Summary
Een protocol voor het scheiden van innerlijke en uiterlijke membranen van
Abstract
Francisella tularensis is een Gram-negatieve intracellulaire Coccobacillus en de verwekker van de zoönotische ziekte tularemie. In vergelijking met andere bacteriële pathogenen, de extreem lage infectieuze dosis (<10 CFU), snelle progressie van de ziekte, en de hoge morbiditeit en mortaliteit suggereren dat de virulente stammen van Francisella coderen voor nieuwe virulentiefactoren. Het oppervlak belicht moleculen, namelijk de buitenste membraaneiwitten (Omps), is aangetoond dat bacteriële gastheercel binding, ingang, intracellulaire overleving, virulentie en immuno-evasie te bevorderen. De relevantie voor het bestuderen Omps wordt verder onderstreept door het feit dat ze kunnen dienen als beschermende vaccins tegen een aantal bacteriële ziekten. Overwegende dat de Omps kan worden gewonnen uit gram-negatieve bacteriën door middel van bulk membraan extractie technieken, waaronder sonicatie van cellen, gevolgd door centrifugeren en / of afwasmiddel extractie, zijn deze voorbereidingen vaak besmet met periplasmatische en / of cytoplasmatische (innerlijke) membraan (IM) verontreinigingen. Voor jaar, de "gouden standaard" methode voor de biochemische en biofysische scheiding van gram-negatieve IM en buitenste membranen (OM) is van onderwerp bacteriën spheroplasting en osmotische lysis, gevolgd door een sucrose dichtheid gradiënt centrifugatie. Eens lagen op een sucrose gradiënt, kan OMS worden gescheiden van IMs op basis van de verschillen in dichtheden uitbundige, vermoedelijk gebaseerd grotendeels op de aanwezigheid van lipopolysaccharide (LPS) in het OM. We beschrijven hier een rigoureuze en geoptimaliseerd methode te extraheren, te verrijken, en isoleren F. tularensis buitenste membranen en de bijbehorende Omps.
Protocol
Dag 1: F. tularensis plaat inoculatie
- Plaat bevroren voorraad culturen van F. tularensis op Mueller-Hinton agar aangevuld met 2,5% (vol / vol) donor kalfserum, 2% (vol / vol) IsoVitaleX, 0,1% (wt / vol) glucose en 0,025% (wt / vol) IJzerpyrofosfaat. Grow F. tularensis bij 37 ° C met 5% CO 2 voor ongeveer 24 uur
Dag 2: F. tularensis vloeibare media inoculatie
- Voorbereiden en autoclaaf van 1 liter kation-aangepaste Mueller-Hinton medium (met 1,23 mM calciumchloride-dihydraat en 1,03 mM magnesiumchloride hexahydraat). Wanneer afgekoeld tot 37 ° C, verder aan te vullen medium met 0,1% (wt / vol) glucose, 0,025% (wt / vol) ijzer pyrofosfaat, en 2% (vol / vol) IsoVitaleX. Filter steriliseren (0,22 μ) medium in twee porties van 500 ml.
- Verwijder de 12 ml aangevuld Mueller-Hinton medium en brengen in een steriele 50 ml Falcon buis.
- Met behulp van een steriele 10-ul enting loop, schraap een grote entoog met bacterie F. tularensis groei van agar-platen (vanaf dag 1) en overdracht bacteriën in 12 ml van Mueller-Hinton medium (zie stap 2). Pipetteer oplossing meerdere keren te breken-up klonten en voor te bereiden homogene bacteriële suspensie. Niet vortex.
- Met behulp van een steriele pipet, enten elk 500 ml schip met 5 ml van de bacteriële suspensie van stap 3. Grow bouillon culturen bij 37 ° C voor 14 tot 18 uur onder zacht schudden (190 tot 200 rpm op een New Brunswick Innova 2300-serie shaker).
Dag 3: Spheroplasting, osmotische lysis, en sucrose dichtheid gradiënt centrifugatie
- Verkrijgen van F. tularensis culturen uit het schudden incubator en verwijderen van een 1-ml aliquot van elk 500 ml cultuur aan de respectieve optische dichtheid te controleren. Wij hebben gevonden optimale membraan extractie en isolatie resultaten bij het gebruik van F. tularensis cellen in de vroege logaritmische fase van de groei, die met een OD 600 correleert tussen 0,2 en 0,4 (~ 10 juli-10 augustus CFU / ml). Culturen met een OD 600 minder dan 0,2 zal niet toegeven voldoende hoeveelheid van het totaal membraan materiaal voor de volgende sucrose gradiënten. Omgekeerd, hebben culturen met een OD 600 groter is dan 0,4 (bijna stationaire fase) is gebleken dat mixed-membraan fusies opbrengst.
- Centrifugeer culturen op 7500 x g gedurende 30 minuten bij 15 ° C om de cellen te verzamelen. Wij raden centrifugeren van culturen in vier van 250 ml centrifuge flessen, want het vergemakkelijkt de daaropvolgende pellet schorsing.
- Verwijder voorzichtig de media supernatant van elk centrifuge fles en stevig tik op de flessen op absorberend materiaal om het overtollige groeimedium te verwijderen.
- Binnen 10 minuten na voltooiing van centrifugeren, te schorsen elke bacteriële pellet in 8,75 ml 0,75 M sucrose (in 5 mM Tris, pH 7,5). Alle vier de bacteriële pellets moet worden opgeschort en overgedragen (35 ml totaal van bacteriële suspensie) in een steriele 250 ml (met een kleine stirbar) binnen 10 minuten.
- Terwijl zachtjes het mengen van de celsuspensie op een stirplate, voeg langzaam 70 ml (2 volumes) van 10 mM EDTA (in 5 mM Tris, pH 7,8) in de loop van 10 minuten. Voeg de EDTA-oplossing met de punt van de pipet onder de celsuspensie niveau aan verhoogde lokale concentraties van EDTA te voorkomen. De stirbar moet draaien met een snelheid voldoende is om goed te mengen de celsuspensie, maar niet snel genoeg om schuimvorming veroorzaken of belvorming. Nadat de EDTA-oplossing is toegevoegd, incubeer de oplossing gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
- Na de 30 min incubatie, voeg langzaam 11 ml (1 / 10 ste volume) van een 2 mg / ml lysozym-oplossing tot een uiteindelijke concentratie van 200 ug / ml. Ga verder naar de celsuspensie mix tijdens de lysozym-oplossing toevoeging. Zoals hierboven vermeld, voeg de lysozym-oplossing met de pipetpunt onder de celsuspensie vloeistofniveau aan verhoogde lokale concentraties van lysozym te voorkomen. Stock lysozyme-oplossingen (2 mg / ml) kunnen worden bereid in voor eenmalig gebruik aliquots en opgeslagen bij -20 ° C gedurende drie tot vier maanden. Incubeer de verkregen oplossing gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
- Tijdens de 30 min incubatie, bereiden een steriele 1L fles met een kleine stirbar en 530 ml op kamertemperatuur Cellgro moleculair-biologische kwaliteit dH 2 O (4,5 volumes).
- Osmotisch lyse de celsuspensie (vanaf stap 6) door middel van langzame verdunning (snelheid van ongeveer 11 ml / min) in 530 ml van de moleculair-biologische kwaliteit dH 2 O (vanaf stap 7) in de loop van 10 tot 15 minuten met zachte mengen. Vanwege het grotere volume oplossing in deze stap, verhoging van de stirbar snelheid een goede menging te garanderen. De stirbar moet draaien met een snelheid voldoende is om zich gelijk de celsuspensie eens toegevoegd aan de dH 2 O, maar niet snel genoeg om te leiden tot schuimen of belvorming. Voeg de celsuspensie met het puntje van de pipet rust op de bodem van de kolf, grenzend aan de stirbar, om een uniforme verdunning van de cel te vergemakkelijkenl schorsing. We hebben gevonden dat de 25-ml pipetten beste werk tijdens deze stap. Zorgvuldig toezien op de verdunning proces en onderbreekt het debiet als nodig is om de lokale ophopingen van cellen, bosjes, en cel slierten verspreiden. Incubeer de verkregen oplossing gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Merk op dat deze stap lijkt te zijn een van de meest uitdagende en kritische voor het algehele welslagen van het experiment.
- Na de 30 min incubatie, 40 ml porties van de osmotische lysis oplossing overbrengen naar 50 ml conische buizen en centrifugeer bij 7500 xg gedurende 30 minuten bij 10 ° C en intacte cellen en vuil te verwijderen.
- Na centrifugatie, verwijder voorzichtig 27 tot 30 ml van de bovenstaande uit elke conische buis en het zwembad supernatant in een steriele 1L fles
- Breng 25 ml van samengevoegde supernatant, elk, in 16 ultracentrifuge en centrifugeer op 200.000 x g (44400 rpm in F50L-8x39 FiberLite ultracentrifuge rotor) gedurende 2 uur bij 4 ° C. Merk op dat elke rotor 8 buizen houdt, dus deze stap vereist twee rotoren en twee ultracentrifuges. Als alternatief zou de tweede set van 8 buizen worden gehouden op 4 ° C tot gecentrifugeerd.
- Binnen 10 min van de voltooiing van de ultracentrifuge draaien, bereiden gewijzigd membraan resuspensie buffer. Overdracht 8 ml van membraan suspensie buffer (25% [wt / wt] sucrose, 5 mM Tris, 30 mM MgCl 2) in een steriele buis en voeg een tablet van EDTA-vrije protease remmer cocktail en 375 U van Benzonase. Voorzichtig mengen oplossing voor proteaseremmer tablet is opgelost.
- Na ultracentrifugatie, voorzichtig afgieten supernatants, omkeren ultracentrifuge buizen op absorberend materiaal en stevig tap buisjes om overtollig supernatant te verwijderen. Markeer de locatie van elke membraan pellet met een marker om te helpen bij visualisatie. Voorzichtig mengen acht membraan pellets met 600 ul elk van gemodificeerde membraan resuspensie buffer. Overdracht elk membraan resuspensie naar de volgende reeks van acht buizen, zacht deze acht pellets, en het zwembad van het resulterende membraan resuspensions opnieuw in suspensie in een steriele buis. Het ingehulde membranen zijn moeilijk te mengen, dus ga verder langs de gewijzigde membraan resuspensie buffer op de korrel tot het pelt weg van de wand van de buis. Het is vaak nodig om de micropipet tip te gebruiken om het membraan pellet schraap de buiswand en steun in de resuspensie proces. Bij het pipetteren, vermijd schuimen of belvorming. Merk op dat deze stap lijkt te zijn een van de meest uitdagende en kritische voor het algehele welslagen van het experiment.
- Wanneer het membraan pellets zijn geresuspendeerd en uit alle 16 buizen, wassen om de vier buizen met 600 ul van gewijzigde membraan resuspensie buffer. Het wassen dient te worden geconcentreerd rond het gemarkeerde gebied (membraan pellet) van elke buis. Breng de was in het membraan resuspensie buis. Herhaal de wasstap voor de resterende drie sets van vier buizen.
- Incubeer het membraan resuspensie met zachte schommelen gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur aan DNA en hulp worden afgebroken in vermindering van vlokkig materiaal.
- Verwijder een kleine hoeveelheid van het membraan schorsing en uit te voeren eiwit kwantificering van de totale opbrengst membraan te bepalen. We meestal voor te bereiden onverdund, 1:01 verdund (in 2,5% SDS), en 1:3 verdund (in 2,5% SDS) membraan monsters, warmte de monsters bij 90 ° C gedurende 10 minuten, en gebruik de BioRad DC Protein Assay te kwantificeren het membraan resuspensie eiwit concentratie. Totaal eiwit opbrengst is over het algemeen tussen 1,0 mg / ml en 1,6 mg / ml. Het gebruik van warmte en SDS zijn nodig om Omps vrijlating uit de uitgepakte membranen, zodat een meer accurate kwantificering eiwit waarde kan worden verkregen.
- Bereid lineaire sucrose gradiënten door lagen 1,8 ml van elk van sucrose oplossingen (gew / gew, bereid in 5 mM EDTA, pH 7,5) in 14 x 95 mm Ultra-Clear ultracentrifuge buizen in de volgende volgorde: 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%. Gelaagdheid van sucrose gradiënten is het makkelijkst uit te voeren bij het gebruik van een lamp pipet, niet door een geautomatiseerd pipet.
- Op basis van het membraan resuspensie eiwit kwantificering (stap 16), laag 1,5 mg van het membraan resuspensie op de top van elk verloop. Elke 14 x 95 mm ultracentrifuge buis heeft een maximale capaciteit van 12,5 ml en, gezien het feit dat 10,8 ml komt voor rekening van de sucrose oplossingen van stap 17, moet je nooit meer dan 1,7 ml membraan resuspensie per verloop. Stuksgewicht en zorgvuldig aan te passen de uiteindelijke gewicht van elke sucrose gradiënt buis (door het toevoegen of verwijderen van membraan resuspensie), zodat alle buizen dezelfde (± 0,01 g) wegen.
- Overdracht sucrose gradiënten in een SW-40Ti swingende emmer rotor en centrifugeer bij 256.000 x g (38.000 rpm) voor een minimum van 17 uur bij 4 ° C.
Dag 4: Het verzamelen van sucrose gradiënt fracties
- Na 17 uur van centrifugeren, stop de centrifuge draaien, en zorgvuldig sucrose gradiënten te verwijderen uit de SW-40Ti rotor.
- Reinig de onderkant van de sucrose gradiënt buis met 70% ethanol, doorboren debodem van de buis met een 21g naald, en het verzamelen van sequentiële 500 pi fracties uit de gradiënt in steriele microcentrifuge buizen. Herhaal dit voor de volgende hellingen. De helling moet worden toegestaan om druppelen door de zwaartekracht stroom, om niet de sucrose gradiënt verstoren. Echter, als de druipende ophoudt van de bodem van de gradiënt buis, kan een kleine hoeveelheid druk wordt toegepast op de bovenkant van de buis met behulp van een vinger.
- Bepaal de brekingsindex van elk sucrose gradiënt fractie met behulp van een refractometer en correleren van de brekingsindex met een specifieke dichtheid in g / ml 1. Beoordeel eiwit lokalisatie door het opstellen van vertegenwoordiger van sucrose gradiënt fracties (dichtheid in stappen van 0,01, van 1,11 g / ml tot 1,26 g / ml) voor SDS-PAGE scheiding, transfer naar nitrocellulose, en immunoblotting.
Representatieve resultaten
Wanneer deze wordt uitgevoerd correct, deze procedure resulteert in de volledige scheiding van IM en OM blaasjes van zowel type A (bijv. SchuS4) en Type B (bv LVS) stammen van F. tularensis. Zoals weergegeven in representatieve immunoblots in figuur 1, F. tularensis Omps lokaliseren tussen de dichtheid van 1,17 en 1,20 g / ml. Ter vergelijking, GMP lokaliseren tussen de dichtheid van 1,13 en 1,14 g / ml.
Figuur 1. Immunoblotting van F. tularensis sucrose dichtheidsgradiënten. Opeenvolgende fracties werden verzameld uit gradiënten en dichtheden (g / ml) werden berekend op basis van brekingsindex. Eiwitten werden gescheiden door SDS-PAGE, overgebracht naar nitrocellulose, en immunoblotted te OMP en IMP fractionering op te sporen. mw, moleculair gewicht normen prestained met maten (in kDa) vermeld op de linkerkant van elke blot. LVS, hele cellysaten van F. tularensis LVS. De bijbehorende sucrose gradiënt fractie dichtheden worden genoteerd boven hun respectieve rijstroken. Omps en GMP's, zoals vermeld in de linkermarge, werden gedetecteerd met polyklonale, monospecifieke antisera. Vergelijkbare resultaten werden verkregen voor F. tularensis SchuS4.
Discussion
Dit protocol beschrijft een variant van de spheroplasting, osmotische lysis, en sucrose dichtheidsgradiënt centrifugatie "gouden standaard" voor de fysieke scheiding en verrijking van Gram-negatieve bacteriën OMS van andere cellulaire componenten 2, 3, 4. Terwijl we eerder beschreven van de toepassing van deze methode voor het isoleren van OMS van zowel type A en type B stammen van F. tularensis 5, deze presentatie biedt een meer gedetailleerde en geoptimaliseerd procedure voor OM-isolatie. Inderdaad, dit is een belangrijke stap vooruit voor het identificeren van mogelijke oppervlakte-belichte en vermoedelijke virulentie factoren van deze dodelijke ziekteverwekker. De betekenis van deze procedure werd aangetoond in onderzoeken door ons lab laten zien dat immunisatie van muizen met gezuiverde Omps geboden aanzienlijke bescherming tegen virulente type A F. tularensis pulmonale uitdaging 6. Zoals hierboven is opgemerkt, groeifase van de bacteriële cellen, is een zorgvuldige monitoring tijdens osmotische lysis, en zachte resuspensie van membraan pellets zijn kritische stappen die lijken te correleren met succes / falen van deze membraanscheiding procedure. Hoewel deze methode geoptimaliseerd is streng en onderworpen aan een aantal experimentele variabiliteit, de daaruit voortvloeiende OMS lijken te zijn van opmerkelijk verbeterd zuiverheid in vergelijking met die vergaard uit het gebruik van detergenten, lithium chloride, of natriumcarbonaat 7, 8, 9, 10, 11, 12.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
De beschreven project werd ondersteund door Grant Numbers P01 AI055637 en U54 AI057156 van NIAID / NIH. De inhoud ervan is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigen niet noodzakelijk de officiële standpunten van de RCE Programma's Bureau, NIAID, of NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Donor calf serum | Mediatech, Inc. | 35-022-CV | |
| IsoVitaleX | BD Biosciences | 211876 | |
| Cellgro molecular grade dH2O | Mediatech, Inc. | 46-000-CM | |
| 38.5 ml polycarbonate bottle | FiberLite | 010-0514 | |
| F50L-8x39 ultracentrifuge rotor | FiberLite | 096-087051 | |
| Complete mini EDTA-free protease inhibitor cocktail | Roche Group | 04693132001 | |
| Benzonase | Novagen, EMD Millipore | 70664-3 | |
| DC protein assay | Bio-Rad | 500-0116 | |
| Ultra-Clear 14x95mm centrifuge tubes | Beckman Coulter Inc. | 344060 | |
| SW-40Ti swinging bucket rotor | Beckman Coulter Inc. | 331301 | |
| Abbe benchtop refractometer | Fisher Scientific | 13-964-10 |
References
- Price, C. A. Centrifugation in density gradients. , Academic Press. 335-335 (1982).
- Osborn, M. J., Gander, J. E., Parisi, E., Carson, J. Mechanism of assembly of the outer membrane of Salmonella typhimurium. Isolation and characterization of cytoplasmic and outer membrane. J Biol Chem. 247 (12), 3962-3962 (1972).
- Nikaido, H. Isolation of outer membranes. Methods Enzymol. 235, 225-225 (1994).
- Mizuno, T., Kageyama, M. Separation and characterization of the outer membrane of Pseudomonas aeruginosa. J Biochem. 84 (1), 179-179 (1978).
- Huntley, J. F., Conley, P. G., Hagman, K. E., Norgard, M. V. Characterization of Francisella tularensis outer membrane proteins. J Bacteriol. 189, 561-561 (2007).
- Huntley, J. F. Native outer membrane proteins protect mice against pulmonary challenge with virulent type A Francisella tularensis. Infect Immun. 76 (8), 3664-3664 (2008).
- Bevanger, L., Maeland, J. A., Naess, A. I. Agglutinins and antibodies to Francisella tularensis outer membrane antigens in the early diagnosis of disease during an outbreak of tularemia. J Clin Microbiol. 26 (3), 433-433 (1988).
- Hubalek, M. Towards proteome database of Francisella tularensis. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 787 (1), 149-149 (2003).
- Pavkova, I. Francisella tularensis live vaccine strain: proteomic analysis of membrane proteins enriched fraction. Proteomics. 5 (9), 2460-2460 (2005).
- Sandstrom, G., Tarnvik, A., Wolf-Watz, H. Immunospecific T-lymphocyte stimulation by membrane proteins from Francisella tularensis. J Clin Microbiol. 25 (4), 641-641 (1987).
- Sjostedt, A., Tarnvik, A., Sandstrom, G. The T-cell-stimulating 17-kilodalton protein of Francisella tularensis LVS is a lipoprotein. Infect Immun. 59 (9), 3163-3163 (1991).
- Twine, S. M. Francisella tularensis proteome: low levels of ASB-14 facilitate the visualization of membrane proteins in total protein extracts. J Proteome Res. 4 (5), 1848-1848 (2005).
