Summary
Ett protokoll för att separera inre och yttre membran från
Abstract
Francisella tularensis är en gramnegativa intracellulära coccobacillus och vilka smittämnen av zoonotiska sjukdomen tularemi. Jämfört med andra bakteriella patogener, den extremt låga smittsam dos (<10 CFU), snabb sjukdomsutveckling och hög sjuklighet och dödlighet tyder på att virulenta stammar av Francisella koda för nya virulensfaktorer. Surface-exponerade molekyler, dvs yttre membranproteiner (OMPs), har visat att främja bakteriell värdcellens bindande, inträde, intracellulär överlevnad, virulens och immun skatteflykt. Relevansen för att studera OMPs ytterligare understryks av det faktum att de kan fungera som skyddande vaccin mot flera bakteriella sjukdomar. I OMPs kan utvinnas ur gramnegativa bakterier genom bulk tekniker membran utvinning, inklusive ultraljudsbehandling av celler följt av centrifugering och / eller tvättmedel extraktion, är dessa preparat ofta förorenade med periplasmic och / eller cytoplasmiska (inre) membran (IM) föroreningar. I åratal, den "gyllene standarden" metod för biokemiska och biofysiska separation av gramnegativa IM och yttre membran (OM) har varit att föremål bakterier att spheroplasting och osmotisk lys, följt av sackaros densitetsgradient centrifugering. När lager på ett sackaros övertoning kan OMS separeras från IMS baseras på skillnader i stigande tätheter, som tros vara bygger till stor del på förekomsten av lipopolysackarid (LPS) i OM. Här beskriver vi en noggrann och optimerad metod för att utvinna, berika och isolera F. tularensis yttre membran och tillhörande OMPs.
Protocol
Dag 1: F. tularensis tallrik ympning
- Tavla frysta stamkulturer F. tularensis på Mueller-Hinton agar kompletterad med 2,5% (vol / vol) givare kalvserum, 2% (vol / vol) IsoVitaleX, 0,1% (vikt / vol) glukos och 0,025% (vikt / vol) järnpyrofosfat. Väx F. tularensis vid 37 ° C med 5% CO 2 i cirka 24 timmar
Dag 2: F. tularensis flytande medier inympning
- Förbered och autoklav 1 liter katjoner justerade Mueller-Hinton medium (som innehåller 1,23 mM dihydrat kalciumklorid och 1,03 mM magnesiumkloridhexahydrat). När kyls till 37 ° C, ytterligare komplettera medium med 0,1% (vikt / vol) glukos, 0,025% (vikt / vol) järnpyrofosfat och 2% (vol / vol) IsoVitaleX. Filter sterilisera (0,22 μ) medium i två 500-ml-portioner.
- Ta 12 ml kompletteras Mueller-Hinton medium och överföring till en steril 50 ml Falcon rör.
- Använd en steril 10-l ympning slinga, skrapa en stor ögla med F. tularensis tillväxt från agarplattor (från dag 1) och bakterier överförs till 12 ml Mueller-Hinton medium (se steg 2). Pipettera lösning flera gånger för att bryta upp klumpar och förbereda homogen bakteriesuspension. Inte virvel.
- Använd en steril pipett inokulera varje 500 ml-fartyg med 5 ml bakteriesuspension från steg 3. Väx buljong kulturer vid 37 ° C i 14 till 18 tim med försiktig skakning (190-200 rpm på en New Brunswick Innova 2300-serien shaker).
Dag 3: Spheroplasting, osmotisk lys och sackaros densitetsgradient centrifugering
- Skaffa F. tularensis kulturer från skakar inkubatorn och ta en 1-ml alikvot från varje 500 ml-kulturen för att kontrollera respektive optiska densitet. Vi har hittat en optimal membranet utvinning och resultat isolering när du använder F. tularensis celler i tidiga logaritmiska tillväxtfas, som korrelerar med en OD 600 mellan 0,2 till 0,4 (~ 10 juli - 10 Augusti CFU / ml). Kulturer med ett OD-600 är mindre än 0,2 kommer inte att ge tillräcklig mängd av det totala membran material för efterföljande sackaros gradienter. Omvänt har kulturer med ett OD-600 är större än 0,4 (nästan stationär fas) visat sig ge blandade membran fusioner.
- Centrifugera kulturer på 7500 x g 30 min vid 15 ° C för att samla in cellerna. Vi rekommenderar centrifugering av kulturer i fyra 250 ml-centrifug flaskor, eftersom det underlättar efterföljande pellets suspension.
- Ta försiktigt bort media supernatanten från varje centrifug flaska och stadigt tryck på flaskorna på absorberande material för att avlägsna överflödig tillväxt medium.
- Inom 10 minuter efter avslutad centrifugering, upphäva varje bakteriell pelleten i 8,75 ml 0,75 M sackaros (i 5 mM Tris, pH 7,5). Alla fyra bakteriella pellets bör skjutas upp och överföras (35 ml totalt bakteriesuspensionen) till en steril 250 ml-kolv (med en liten stirbar) inom 10 min.
- Medan försiktigt blanda cellsuspension på en stirplate, långsamt lägga 70 ml (2 volymer) på 10 mm dinatrium EDTA (i 5 mM Tris, pH 7,8) under loppet av 10 min. Tillsätt EDTA-lösning med spetsen på pipetten under cellsuspension nivå för att undvika förhöjda lokala koncentrationer av EDTA. Den stirbar ska rotera med en hastighet tillräckligt för att blanda cellsuspensionen men inte tillräckligt snabbt för att det bildas skum eller bubblor bildas. Efter EDTA-lösningen har lagts till, inkubera lösningen i 30 minuter vid rumstemperatur.
- Efter 30 minuter inkubation, långsamt lägga 11 ml (1 / 10: e volym) för en 2 mg / ml lysozym lösning till en slutlig koncentration av 200 mikrogram / ml. Fortsätt att blanda cellsuspensionen under lysozym lösningen tillägg. Som nämnts ovan, lägg till lysozym lösningen med pipettspetsen under cellsuspension vätskenivån för att undvika förhöjda lokala koncentrationer av lysozym. Stock lysozym lösningar (2 mg / ml) kan upprättas i engångsbruk alikvoter och lagras vid -20 ° C i tre till fyra månader. Inkubera den resulterande lösningen i 30 minuter vid rumstemperatur.
- Under 30 minuter inkubation, förbereda en steril 1L flaska med en liten stirbar och 530 ml rumstemperatur Cellgro Molecular grad dH 2 O (4,5 volymer).
- Osmotiskt Lyse cellsuspensionen (från steg 6) genom långsam utspädning (flödeshastighet av cirka 11 ml / min) i 530 ml för molekylär grad dH 2 O (från steg 7) under loppet av 10 till 15 minuter med varsam blandning. På grund av den större lösningen volymen i detta steg, öka stirbar hastigheten för att säkerställa korrekt blandning. Den stirbar ska rotera med en hastighet tillräckligt för att grundligt skingra cellsuspension en gång till i dH 2 O, men inte tillräckligt snabbt för att leda till skumbildning eller bubblor bildas. Lägg till cellsuspension med spetsen på pipetten vilar på botten av kolven, intill stirbar, för att underlätta enhetlig utspädning av CELl suspension. Vi har funnit att 25-ml pipetter fungerar bäst under detta steg. Noggrant övervaka utspädning processen och avbryta flödet som behövs för att skingra lokala ansamlingar av celler, klumpar cell och stripor cell. Inkubera den resulterande lösningen i 30 minuter vid rumstemperatur. Observera att detta steg verkar vara en av de mest utmanande och avgörande för totala framgången för experimentet.
- Efter 30 minuter inkubation, överför 40 ml alikvoter av det osmotiska lys lösning i 50 ml koniska rör och centrifugera vid 7500 xg under 30 min vid 10 ° C för att ta bort intakta celler och skräp.
- Efter centrifugering, försiktigt bort 27 till 30 ml av supernatanten från varje koniska rör och supernatanter pool i en steril 1L flaska
- Överför 25 ml av poolade supernatanten vardera, till 16 ultracentrifugen rör och centrifugera vid 200 tusen x g (44.400 rpm i F50L-8x39 FiberLite ultracentrifugen rotor) under 2 h vid 4 ° C. Observera att varje rotor rymmer 8 rör, så detta steg kräver två rotorer och två ultracentrifuges. Alternativt bör den andra uppsättningen av 8 rör hållas vid 4 ° C tills centrifugeras.
- Inom 10 min av slutförandet av ultracentrifugen springa, förbereda modifierad buffert membran resuspension. Överför 8 ml membran fjädring buffert (25% [wt / wt] sackaros, 5 mM Tris, 30 mM MgCl 2) till ett sterilt rör och tillsätt 1 tablett EDTA-fritt proteashämmare cocktail och 375 U bensonas. Blanda försiktigt för att lösa upp tabletten proteashämmare.
- Efter ultracentrifugering, Häll försiktigt bort supernatanterna, invertera ultracentrifugen rören på absorberande material, och bestämt tryck slangar för att avlägsna överskott supernatant. Markera platsen för varje membran pelleten, med en markör som hjälp vid visualisering. Försiktigt resuspendera åtta membran pellets med 600 l vardera modifierad membran resuspension buffert. Överför varje membran resuspension till nästa uppsättning av åtta rör försiktigt resuspendera dessa åtta pellets, och pool den resulterande membran resuspensions i ett sterilt rör. Den pelleterat membran är svåra att resuspendera, så fortsätt förbi den modifierade bufferten membranet resuspension över pellets tills den skalar bort från väggen av röret. Det är ofta nödvändigt att använda mikropipett tips till skrapa membranet pellets från rörväggen och stöd i resuspension processen. Vid pipettering, undvik skumbildning eller bubblor bildas. Observera att detta steg verkar vara en av de mest utmanande och avgörande för totala framgången för experimentet.
- När membranet pellets har återsuspenderade och bort från alla 16 rör, tvätta alla fyra rör med 600 l av modifierade membran resuspension buffert. Tvätten bör fokuseras runt det markerade området (membran pellet) i varje rör. Överför tvätta i membranet resuspension röret. Upprepa tvättningen för de återstående tre uppsättningar av fyra rör.
- Inkubera membranet resuspension med mjuka gungande i 30 min i rumstemperatur för att bryta ned DNA och stöd i minskning av flockig material.
- Ta en liten delmängd av membranet fjädring och utföra protein kvantifiering för att bestämma totala membran avkastning. Vi brukar förbereda outspädd, utspädd 1:1 (i 2,5% SDS) och 1:03 efter utspädning (i 2,5% SDS) membran prover, värme proverna vid 90 ° C i 10 min, och använda BioRad DC-Protein-analys för att kvantifiera membranet resuspension proteinkoncentration. Totalt proteinavkastning är i allmänhet mellan 1,0 mg / ml och 1,6 mg / ml. Användningen av värme och SDS krävs för att frigöra OMPs från den extraherade membran så att en mer exakt protein kvantifiering värde kan erhållas.
- Förbered linjär sackaros gradienter genom att skikta 1,8 ml vardera av sackaros lösningar (WT / wt, upprättad i 5 mM EDTA, pH 7,5) till 14 x 95 mm Ultra Clear ultracentrifugen rör i följande ordning: 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%. Skiktning av sackaros lutningar är lättast att göra när man använder en glödlampa pipett, inte ett automatiserat pipett.
- Baserat på membranet resuspension protein kvantifiering (steg 16), lager 1,5 mg membran resuspension på toppen av varje lutning. Varje 14 x 95 mm ultracentrifugen röret har en maximal kapacitet på 12,5 ml och med tanke på att 10,8 ml redovisas av sackaros lösningar från steg 17, ska du laddar inte mer än 1,7 ml membran resuspension per lutning. Väger och noggrant justera den slutliga vikten av varje sackaros lutning tub (genom att lägga till eller ta bort membran resuspension) så att alla rör samma vikt (± 0,01 g).
- Överför sackaros lutningar i en SW-40Ti svängande skopa rotorn och centrifugera vid 256 tusen x g (38 tusen rpm) i minst 17 timmar vid 4 ° C.
Dag 4: Insamling av fraktioner sackaros lutning
- Efter 17 h av centrifugering, stoppa centrifug köra och försiktigt bort sackaros gradienter från SW-40Ti rotorn.
- Rengör noga botten av sackaros lutning röret med 70% etanol, punktera denbotten av röret med en 21G nål, och samla sekventiell 500 l fraktioner från gradienten i sterila mikrofugrör rör. Upprepa för efterföljande gradienter. Lutningen bör få dropp med självfall, för att inte störa sackaros lutning. Men om droppande upphör från botten av lutning röret, kan ett litet tryck appliceras på toppen av röret med hjälp av ett finger.
- Bestäm brytningsindex för varje sackaros lutning fraktion med hjälp av en refraktometer och korrelera brytningsindex med en viss densitet ig / ml 1. Bedöm protein lokalisering genom att förbereda representant fraktioner sackaros lutning (densitet steg om 0,01, från 1,11 g / ml till 1,26 g / ml) för SDS-PAGE separation, överföring till nitrocellulosa och immunoblotting.
Representativa resultat
När de utförs på rätt sätt, detta förfarande leder till att fullständig separation av IM och OM blåsor från både typ A (t.ex. SchuS4) och typ B (t.ex. LVS) stammar av F. tularensis. Som visas i representativa immunoblots i figur 1, F. tularensis OMPs lokalisera mellan densitet 1,17 och 1,20 g / ml. Som jämförelse IMP lokalisera mellan densitet 1,13 och 1,14 g / ml.
Figur 1. Immunoblotting F. tularensis sackaros densitetsgradienter. Sekventiell fraktioner samlades in från gradienter och densitet (g / ml) har beräknats baserat på brytningsindex. Proteiner var åtskilda av SDS-PAGE, överförs till nitrocellulosa och immunoblotted att upptäcka OMP och IMP fraktionering. MW, prestained molekylvikt standard med storlekar (i kDa) noteras på vänster sida av varje blot. LVS, helcells lysates F. tularensis LVS. Motsvarande sackaros lutning bråkdel tätheter noteras över sina respektive banor. OMPs och IMP, som noterats i vänstermarginalen, upptäcktes med polyklonala, monospecifika antiserum. Liknande resultat erhölls för F. tularensis SchuS4.
Discussion
Detta protokoll beskriver en variant av spheroplasting, osmotisk lys och sackaros densitetsgradient centrifugering "gyllene standard" för fysisk separation och anrikning av gramnegativa bakterier OMS från andra cellulära komponenter 2, 3, 4. Medan vi beskrivit tidigare tillämpning av denna metod för att isolera OMS från både typ A och typ stammar B i F. tularensis 5, erbjuder denna presentation en mer detaljerad och optimerade förfarande för OM isolering. Det är här ett viktigt framsteg för att identifiera potentiellt yta exponerad och presumtiva faktorer virulens från denna dödliga patogen. Betydelsen av detta förfarande har visats i studier av vårt laboratorium som visar att vaccination av möss med renat OMPs ges ett gott skydd mot virulenta typ A F. tularensis pulmonell utmaningen 6. Som nämnts ovan, tillväxt fasen av bakterieceller, noga under osmotisk lys, och milda resuspension av membran pellets är kritiska steg som tycks korrelera med framgång / misslyckande i denna membranseparation förfarande. Även om denna optimerade metod är strikt och föremål för viss experimentell variation, den resulterande OMS verkar vara anmärkningsvärt förbättrad renhet jämfört med dem samlat från användning av rengöringsmedel, litiumklorid eller natriumkarbonat 7, 8, 9, 10, 11, 12.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Projektet beskrivs stöddes av Grant Numbers P01 AI055637 och U54 AI057156 från NIAID / NIH. Dess innehåll är helt och hållet av författarna och representerar inte nödvändigtvis officiella ståndpunkter RKS Program Office, NIAID eller NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Donor calf serum | Mediatech, Inc. | 35-022-CV | |
| IsoVitaleX | BD Biosciences | 211876 | |
| Cellgro molecular grade dH2O | Mediatech, Inc. | 46-000-CM | |
| 38.5 ml polycarbonate bottle | FiberLite | 010-0514 | |
| F50L-8x39 ultracentrifuge rotor | FiberLite | 096-087051 | |
| Complete mini EDTA-free protease inhibitor cocktail | Roche Group | 04693132001 | |
| Benzonase | Novagen, EMD Millipore | 70664-3 | |
| DC protein assay | Bio-Rad | 500-0116 | |
| Ultra-Clear 14x95mm centrifuge tubes | Beckman Coulter Inc. | 344060 | |
| SW-40Ti swinging bucket rotor | Beckman Coulter Inc. | 331301 | |
| Abbe benchtop refractometer | Fisher Scientific | 13-964-10 |
References
- Price, C. A. Centrifugation in density gradients. , Academic Press. 335-335 (1982).
- Osborn, M. J., Gander, J. E., Parisi, E., Carson, J. Mechanism of assembly of the outer membrane of Salmonella typhimurium. Isolation and characterization of cytoplasmic and outer membrane. J Biol Chem. 247 (12), 3962-3962 (1972).
- Nikaido, H. Isolation of outer membranes. Methods Enzymol. 235, 225-225 (1994).
- Mizuno, T., Kageyama, M. Separation and characterization of the outer membrane of Pseudomonas aeruginosa. J Biochem. 84 (1), 179-179 (1978).
- Huntley, J. F., Conley, P. G., Hagman, K. E., Norgard, M. V. Characterization of Francisella tularensis outer membrane proteins. J Bacteriol. 189, 561-561 (2007).
- Huntley, J. F. Native outer membrane proteins protect mice against pulmonary challenge with virulent type A Francisella tularensis. Infect Immun. 76 (8), 3664-3664 (2008).
- Bevanger, L., Maeland, J. A., Naess, A. I. Agglutinins and antibodies to Francisella tularensis outer membrane antigens in the early diagnosis of disease during an outbreak of tularemia. J Clin Microbiol. 26 (3), 433-433 (1988).
- Hubalek, M. Towards proteome database of Francisella tularensis. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 787 (1), 149-149 (2003).
- Pavkova, I. Francisella tularensis live vaccine strain: proteomic analysis of membrane proteins enriched fraction. Proteomics. 5 (9), 2460-2460 (2005).
- Sandstrom, G., Tarnvik, A., Wolf-Watz, H. Immunospecific T-lymphocyte stimulation by membrane proteins from Francisella tularensis. J Clin Microbiol. 25 (4), 641-641 (1987).
- Sjostedt, A., Tarnvik, A., Sandstrom, G. The T-cell-stimulating 17-kilodalton protein of Francisella tularensis LVS is a lipoprotein. Infect Immun. 59 (9), 3163-3163 (1991).
- Twine, S. M. Francisella tularensis proteome: low levels of ASB-14 facilitate the visualization of membrane proteins in total protein extracts. J Proteome Res. 4 (5), 1848-1848 (2005).
