Visualisering och kvantifiering av intracellulära interaktioner av Neisseria meningitidis Och mänskliga α-actinin av Confocal Imaging

Summary

Neisseria meningitidis (Nm), en gramnegativa människa-specifika respiratoriska patogener, kan binda till mänskliga α-actinin. Här presenterar vi ett protokoll för visualisering av colocalisation av bakterien med intracellulär α-actinin efter bakteriell trätt i mänskliga endotelceller hjärnan mikrovaskulära celler (HBMECs).

Abstract

OPC-proteinet av Neisseria meningitidis (Nm, meningokock) är en utanpåliggande uttryckt integrerad yttre membran protein som kan fungera som en adhesin och ett effektivt invasin för mänskliga epitelceller och endotelceller. Vi har identifierat endotelets yta belägna integriner som stora receptorer för OPC, en process som kräver Opc att först binda till integrin ligander såsom vitronektin och via dem till den cell-uttryck receptorer ^1. Denna process leder till bakteriell invasion av endotelceller ^2. På senare tid observerade vi ett samspel av OPC med en 100kDa protein som finns i hela cellen lysates av mänskliga celler ^3. Vi observerade en början denna interaktion när värdcellens proteiner separeras genom elektrofores och torkas på nitrocellulosa var belagd med OPC-uttrycker Nm. Samspelet var direkt och inte innebär mellanliggande molekyler. Med masspektrometri har vi etablerat identiteten av proteinet som α-actinin. Eftersom ingen yta uttryckt α-actinin hittades på någon av de åtta granskade cellinjer, och som OPC interaktioner med endotelceller i närvaro av serum leda till bakteriell inträde i målceller undersökte vi möjligheten att två proteiner interagerar intracellulärt. För detta var odlade mänskliga hjärnan mikrovaskulära endotelceller (HBMECs) infekterade med OPC-uttrycker Nm under längre perioder och placeringen av internaliserade bakterier och α-actinin granskades av konfokalmikroskopi. Vi observerade tidsberoende ökning colocalisation av Nm med cytoskelettala protein, som var stor efter en åtta timmar av bakteriell internalisering. Dessutom var det möjligt att använda kvantitativa bildprogram oss att skaffa oss ett relativt mått på colocalisation av Nm med α-actinin och andra cytoskelettala proteiner. Här presenterar vi ett protokoll för visualisering och kvantifiering av colocalisation av bakterien med intracellulära proteiner efter bakteriell trätt i humana endotelceller, även om förfarandet också gäller för mänskliga epitelceller.

Protocol

1. Immunofluorescens Protokoll

Sådd, Infektion & immuno-färgning

Följande procedurer kräver lämplig säkerhetskultur nivå vävnad och mikrobiologiska laboratorier.

DAG 1

A. Beredning av målceller för infektion

1. Seed HBMECs vid 50% sammanflödet (~ 1.5x10 ⁴ celler / cm ²⁾ på glas täckglas (16 mm diameter) placeras i ett 12-brunnar (3,8 cm ² tillväxtområde / brunn).
   
   Tillväxt medium: RPMI 1640 kompletterats med 15% värmeinaktiveras (56 ° C, 30min) FBS, 2 mM glutamin, 1 mm natrium pyruvat, 100 U / ml penicillin / streptomycin, 1% (v / v) MEM icke-essentiella aminosyror syror lösning och 1% MEM vitaminer lösning.
2. Kultur över natten (O / N) vid 37 ° C, i en 5% CO ₂ inkubator.

B. bakterieodling

1. Växa stam av intresse O / N (16-18 h) på den önskade mediet t.ex. Brain Heart Infusion (BHI) agarplattor kompletteras med 10% uppvärmd häst blod vid 37 ° C i 5% CO ₂ atmosfären ^4.

DAG 2

A. Förberedelser av bakteriell (N. meningitidis) Avstängning

1. Med hjälp av en 10 mikroliter kultur slinga, gör ett avbrott i natten bakteriekultur i 2 ml PBSB (PBS med kalcium och magnesium).
2. Låt stora bakteriella aggregat att lösa genom att lämna suspensionen stå i 5 minuter i rumstemperatur (RT).
3. Utan att störa pelleten, överför de 1 ml av suspensionen (lager inokulat) i ett sterilt rör.
4. För att uppskatta bakteriella nummer i beståndet inokulatet, lägg alikvoter (20-50 mikroliter) till provrör innehållande 1 mL volym 1% SDS i 0,1 miljoner NaOH och blanda försiktigt så att lösa upp.
5. Mät nukleinsyra i lösningen genom att bestämma absorbansen vid 260nm (A260). I våra händer, A260 av 1 motsvarar 5x10 ⁸ kolonibildande enheter / ml (cfu / ml). Detta kan verifieras genom att förbereda en serie spädningar av beståndet inokulatet i PBSB, plätering ut på agarplattor och räkna kolonier efter O / N inkubation.
6. Späd en alikvot av beståndet inokulatet på infektion medelstora [(M199 kompletteras med 2% decomplemented (56 ° C, 30 min) normalt humant serum (NHS)] för att uppnå önskad bakteriell densitet för infektion av målceller.
   1. I vårt laboratorium, är en infektion förhållandet 200-300 bakterier per målcellen rutinmässigt används.

B. Cell Culture Infektion

1. Tvätta täckglas med odlade målceller 3 gånger med Hanks på medellång och ta bort alla spår av antibiotika.
2. Infektera celler med nylagade bakteriesuspensioner (se ovan) i 3 till 8 timmar vid 37 ° C i 5% CO _2.
3. I slutet av infektion perioden, tvätta celler tre gånger med PBS och fixera i 500 mikroliter av 2% paraformaldehyd (PFA) i 30-45 min vid RT eller O / N vid 4 ° C.
   1. Paraformaldehyd fixering vid koncentration och tid som visas ovan befanns vara lämpliga för bevarande av bakteriell och cellulära morfologi.
4. Efter tvättning av paraformaldehyd, permeabilise den paraformaldehyd fasta celler genom inkubering i 0,1% Triton X-100 som spätts i PBS i 10 min.
5. Tvätta prover 3 gånger med PBS.
6. Fortsätt till immuno-färgning eller alternativt lämna prover i 500 mikroliter 1% BSA / PBST O / N vid 4 ° C.

DAG 3

Immuno-färgning

Färgning av intracellulära bakterier och α-actinin kan utföras sekventiellt eller samtidigt med hjälp av lämpliga primära och sekundära antikroppar enligt följande: alla förfaranden kan utföras i 12-brunnars plattor.

1. Blockera täckglasen innehåller permeabilised cellerna med 500 mikroliter på 3% BSA / PBST (PBS innehållande 0,05% Triton X-100) i 30-60 min vid RT
2. Efter tvättning med PBS, överföring varje täckglas till en ny torr bra i 12-brunnar.
3. Lägg till den primära antikroppar mot bakterier och α-actinin, åttio till 100 mikroliter av antikroppar per täckglas räcker om du lägger försiktigt för att täcka ytan av täckglas. Inkubera 1 timme vid rumstemperatur.
   1. Vi använde polyklonalt kaninantiserum mot Neisseria meningitidis (laboratorie-upp) och mus monoklonal antikropp (mAb) mot α-actinin (Abcam) samtidigt. I vissa experiment, i stället för mot α-actinin var MAbs mot aktin eller vimentin används (Sigma).
4. I slutet av inkubationen, tillsätt 200 mikroliter PBS till brunnen, lyft täckglas och lägg i en ny brunn som innehåller 500 mikroliter PBS.
5. Efter 5 min, ta bort PBS genom att pipettera och sedan lägga till nya PBS. Upprepa två gånger. Överför täckglas till ennya torkar väl.
6. Tillsätt lämplig sekundära antikroppar konjugerade till olika fluorokromer utspädd i 1% BSA / PBST, inkubera vid RT för 1h i mörker.
   1. För bakteriella upptäckt, använde vi anti-kanin Ig konjugerat till TRITC och för α-actinin och andra cytoskelettala protein detektion, använde vi anti-mus-Ig konjugerad till antingen FITC-(Sigma) eller Alexa Fluor 488 - (Invitrogen).
7. I slutet av inkubationen, tvätta som i steg 4 och 5.
8. Counter fläcken med 0,6 mikrogram / ml DAPI i PBS (DNA färg) i 5 min vid RT i mörkret.
9. Skölj med PBS.
10. Mount täckglas (celler nedåt) på diabilder med en droppe monteringsmedium (e, g. Mowiol eller Vectashield)
11. Förvara i mörker vid 4 ° C.
12. Prover är redo för observation under mikroskop.

2. Konfokala laserscanning Mikroskopi (CLSM)

Att observera och ta bilder av intracellulära bakterier och cytoskelettala element, använde vi immunolabelled prover och bilderna med en Leica SP5-AOBS konfokala laserskanning mikroskop fäst vid en Leica DM I6000 inverterat epifluorescensmikroskop. Alla bilder togs med en 63x NA 1,4 mål oljeimmersion och process med Leica programvara.

CLSM förfarande:

1. För att börja CLSM proceduren, lägg en droppe immersionsolja till målet och placera provet bilden, täckglas och ner, på mikroskop scenen.
2. Ställ mikroskop för att ett visuellt läge och hitta intresseområde med ögat bitar av mikroskop.
3. Använda Leica Software, välj xyz förvärvet läget.
4. Välj 512 x 512-format (byggstorlek). För colocalisation studier, högre upplösning, desto mer exakt bilden, hålla i åtanke upplösningen gränsen för mikroskop. Välj sedan dubbelriktad x-läge, vilket kommer att öka skanningshastighet och bidra till att minska foto-blekning.
5. Sätt upp sekventiell skanning inställningar. Klicka i "sidor"-funktionen och välj en av skanning. Vi använder "mellan raderna"-läge.
6. Välj laserstrålar enligt fluorokromer konjugerad med sekundära antikroppar: 405 nm för DAPI (blå), 488 nm för Alexa Fluor 488 (grön) och 561 nm för TRITC (röd). Aktivera Fotomultiplikatorrör Tube (PMT) 1, 2 och 3, respektive. Justera PMT inställningar för att detektera rätt utsläppen våglängd.
7. Sätt upp överst ("börja") och botten ("slutet") av z-stackar eller serie. Ställ sedan in önskad "Z-steg-storlek".
   1. Neisseria meningitidis är en diplococcus (Figur 1G) och eftersom varje kock har en ungefärlig diameter på 0,5 mm, var z-steg storlek 0,20 ìm valt att öka sannolikheten för skanning varje kock minst två gånger. Det är också inom steget storlek för optimal upplösning på 0,1 till 0,2 ìm.
8. Ställ den slutliga skanningen parametrar genom att välja linje i genomsnitt på 3 för att förbättra signal-brus-förhållande.
9. Genom att klicka på "Start" dubbel-eller trippel-färgade bilder erhålls genom sekventiell skanning vid olika våglängder för att eliminera överhörning mellan olika kromoforer.
10. För en indikation på colocalisation av två fluorokromer, välj "overlay"-funktionen att slå ihop valda kanaler till en enda bild, till exempel när både Alexa 488 (grön) och TRITC (röd) fluorokromer colocalise kommer gul färg visas i överlagras bilden .
11. Sammanställ z-stackar eller serie med "maximal projektion"-funktion för byggandet av en 2D-bild krävs för att visualisera eventuell colocalisation. Mer detaljerad analys av colocalisation kan erhållas genom analys av varje optisk avsnitt.
12. Efter förvärvet av Z-stackar eller serie, bearbeta dina data för att få en ortogonal bild för visualisering av intracellulär lokalisering av olika element (Figur 1E).

3. Kvantifiering av Colocalisation

Statistiska analyser av konfokala scanning mikroskop bilder görs med Volocity programvara (Improvisation, PerkinElmer). Denna programvara innehåller ett verktyg som utformats speciellt för colocalisation analys som beskrivs av Manders et al. (1993) ^5. Colocalisation i samband med digitala fluorescens avbildning kan beskrivas som att upptäcka en signal på samma Voxel (pixel volym) plats i varje kanal. De två kanalerna består av bilder av två olika fluorokromer tas från samma prov område (Volocity användarhandboken). Statistiska analyser görs med Volocity programvara (Improvisation, PerkinElmer) med hjälp av kvantitativ Colocalisation Analysis som beskrivs nedan.

Kvantitativa Colocalisation Analys

1. Skapa ett bibliotek med CLSM bilder med hjälp av Volocity programvara.
2. Välj "utökad fokus" från bilden i det översta fältet. Detta verktyg kommer att sammanställa z-högar i en 2D-bild som skall analyseras.
3. Välj "Colocalization" verktyg. De två kanalerna som skall analyseras bör ha samma färgdjup.
4. Markera det område som det kommer att kvantifieras. Ställ in tröskelvärdet för att ta bort bakgrunden.
5. Skapa colocalisation output genom att välja "generera colocalization". Colocalisation statistik genereras för regioner av intresse valts tidigare.
6. Välj Manders 'koefficienter R (överlappning koefficient) och My (colocalisation koefficient).
   1. Manders "koefficienter inte är känsliga för intensitet färgning som de är normaliserade mot totalt pixel intensitet, varför de kan användas när färgningen av ett antigen är starkare än den andra.
   2. Överlappning koefficient R enligt Manders ^5,6 representerar den verkliga graden av colocalisation, dvs antalet pixlar som colocalise jämfört med det totala antalet pixlar.
   3. Å andra sidan, beskriver colocalisation koefficienten, My, fluorescens bidrag mer rikligt fraktion (i detta fall α-actinin, grön) till de mindre rika fraktion (i detta fall bakterier, rött), dvs antalet röda pixlar som överlappar med gröna bildpunkter jämfört med det totala antalet röda pixlar.
   4. Manders "koefficienter varierar mellan 1 och 0, där 1 är hög colocalisation, 0 är ingen, men de kan uttryckas i procent för enklare tolkning.
7. Exportstatistik värden till ett Excel-dokument för presentation av data.

4. Representativa resultat

Intracellulär lokalisering av OPC-uttrycka Neisseria meningitidis och α-actinin

Konfokal avbildning av hjärnan mikrovaskulära endotelceller infekterade med Nm för 3 och 8 timmar enligt ovan angivna colocalisation av α-actinin och Nm som föreföll vara mindre frekventa i 3 h infektion experiment (visas inte) jämfört med kulturer smittad för 8 tim ( Figur 1 AF). En påvisbara colocalisation av α-actinin med OPC-uttryckande meningokocker observerades varje gång i> 5 replikera experiment. Statistisk analys av colocalisation använda flera konfokala bilder utfördes som beskrivits ovan. Totalt sett HBMEC infekterade med OPC-uttrycker meningokocker, erhölls> 25% överlappning av de gröna (α-actinin) och röd (Nm) pixlar (Figur 2B, Överlappande koefficienten R). I motsats till α-actinin, experiment där märkning av internaliserade bakterier och antingen aktin eller vimentin utfördes, var enstaka colocalisation observerades med aktin men med vimentin var sällsynt (Figure. 2B).

Uppgifterna analyserades också med koefficienten My, som tar hänsyn till den relativa förekomsten av varje fraktion. My är ett mått på förekomsten av de mer rikligt signalen (i detta fall grönt, α-actinin) varje gång den mindre rikligt signalen (i detta fall rött, bakterier) inträffar. Denna åtgärd visar en slående grad av förekomst av α-actinin i närheten av internaliserade meningokocker (Figur 2A och C).

Figur 1. Konfokala laserscanning mikroskopi för att bedöma intracellulära interaktioner av N. meningitidis med α-actinin. AH. Sammanflytande endotel monolager odlas på täckglas var infekterade med OPC-uttryck (AF) N. meningitidis. Efter 8 h, var icke-häftande bakterier tvättas bort, celler fixeras med paraformaldehyd och permeabilised med 0,1% Triton X-100. Därefter var bakterier och α-actinin färgade enligt ovan (α-actinin, grönt, bakterier, röd).

AC. Ett område som visar xy bilder av var Nm (A) eller α-actinin (B). Överlägget bilden i (C) visar flera regioner där gul-orange färg visas om att colocalisation. Pilar i (A) och (B) visar områden där en hög grad av α-actinin ackumulering verkar ha inträffat runt bakterier.

D. Optisk dissekering av en infekterad HBMEC cellslager visar colocalisation runt intracellulära bakterier ligger vid foten av en cell.

Återigen, detta är colocalisation inte på grund av oavsiktlig närheten till α-actinin, som den allmänna fläcken av α-actinin i denna region är låg.

E och F. tredimensionella bilder av infekterat HBMEC monolager bearbetas enligt ovan. En sned bild av apikala yta (E) visar anhängare bakterier färgas röd (röd pil) Flera bakterier ligger mot den basala ytan av endotelceller (gul pil) är tydligt orange / gul färg. Basal plats kan vara mer tydligt i (F) som är en slut-på XZ tvärsnitt.

G. Ett negativt färgade elektronmikroskop bild av N. meningitidis visar dessdominerande diplococcal från. Varje coccus är cirka 0,5 mikrometer i diameter.

Figur 2. Lokalisering och distribution av α-actinin, aktin och vimentin i HBMEC celler.

A. Infekterade monolager av HBMEC behandlades som beskrivs i förklaringen ovan men i tillägg till α-actinin var vissa täckglasen används för detektion av aktin eller vimentin genom förfarande liknande det som för α-actinin. Som ovan, α-actinin koncentrerad runt flera internaliserade bakterier (vita pilar). Vimentin och aktin inte colocalise med bakterier med märkbara nivåer. Stapel representerar 20 mikrometer.

B. & C. Värdena för koefficienterna R och Mina erhölls från fler än tre försök med Volocity programvara som beskrivs ovan.

Discussion

Möjligheten att bindning av internaliserad OPC-uttrycker Neisseria meningitidis till α-actinin undersöktes med hjälp HBMEC genom granskning av colocalisation av bakterier och cytoskelettala protein i infekterade celler efter 3 och 8 timmar inkubationstid. Genom konfokalmikroskopi kunde colocalisation av Neisseria meningitidis med α-actinin påvisas. Noterbart, även bakterier internaliseras på 3 h, det var lite colocalisation med α-actinin vid denna tidpunkt. Bakteriell samband med cytoskelettala proteinet visade att kräva en längre intracellulär uppehållsrätt som efter 8 h infektion perioden hade ett stort antal bakterier α-actinin tydligen i nära samarbete. Alfa-actinin är en multifunktionell protein, och bakteriella interaktioner med cytoskelettala elementet kan ha betydande inflytande på målcellen funktion som är föremål för pågående studier.

Kvantifiering av colocalisation som beskrivits ovan kräver noggranna extraktion. Särskild uppmärksamhet bör ägnas åt exemplar fixering, blockera period och antikroppar spädningar. För bästa signal-brus-förhållande, bör varje primära och sekundära antikroppar titreras i preliminära försök att fastställa den optimala koncentrationer. Vår erfarenhet är producerade monteringsmedium Mowiol bättre bilder.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
12 well plate	Corning	BC311
Glass Coverslips	VWR international	631-0152
BHI AGAR	LAB M	LAB048
M199	Sigma-Aldrich	M2154
RPMI 1640	Lonza Inc.	BE12-167E
MEM Non Essential Aminoacids	Sigma-Aldrich	M7145
HANK’S balanced salt solution	Sigma-Aldrich	H9269
FBS	BioWhittaker	DE14-801F
Glutamine	Sigma-Aldrich	G7513
Sodium pyruvate	Sigma-Aldrich	S8636
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P0781
MEM Vitamin solution	Sigma-Aldrich	M6895
PBSB	Lonza Inc.	BE17-513F
BSA	Sigma-Aldrich	A9418
Paraformaldehyde	Fisher Scientific	P/0840/53
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X-100
DAPI	Sigma-Aldrich	D-9564
Vectashield	Vector Laboratories	H-1000
Mowiol 4-88	Calbiochem	475904
Anti‑Nm antiserum	Laboratory raised		Rabbit serum
TRITC anti-rabbit Ig	Sigma-Aldrich	T6778
Anti α‑actinin mAb [7H6]	Abcam	Ab32816	IgG
Anti actin mAb	Sigma-Aldrich	A4700	IgG2a
Anti vimentin mAb	Sigma-Aldrich	V6630	IgG1
ALEXA FLUOR 488 anti‑mouse IgG	Invitrogen	A11001
FITC anti-mouse IgG	Sigma-Aldrich	F-2012
1. Confocal Laser Scanning Microscopy (CLSM): Leica SP5 confocal imaging system: This system, by using a combination of AOTF (acousto-optical tuneable filter) and an AOBS (acousto-optical beam splitter), simplifies excitation with specific wave lengths. 2-Software: Leica confocal software LCS, Leica Microsystems, Germany. Volocity 5, Improvision, PerkinElmer, USA.