprende de la pared del tubo. A menudo es necesario utilizar la punta de la micropipeta para raspar el pellet de membrana de la pared del tubo y la ayuda en el proceso de resuspensión. Cuando pipeteo, evitar formación de espuma o la formación de burbujas. Tenga en cuenta que este paso parece ser uno de los más difíciles y críticos para el éxito global de la prueba.
- Cuando los gránulos de la membrana se han resuspendido y se retira de los 16 tubos, lavar cada cuatro tubos con 600 l de buffer modificado la resuspensión de la membrana. El lavado debe centrarse en torno a la zona marcada (membrana pellet) de cada tubo. Transferencia del lavado en el tubo de la resuspensión de la membrana. Repita el paso de lavado para los restantes tres series de cuatro tubos.
- Incubar la resuspensión de membrana con balanceo suave durante 30 minutos a temperatura ambiente para degradar el ADN y la ayuda en la reducción de material floculante.
- Eliminar una pequeña alícuota de la suspensión de membrana y llevar a cabo la cuantificación de proteínas para determinar el rendimiento total de la membrana. Por lo general preparan sin diluir, 01:01 diluido (en el 2,5% SDS), y 1:3 diluido (en el 2,5% SDS) muestras de membrana, el calor de las muestras a 90 ° C durante 10 minutos, y el uso del ensayo BioRad DC Proteína de cuantificar la resuspensión de concentración de proteínas de membrana. Producción de proteína total es por lo general entre 1,0 mg / ml y 1,6 mg / ml. El uso del calor y la Ficha de Seguridad está obligado a liberar OMPs de las membranas extraídas de manera que un valor de la proteína cuantificación más precisa se puede obtener.
- Prepare gradientes lineales de sacarosa por capas de 1,8 ml cada una de las soluciones de sacarosa (p / p, preparado en 5 mM EDTA, pH 7,5) a 14 x 95 mm tubos de ultracentrífuga ultra claro en el siguiente orden: 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%. Capas de gradientes de sacarosa es más fácil de realizar cuando se utiliza una pipeta de bulbo, no una pipeta automática.
- En base a la cuantificación de proteínas de membrana resuspensión (Paso 16), la capa de 1,5 mg de resuspensión de membrana en la parte superior de cada gradiente. Cada 14 x 95 tubo de ultracentrífuga mm tiene una capacidad máxima de 12,5 ml y, dado que el 10,8 ml se explica por las soluciones de sacarosa a partir del paso 17, no se debe cargar más de 1,7 ml de la resuspensión de la membrana por gradiente. Individualmente pesan y ajustar cuidadosamente el peso final de cada tubo de gradiente de sacarosa (añadiendo o quitando la resuspensión de membrana), de modo que todos los tubos tienen el mismo peso (± 0,01 g).
- Transferencia de gradientes de sacarosa en un cubo de rotor SW-40Ti movimientos de balanceo y centrifugado a 256.000 xg (38.000 rpm) durante un mínimo de 17 horas a 4 ° C.
Día 4: Recolección de fracciones gradiente de sacarosa
- Después de 17 h de la centrifugación, detener la ejecución de centrífuga, y retirar con cuidado gradientes de sacarosa del rotor SW-40Ti.
- Limpie cuidadosamente la parte inferior del tubo de gradiente de sacarosa con 70% de etanol, la punción de laparte inferior del tubo con una aguja 21G, y recoger secuencial 500 fracciones l del gradiente en tubos de microcentrífuga estéril. Repita el procedimiento para gradientes posteriores. El gradiente se debe permitir que por goteo por gravedad, a fin de no perturbar el gradiente de sacarosa. Sin embargo, si cesa el goteo de la parte inferior del tubo de gradiente, una pequeña cantidad de presión se puede aplicar a la parte superior del tubo con el dedo.
- Determinar el índice de refracción de cada fracción de gradiente de sacarosa con un refractómetro y correlacionar el índice de refracción con un peso específico en g / ml 1. Evaluar la localización de la proteína mediante la preparación de representante de las fracciones gradiente de sacarosa (incrementos de la densidad de 0,01, de 1,11 g / ml a 1,26 g / ml) para la separación SDS-PAGE, transferencia a nitrocelulosa y de inmunotransferencia.
Resultados representante
Cuando se realiza correctamente, este procedimiento resulta en la separación completa de la mensajería instantánea y las vesículas OM, tanto Tipo A (por ejemplo, SchuS4) y B (por ejemplo, LVS) de las cepas de F. tularensis. Como se muestra en immunoblots representante en la figura 1, F. OMPs tularensis localizar entre las densidades de 1,17 y 1,20 g / ml. En comparación, el PIM localizar entre las densidades de 1,13 y 1,14 g / ml.
Figura 1. Immunoblotting de F. tularensis gradientes de densidad de sacarosa. Secuencial fracciones se obtuvieron de los degradados y las densidades (g / ml) se calcula en base a índices de refracción. Las proteínas fueron separadas por SDS-PAGE, transferidos a nitrocelulosa, y inmunoblot para detectar OMP y fraccionamiento IMP. mw, prestained estándares de peso molecular con un tamaño (en kDa) señaló en el lado izquierdo de cada mancha. LVS, lisados de células enteras de F. LVS tularensis. La densidad de sacarosa correspondiente fracción de gradiente se observan por encima de sus carriles respectivos. OMPs y PIM, como se señala en el margen izquierdo, se detectaron con el antisuero policlonal monoespecífico. Resultados similares fueron obtenidos por F. tularensis SchuS4.
Discussion
Este protocolo describe una variación de la lisis spheroplasting, osmótica, y la densidad de centrifugación en gradiente de sacarosa "patrón oro" para la separación física y el enriquecimiento de las bacterias Gram-negativas OM de otros componentes celulares 2, 3, 4. Mientras que se ha descrito anteriormente la aplicación de este método para aislar OM de ambas cepas del tipo A y tipo B de F. tularensis 5, esta presentación ofrece un procedimiento más detallado y optimizado para el aislamiento de OM. De hecho, este es un avance importante para la identificación de potenciales de superficie expuesta y los factores de virulencia de este presunto patógeno mortal. La importancia de este procedimiento se ha demostrado en estudios realizados por nuestro laboratorio muestran que la inmunización de ratones con OMPs purificadas conceden una considerable protección contra el tipo A virulenta F. tularensis pulmonar reto 6. Como se señaló anteriormente, la fase de crecimiento de las células bacterianas, un monitoreo cuidadoso durante la lisis osmótica y la resuspensión de pellets suave membrana son pasos críticos que parecen estar en correlación con el éxito / fracaso de este procedimiento de separación por membranas. Si bien este método optimizado es riguroso y está sujeto a cierta variabilidad experimental, el resultado OM parecen ser de calidad muy mejorada en comparación con los obtenido por el uso de detergentes, cloruro de litio, carbonato de sodio o 7, 8, 9, 10, 11, 12.
Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
El proyecto descrito fue apoyada por los números de Grant P01 AI055637 y AI057156 U54 del NIAID / NIH. Sus contenidos son de exclusiva responsabilidad de sus autores y no representan necesariamente la opinión oficial de la Oficina de Programas de ICE, el NIAID, o NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Donor calf serum | Mediatech, Inc. | 35-022-CV | |
| IsoVitaleX | BD Biosciences | 211876 | |
| Cellgro molecular grade dH2O | Mediatech, Inc. | 46-000-CM | |
| 38.5 ml polycarbonate bottle | FiberLite | 010-0514 | |
| F50L-8x39 ultracentrifuge rotor | FiberLite | 096-087051 | |
| Complete mini EDTA-free protease inhibitor cocktail | Roche Group | 04693132001 | |
| Benzonase | Novagen, EMD Millipore | 70664-3 | |
| DC protein assay | Bio-Rad | 500-0116 | |
| Ultra-Clear 14x95mm centrifuge tubes | Beckman Coulter Inc. | 344060 | |
| SW-40Ti swinging bucket rotor | Beckman Coulter Inc. | 331301 | |
| Abbe benchtop refractometer | Fisher Scientific | 13-964-10 |
References
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