Summary
Un protocole de séparation des membranes interne et externe de
Abstract
Francisella tularensis est un coccobacille à Gram négatif intracellulaire et l'agent causal de la maladie zoonotique la tularémie. En comparaison avec d'autres pathogènes bactériens, la dose infectieuse extrêmement faible (<10 UFC), la progression rapide de la maladie, et de la morbidité et de mortalité élevés suggèrent que les souches virulentes de Francisella codent pour des facteurs de virulence roman. Exposées à la surface des molécules, les protéines membranaires savoir externe (OMP), ont été montrés pour favoriser cellule hôte bactérienne contraignante, d'entrée, la survie intracellulaire, la virulence et l'évasion immunitaire. La pertinence pour l'étude des OMP est encore souligné par le fait qu'ils peuvent servir de vaccins protecteurs contre un certain nombre de maladies bactériennes. Alors OMP peut être extraite de bactéries gram-négatives grâce à des techniques d'extraction en vrac membrane, y compris la sonication des cellules suivie d'une centrifugation et / ou extraction par détergent, ces préparations sont souvent contaminés par périplasmique et / ou cytoplasmique (interne) membrane (GI) des contaminants. Pendant des années, le "gold standard" méthode pour la séparation biochimiques et biophysiques de bactéries gram-négatives et les membranes externes de messagerie instantanée (OM) a été de bactéries soumises à une lyse osmotique et de sphéroplastes, suivis par centrifugation en gradient de densité de saccharose. Une fois en couches sur un gradient de saccharose, l'OMS peut être séparé de l'IMS sur la base des différences dans les densités porteur, qu'on croit être fondé essentiellement sur la présence de lipopolysaccharide (LPS) de l'OM. Ici, nous décrivons une méthode rigoureuse et optimisée pour extraire, d'enrichir et d'isoler F. tularensis membranes extérieures et de leurs associés OMP.
Protocol
Jour 1: F. l'inoculation plaque tularensis
- Cultures Plate stock congelé de F. tularensis sur gélose Mueller-Hinton complété avec 2,5% (vol / vol) de sérum de veau donateurs, 2% (vol / vol) IsoVitaleX, 0,1% (poids / volume) de glucose, et 0,025% (poids / volume) de pyrophosphate de fer. Cultivez F. tularensis à 37 ° C avec 5% de CO 2 d'environ 24 h.
Jour 2: F. liquides tularensis média d'inoculation
- Préparer et autoclave de 1 litre de cation ajusté milieu Mueller-Hinton (contenant 1,23 mM de chlorure de calcium dihydraté et 1,03 mM de chlorure de magnésium hexahydraté). Lorsqu'il est refroidi à 37 ° C, moyennes autre supplément de glucose 0,1% (poids / volume), le pyrophosphate de fer 0,025% (poids / volume), et 2% (vol / vol) IsoVitaleX. Stériliser par filtration (0,22 μ) moyenne en deux aliquotes de 500 ml.
- Retirer 12 ml d'complété milieu Mueller-Hinton et transférer dans une solution stérile de 50 ml tube Falcon.
- En utilisant une boucle d'inoculation stérile de 10 ul, gratter une anse large de F. la croissance tularensis à partir des plaques d'agar (du jour 1) et les bactéries de transfert dans 12 ml de milieu Mueller-Hinton (voir étape 2). Reprises solution de pipette multiples pour briser les mottes, et préparer homogène suspension bactérienne. Ne pas vortex.
- En utilisant une pipette stérile, inoculer chaque navire de 500 ml avec 5 ml de suspension bactérienne de l'étape 3. Cultivez les bouillons de culture à 37 ° C pendant 14 à 18 h sous agitation douce (190-200 rpm sur un agitateur du Nouveau-Brunswick Innova série 2300).
Jour 3: sphéroplastes, la lyse osmotique et centrifugation en gradient de densité de saccharose
- Obtenir F. tularensis cultures de l'incubateur agitateur et de supprimer une partie aliquote de 1 ml de chaque culture de 500 ml pour vérifier les densités optiques respectifs. Nous avons trouvé extraction membranaire optimale et des résultats d'isolation lors de l'utilisation F. cellules tularensis dans la phase logarithmique début de croissance, ce qui corrèle avec une DO 600 de 0,2 à 0,4 (~ 10 juillet au 10 août UFC / ml). Cultures avec une DO 600 de moins de 0,2 ne donnera pas une quantité suffisante de matériau de la membrane total des gradients de sucrose ultérieures. Inversement, les cultures avec une DO 600 supérieur à 0,4 (en voie de phase stationnaire) ont été trouvés à céder mixte membrane fusions.
- Centrifuger à 7500 x cultures g pendant 30 min à 15 ° C pour collecter les cellules. Nous vous recommandons de centrifugation des cultures dans quatre bouteilles à centrifuger de 250 ml, parce qu'elle facilite la suspension subséquente à granulés.
- Retirer délicatement le surnageant des médias de chaque bouteille centrifugeuse et taper fermement les bouteilles sur un matériau absorbant pour enlever l'excès de croissance moyenne.
- Dans les 10 minutes suivant la fin de la centrifugation, suspendre chaque culot bactérien dans 8,75 ml de 0,75 M de saccharose (dans 5 mM de Tris, pH 7,5). Tous les quatre culots bactériens devrait être suspendu et transféré (35 ml au total de la suspension bactérienne) pour une solution stérile de 250 ml flacon (avec un barreau d'agitation petits) dans les 10 min.
- Tout en mélangeant doucement la suspension cellulaire sur une stirplate, ajouter lentement 70 ml (2 volumes) de 10 mM d'EDTA disodique (dans 5 mM de Tris, pH 7,8) au cours de 10 min. Ajouter la solution d'EDTA à la pointe de la pipette en dessous du niveau de suspension cellulaire afin d'éviter des concentrations élevées de locaux de l'EDTA. Le barreau d'agitation doit être tournant à une vitesse suffisante pour bien mélanger la suspension cellulaire, mais pas assez rapide pour provoquer de l'écume ou la formation de bulles. Après la solution d'EDTA a été ajouté, incuber la solution pendant 30 min à température ambiante.
- Après une incubation de 30 min, ajouter lentement 11 ml (volume e 1 / 10) d'un à 2 mg / ml solution de lysozyme à une concentration finale de 200 pg / ml. Continuer à mélanger la suspension cellulaire pendant l'addition solution de lysozyme. Comme indiqué ci-dessus, ajouter la solution de lysozyme à la pointe de la pipette en dessous du niveau du liquide de cellules en suspension pour éviter des concentrations élevées de locaux de lysozyme. Stock solutions de lysozyme (2 mg / ml) peuvent être préparés à usage unique aliquotes et conservés à -20 ° C pendant trois à quatre mois. Incuber la solution obtenue pendant 30 min à température ambiante.
- Durant l'incubation de 30 min, de préparer un flacon stérile 1L avec un barreau d'agitation petites et 530 ml de température ambiante Cellgro moléculaire grade dH O 2 (4,5 volumes).
- Osmotiquement lyser les cellules en suspension (de l'étape 6) par dilution lente (débit d'environ 11 ml / min) dans 530 ml d'année dH moléculaire O 2 (à partir de l'étape 7) au cours des 10 à 15 min en mélangeant doucement. En raison du volume plus grande solution à cette étape, d'augmenter la vitesse barreau d'agitation pour assurer un mélange adéquat. Le barreau d'agitation doit être tournant à une vitesse suffisante pour bien disperser la suspension cellulaire fois ajouté à l'O DH 2, mais pas assez rapide pour conduire à mousser ou à la formation de bulles. Ajouter la suspension cellulaire avec la pointe de la pipette reposant sur le fond du flacon, à côté du barreau d'agitation, pour faciliter la dilution uniforme du CELsuspension de l. Nous avons constaté que de 25 ml Pipettes meilleur travail au cours de cette étape. Surveiller attentivement le processus de dilution et d'interrompre le débit nécessaire pour disperser des accumulations locales de cellules, des bouquets de cellules, et mèches cellule. Incuber la solution obtenue pendant 30 min à température ambiante. Notez que cette étape semble être l'un des plus difficiles et critiques pour le succès global de l'expérience.
- Après une incubation de 30 min, le transfert aliquotes de 40 ml de la solution lyse osmotique dans les tubes de 50 ml conique et centrifuger à 7500 xg pendant 30 min à 10 ° C pour éliminer les cellules intactes et les débris.
- Après la centrifugation, retirer soigneusement de 27 à 30 ml de surnageant de chaque tube conique et surnageants piscine dans un flacon stérile 1L
- Prélever 25 ml de surnageant mis en commun, chacune, en 16 tubes d'ultracentrifugation et centrifuger à 200 000 xg (44 400 rpm dans F50L-8x39 rotor ultracentrifugeuse Fiberlite) pendant 2 h à 4 ° C. Notez que chaque rotor détient 8 tubes, cette étape nécessite deux rotors et deux ultracentrifugeuses. Alternativement, la seconde série de 8 tubes doivent être conservés à 4 ° C jusqu'à centrifugé.
- Dans les 10 min de la fin de la course d'ultracentrifugation, préparer modifiés tampon de resuspension membrane. Transfert 8 ml de tampon de suspension de membrane (25% [p / p] sucrose, 5 mM de Tris, 30 mM MgCl 2) dans un tube stérile et ajouter 1 comprimé de l'EDTA-libres cocktail inhibiteur de la protéase et 375 U de Benzonase. Mélanger doucement la solution pour dissoudre le comprimé d'inhibiteur de protéase.
- Après ultracentrifugation, versez délicatement hors surnageants, inverser les tubes d'ultracentrifugation sur un matériau absorbant, et taper fermement les tubes pour enlever l'excès surnageant. Marquez l'emplacement de chaque culot de membranes avec un marqueur à l'aide de la visualisation. Resuspendre doucement Huit pastilles membrane avec 600 pi de tampon de chaque membrane resuspension modifié. Transfert à chaque remise en suspension de membrane à la prochaine série de huit tubes, doucement resuspendre ces huit boulettes, et la piscine de l'remises en suspension de membrane résultant dans un tube stérile. Les membranes granulés sont difficiles à remettre en suspension, afin de continuer passant le tampon membrane modifiée resuspension plus le culot jusqu'à ce qu'il pèle de la paroi du tube. Il est souvent nécessaire d'utiliser la pointe pour gratter la micropipette culot de membranes hors la paroi du tube et de l'aide dans le processus de remise en suspension. Lorsque pipetage, éviter ou de faire mousser la formation de bulles. Notez que cette étape semble être l'un des plus difficiles et critiques pour le succès global de l'expérience.
- Lorsque les pastilles de membrane ont été remis en suspension et retirés de tous les tubes 16, lavez tous les quatre tubes de 600 pi de tampon de resuspension membrane modifiée. Le lavage devrait être axée autour de la zone marquée (membrane granulés) de chaque tube. Transfert du lavage dans le tube resuspension membrane. Répéter l'étape de lavage pour les trois autres séries de quatre tubes.
- Incuber la membrane avec la remise en suspension doux balancement pendant 30 min à température ambiante pour dégrader l'ADN et de l'aide dans la réduction des matières floconneuses.
- Supprimer une petite aliquote de la suspension membranaire et d'effectuer une quantification des protéines membranaires pour déterminer le rendement total. Nous préparent habituellement non dilué, 01:01 dilué (de 2,5% de SDS), et 1:3 dilué (de 2,5% de SDS) échantillons de membrane, chauffer les échantillons à 90 ° C pendant 10 min, et utiliser le BioRad Protein Assay DC à quantifier la concentration des protéines membranaires resuspension. Rendement en protéines totales est généralement comprise entre 1,0 mg / ml et 1,6 mg / ml. L'utilisation de la chaleur et de la SDD sont nécessaire pour libérer de l'OMP membranes extraites de sorte qu'une valeur plus précise la quantification des protéines peut être obtenue.
- Préparer des gradients de sucrose linéaires par superposition de 1,8 ml de chacune des solutions de saccharose (poids / poids, préparé en 5 mM EDTA, pH 7,5) dans les tubes 14 x 95 mm ultracentrifugeuse Ultra-Clear dans l'ordre suivant: 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%. Superposition des gradients de sucrose est plus facile à effectuer lors de l'utilisation d'une pipette ampoule, pas un pipeteur automatisé.
- Basé sur la quantification des protéines membranaires resuspension (étape 16), couche de 1,5 mg de remise en suspension de membrane sur le dessus de chaque gradient. Chaque 14 x 95 mm tube d'ultracentrifugation a une capacité maximale de 12,5 ml et, étant donné que 10,8 ml est représenté par les solutions de saccharose de l'étape 17, vous ne devriez pas charger plus de 1,7 ml de remise en suspension de membrane par gradient. Individuellement et soigneusement peser ajuster le poids final de chaque tube à gradient de saccharose (en ajoutant ou en enlevant la membrane resuspension) afin que tous les tubes le même poids (± 0,01 g).
- Transfert des gradients de saccharose dans un rotor SW-40Ti baquet oscillant et centrifuger à 256 000 xg (38 000 tpm) pendant un minimum de 17 h à 4 ° C.
Jour 4: Collecte des fractions du gradient de saccharose
- Après 17 h de centrifugation, arrêter la course centrifugeuse, et enlever soigneusement les gradients de saccharose par le rotor SW-40Ti.
- Nettoyez soigneusement la partie inférieure du tube gradient de saccharose avec de l'éthanol à 70%, la ponction de lafond du tube avec une aiguille 21G, et de recueillir des fractions de 500 ul séquentielle à partir du gradient dans des tubes de microcentrifugation stérile. Répétez l'opération pour des gradients ultérieurs. Le gradient devraient être autorisés à goutte à goutte par gravité, afin de ne pas perturber le gradient de saccharose. Cependant, si la goutte cesse du fond du tube dégradé, une petite quantité de pression peut être appliquée à la partie supérieure du tube en utilisant un doigt.
- Déterminer l'indice de réfraction de chaque fraction du gradient de saccharose aide d'un réfractomètre et de corréler l'indice de réfraction avec une densité spécifique en g / ml 1. Évaluer la localisation des protéines par la préparation des fractions représentant un gradient de saccharose (par incréments de densité de 0,01; de 1,11 g / ml à 1,26 g / ml) pour SDS-PAGE de séparation, le transfert de la nitrocellulose, et immunoblot.
Les résultats représentatifs
Quand elle est réalisée correctement, cette procédure aboutit à la séparation complète de la messagerie instantanée et des vésicules OM à la fois de Type A (par exemple SchuS4) et B (par exemple, LVS) souches de F. tularensis. Comme indiqué dans immunoblots représentatifs de la figure 1, F. OMP tularensis localisent entre les densités de 1,17 et 1,20 g / ml. Par comparaison, IMP localisent entre les densités de 1,13 et 1,14 g / ml.
Figure 1. Immunoblot de F. gradients de densité de saccharose tularensis. Fractions séquentielles ont été recueillis auprès des dégradés et des densités (g / ml) ont été calculés sur la base des indices de réfraction. Les protéines ont été séparées par SDS-PAGE, transférées sur nitrocellulose, et de détecter les immuno OMP et le fractionnement IMP. mw, précolorés standards de poids moléculaire avec des tailles (en kDa) a noté sur le côté gauche de chaque tache. LVS, lysats de cellules entières de F. LVS tularensis. Les densités correspondantes de saccharose gradient fraction sont noté ci-dessus leurs couloirs respectifs. OMP et IMP, comme noté dans la marge gauche, ont été détectés avec des anticorps polyclonaux, antisérums monospécifiques. Des résultats similaires ont été obtenus pour F. tularensis SchuS4.
Discussion
Ce protocole décrit une variante de la sphéroplastes, la lyse osmotique, et la densité de gradient de saccharose centrifugation "gold standard" pour la séparation physique et l'enrichissement des bactéries Gram-négatives OM à partir d'autres composants cellulaires 2, 3, 4. Alors que nous avons précédemment décrit l'application de cette méthode pour isoler OM des deux souches de type A et de type B de F. tularensis 5, cette présentation offre une procédure plus détaillée et optimisé pour l'isolation l'OM. En effet, il s'agit d'une avancée importante pour identifier potentiellement exposées à la surface et les facteurs de virulence présumée à partir de ce pathogène mortel. L'importance de cette procédure a été démontrée dans des études de notre laboratoire montrant que l'immunisation de souris avec OMP purifiée une protection substantielle contre le type virulent F. tularensis défi pulmonaire 6. Comme indiqué ci-dessus la phase de croissance, des cellules bactériennes, une surveillance attentive lors de la lyse osmotique, et remise en suspension des culots de membranes douces sont des étapes essentielles qui semblent être en corrélation avec succès / échec de cette procédure de séparation membranaire. Bien que cette méthode est rigoureuse et optimisée soumis à une certaine variabilité expérimentale, l'OM résultant semblent être d'une pureté remarquable amélioration par rapport à celles recueillies auprès de l'utilisation de détergents, de chlorure de lithium, sodium ou le carbonate de 7, 8, 9, 10, 11, 12.
Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Le projet décrit a été soutenu par un nombre Grant P01 AI055637 et AI057156 U54 du NIAID / NIH. Son contenu est exclusivement la responsabilité de leurs auteurs et ne représentent pas nécessairement les vues officielles de l'Office RCE Programmes, NIAID, NIH ou d'.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Donor calf serum | Mediatech, Inc. | 35-022-CV | |
| IsoVitaleX | BD Biosciences | 211876 | |
| Cellgro molecular grade dH2O | Mediatech, Inc. | 46-000-CM | |
| 38.5 ml polycarbonate bottle | FiberLite | 010-0514 | |
| F50L-8x39 ultracentrifuge rotor | FiberLite | 096-087051 | |
| Complete mini EDTA-free protease inhibitor cocktail | Roche Group | 04693132001 | |
| Benzonase | Novagen, EMD Millipore | 70664-3 | |
| DC protein assay | Bio-Rad | 500-0116 | |
| Ultra-Clear 14x95mm centrifuge tubes | Beckman Coulter Inc. | 344060 | |
| SW-40Ti swinging bucket rotor | Beckman Coulter Inc. | 331301 | |
| Abbe benchtop refractometer | Fisher Scientific | 13-964-10 |
References
- Price, C. A. Centrifugation in density gradients. , Academic Press. 335-335 (1982).
- Osborn, M. J., Gander, J. E., Parisi, E., Carson, J. Mechanism of assembly of the outer membrane of Salmonella typhimurium. Isolation and characterization of cytoplasmic and outer membrane. J Biol Chem. 247 (12), 3962-3962 (1972).
- Nikaido, H. Isolation of outer membranes. Methods Enzymol. 235, 225-225 (1994).
- Mizuno, T., Kageyama, M. Separation and characterization of the outer membrane of Pseudomonas aeruginosa. J Biochem. 84 (1), 179-179 (1978).
- Huntley, J. F., Conley, P. G., Hagman, K. E., Norgard, M. V. Characterization of Francisella tularensis outer membrane proteins. J Bacteriol. 189, 561-561 (2007).
- Huntley, J. F. Native outer membrane proteins protect mice against pulmonary challenge with virulent type A Francisella tularensis. Infect Immun. 76 (8), 3664-3664 (2008).
- Bevanger, L., Maeland, J. A., Naess, A. I. Agglutinins and antibodies to Francisella tularensis outer membrane antigens in the early diagnosis of disease during an outbreak of tularemia. J Clin Microbiol. 26 (3), 433-433 (1988).
- Hubalek, M. Towards proteome database of Francisella tularensis. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 787 (1), 149-149 (2003).
- Pavkova, I. Francisella tularensis live vaccine strain: proteomic analysis of membrane proteins enriched fraction. Proteomics. 5 (9), 2460-2460 (2005).
- Sandstrom, G., Tarnvik, A., Wolf-Watz, H. Immunospecific T-lymphocyte stimulation by membrane proteins from Francisella tularensis. J Clin Microbiol. 25 (4), 641-641 (1987).
- Sjostedt, A., Tarnvik, A., Sandstrom, G. The T-cell-stimulating 17-kilodalton protein of Francisella tularensis LVS is a lipoprotein. Infect Immun. 59 (9), 3163-3163 (1991).
- Twine, S. M. Francisella tularensis proteome: low levels of ASB-14 facilitate the visualization of membrane proteins in total protein extracts. J Proteome Res. 4 (5), 1848-1848 (2005).
