Summary
Een snelle manier is beschreven om inzicht te krijgen in de structuur van de polysacchariden in een extracellulaire matrix. De methode maakt gebruik van de specificiteit van glycosylhydrolases en de gevoeligheid van massaspectrometrie waarmee minieme hoeveelheden van de materialen worden geanalyseerd. Deze techniek is aan te passen aan direct worden gebruikt op weefsel zelf.
Abstract
Het directe contact van de cellen aan de omgeving wordt bemiddeld in veel organismen door een extracellulaire matrix. Een veel voorkomende aspect van de extracellulaire matrices is dat ze complexe suikers groepen in de vorm van glycoproteïnen, proteoglycanen, en / of polysacchariden bevatten. Voorbeelden hiervan zijn de extracellulaire matrix van mensen en dierlijke cellen voornamelijk bestaande uit fibrillair eiwitten en proteoglycanen of de polysaccharide gebaseerde celwanden van planten en schimmels, en de proteoglycan / glycolipide op basis van de celwanden van bacteriën. Al deze glycostructures spelen een belangrijke rol in cel-cel en cel-tot-omgeving communicatie en signalering.
Een buitengewoon complex voorbeeld van een extracellulaire matrix aanwezig is in de muren van hogere planten. Hun muur is bijna helemaal gemaakt van suikers, tot 75% droog gewicht, en bestaat uit de meest voorkomende biopolymeren aanwezig zijn op deze planeet. Daarom wordt onderzoek gedaan hoe deze materialen best te gebruiken als een koolstof-neutrale hernieuwbare grondstof voor petrochemische producten afgeleid van fossiele brandstoffen te vervangen. De belangrijkste uitdaging voor brandstof conversie blijft de weerspannigheid van de muren om enzymatische of chemische degradatie als gevolg van de unieke glycostructures aanwezig zijn in dit unieke biocomposite.
Hier presenteren we een methode voor de snelle en gevoelige analyse van plantaardige celwand glycostructures. Deze methode Oligo Mass Profiling (Olimp) is gebaseerd op de enzymatische release van oligosachariden uit wandmaterialen faciliteren specifieke glycosylhydrolases en daaropvolgende analyse van het opgeloste oligosaccharide mengsels met behulp van matrix-assisted laser desorptie / ionisatie time-of-flight massaspectrometrie (MALDI-TOF/MS ) 1 (figuur 1). Olimp vereist muren van slechts 5000 cellen voor een volledige analyse, kunnen worden uitgevoerd op het weefsel zelf 2, en vatbaar is voor high-throughput-analyses 3. Hoewel het absolute bedrag van de opgeloste oligosacchariden niet kan worden bepaald door Olimp de relatieve overvloed van de verschillende oligosaccharide ionen kunnen worden afgebakend van de massa spectra geeft inzichten over het substitutie-patroon van de inheemse polysaccharide aanwezig is in de muur.
Olimp kan worden gebruikt om een breed scala aan wand-polymeren, alleen beperkt door de beschikbaarheid van specifieke enzymen 4 te analyseren. Bijvoorbeeld, voor de analyse van polymeren in de plant aanwezige celwand enzymen beschikbaar zijn voor de hemicellulose xyloglucan met behulp van een xyloglucanase 5, 11, 12, 13, xylaan met behulp van een endo-β-(1-4)-xylanase 6,7 analyseren , of voor pectinestoffen polysacchariden met behulp van een combinatie van een polygalacturonase en een methylesterase 8. Bovendien kan met behulp van dezelfde principes van Olimp glycosylhydrolase en zelfs glycosyltransferase activiteiten worden gecontroleerd en vastgesteld 9.
Protocol
De Olimp methode wordt toegelicht op de grote hemicellulose aanwezig is in de celwanden van tweezaadlobbige planten, xyloglucan, met behulp van een endoglucanase als glycosylhydrolase. De methode is gedemonstreerd met hele Arabidopsis zaailingen als een plantenweefsel bron. Enzym en extracellulaire matrix materiaal kan worden vervangen, afhankelijk van de gewenste analyse met behulp van dezelfde procedure.
1. Celwand isolatie
- Oogst vijf 5-dagen oude volledige Arabidopsis zaailingen of het equivalent bedrag van uw gewenste materiaal en breng ze in een 1,5 ml reactie buis. Zorg ervoor dat het materiaal wordt geplaatst op de bodem van de buis.
- Voeg twee 3mm metalen ballen om de reactie buis op de top van het monster en snap-vries in vloeibare stikstof.
- Maal het bevroren monster met behulp van een ball-mill (02:30 min, 25Hz).
- Voeg 1 ml 70% waterig ethanol aan het monster. Verwijder de metalen balletjes met behulp van een magneet. Vortex grondig.
- Centrifugeer steekproef bij 14.000 rpm voor de 10min te pellet de alcohol onoplosbare residu bevat de celwand materiaal.
- Verwijder voorzichtig het supernatant door aspiratie. Zorg ervoor dat niet aan de pellet te verstoren.
- Voeg 1 ml chloroform / methanol (1:1 v / v) oplossing. Vortex grondig op de korrel resuspenderen.
- Centrifugeer steekproef bij 14.000 rpm gedurende 10 min en voorzichtig het supernatant te verwijderen door aspiratie. Zorg ervoor dat niet aan de pellet te verstoren.
- Droog het monster met behulp van een concentrator.
2. Solubilisatie van oligosachariden
- Voor de solubilisatie de bijzondere polysaccharide in de vorm van de oligosacchariden resuspendeer de droge pellet in 25μl van een geschikte buffer. Voor de endoglucanase 50 mM Ammonium formate, pH4.5, wordt gebruikt. Voeg 0.2U van endoglucanase. Vortex de schorsing en de spin vloeistof naar beneden.
- Incubeer het monster voor 16 uur bij 37 ° C in een incubator, schudden bij 300rpm.
- Verwijder het oplosmiddel van de digest (water) met behulp van een concentrator.
3. MALDI-TOF analyse van de vrijgegeven oligosacchariden
- BioRex MSZ 501 kationuitwisselingshars kralen worden gebruikt om de zouten en enzym uit de verteerde monster. Staat de kralen door het plaatsen van een aliquot in een lege kolom en het wassen van de bolletjes met grote hoeveelheden water.
- Voeg 50-10 BioRex kralen aan de verteerd en gedroogde monster. Voeg vervolgens 10μl water, voor kleinere hoeveelheden materiaal 5μl van het water mag worden gebruikt. Dompel de kralen in de oplossing door kort draaien van de buis. Incubeer gedurende minstens 10min bij kamertemperatuur.
- Spot 2μl matrix (2,5-dihydroxybenzoëzuur (DHB), 10mg/ml in water) op een MALDI richtplaat. Damp het oplosmiddel onder vacuüm matrix leidt tot homogene matrix chemische kristallen.
- Spot 2μl van de ontzout monsteroplossing op de top van de matrix kristallen op het doel plaat.
Wilt u een groot aantal monsters spot alleen blijven spotten voor een maximum van 3 minuten. Deze keer-frame zorgt ervoor dat de eerste gespot monster niet droog is nog niet. Wachten op een extra 2min aan een grondige vermenging van opnieuw opgelost matrix en monster oligosaccharide moleculen in de laatste gespot monster te verzekeren. Dan droog het doelwit plaat onder een vacuüm.
Het monster / matrix mix moet uitkristalliseren in minder dan 1min tot homogene kristallisatie mogelijk te maken. - Plaats richtplaat in een MALDI-TOF massaspectrometer. De machine moet worden ingesteld op een positieve reflectron mode met een versnelde spanning van 20000V en een vertraging van 350 nm, het geselecteerde massabereik moet worden 500-3.000 Da (kan veranderen afhankelijk van de te verwachten oligomeren). Start het afvuren van de laser en het verzamelen van 100-200 spectra per monster, die worden samengesteld om een representatief gemiddelde spectrum (figuur 2A) te genereren. Ionen die specifieke oligosacchariden kunnen worden geïdentificeerd door hun massa meer dan lading (m / z) verhouding. De ionenintensiteiten (piekhoogte) van alle ionen van de rente moeten worden toegevoegd tot 100% wat resulteert in de relatieve overvloed van elk oligosaccharide in de steekproef (figuur 2B).
4. In situ analyse Olimp
Olimp kan ook direct worden gebruikt op het weefsel het weglaten van elke muur voorbereiding stappen. Als voorbeeld geëtioleerde hypocotylen van Arabidopsis als een plantenweefsel bron worden gebruikt. Nogmaals, is een endoglucanase gebruikt om de structuur van de hemicellulose xyloglucan te bepalen. Enzym en weefsel materiaal kan worden vervangen, afhankelijk van de gewenste analyse met behulp van dezelfde procedure.
- Oogst een geëtioleerde zaailing en plaats deze op een lege MALDI richtplaat en laat de zaailing drogen.
- Voeg 0.5μl endoglucanase (0.4U/μl, opgelost in 50 mM ammoniumnitraat formate, pH4.5) op het gedroogde zaailing op de gewenste positie. Zorg ervoor dat het enzym laten vallen deels raakt het doel plaat.
- Plaats de MALDI richtplaat in een gesloten container met verzadiging van vocht te voorkomen dat het enzym vallen uitdroogt. Incubeer de plaat in de kamer voor een6h bij 37 ° C.
- Droog de MALDI richtplaat met de plant weefsel en het enzym vallen onder vacuüm.
- Voeg 0.5μl matrix (DHB, 10 mg / l) op de top van elke gedroogde enzym plek. Laat het staan voor 2min.
- Droog de MALDI richtplaat onder vacuüm.
- Analyseer monsters met de MALDI-TOF. Plaats richtplaat met het weefsel en het enzym / matrix spot (s) in een MALDI-TOF massaspectrometer. De machine moet worden ingesteld op een positieve reflectron mode met een versnelde spanning van 20000V en een vertraging van 350 nm, het geselecteerde massabereik moet worden 500-3.000 Da (kan veranderen afhankelijk van de te verwachten oligomeren).
- Start het afvuren van de laser op de matrix / monster kristallen NEXT om het weefsel. Zorg ervoor dat u niet het weefsel zelf getroffen, zoals in een dergelijk geval de tijd van de vlucht van de moleculen zal worden uitgeschakeld. Verzamel rond 20-50 spectra per spot, die worden samengesteld om een representatief gemiddelde spectrum (figuur 3) te genereren. Ionen die specifieke oligosacchariden kunnen worden geïdentificeerd door hun massa meer dan lading (m / z) verhouding. De ionenintensiteiten (ion hoogte) kan worden gemeld en alle ionen van belang moeten worden opgeteld tot 100% wat resulteert in de relatieve overvloed van elke oligosacchariden in de steekproef.
5. Representatieve resultaten
Een voorbeeld van een Olimp analyse van de hemicellulose xyloglucan aanwezig is in Arabidopsis zaailingen is weergegeven in figuur 2. Als gevolg van verschillen in de massa van de ionen en de bekende goed gekarakteriseerd enzym (endoglucanase) specificiteit van de ionen kunnen worden toegewezen aan specifieke oligosaccharide structuren (Figuur 2A). Uiteraard kunnen structurele isomeren niet te onderscheiden. Het uitgangspunt voor de bepaling van de relatieve overvloed van de verschillende oligosacchariden (figuur 2B) is dat hun massa spec respons factor is zeer vergelijkbaar voor de oligosacchariden. Zoals hier weergegeven, is de Olimp kwantificering is zeer reproduceerbaar. Houd er echter rekening mee dat de robuustheid van de methode is sterk afhankelijk van de signaal-ruis verhoudingen van de verschillende oligosaccharide ionen. Bijvoorbeeld besmetting met zouten of lagere hoeveelheden oligosacchariden kunnen afnemen die verhouding.
De Olimp analyse van het weefsel zelf (in situ analyse) maakt de studie van zeer kleine en gedefinieerde gebieden en brengt heel weinig monstervoorbereiding. In het voorbeeld hier gepresenteerde (figuur 3) geen kwalitatieve (zelfde ionen), maar kwantitatieve verschillen (variatie in de ionenintensiteiten) werden waargenomen tussen de shoot en de root-weefsel van de Arabidopsis zaailing. Permutaties van de Olimp-methode kan dus leiden tot weefsel "beeldvorming".
Figuur 1. Stroomdiagram van de Olimp procedure met behulp van hele Arabidopsis zaailingen als een plant bron. Eerst wordt het weefsel geweekt en celwand materiaal wordt voorbereid (foto heeft gewijzigd van Fujino et al.. 10). Dan oligosacchariden van een bepaalde muur polysaccharide worden vrijgegeven met een specifieke hydrolase. Tenslotte worden de relatieve abundanties van de oplosbare oligosachariden bepaald met behulp van MALDI-TOF massaspectrometrie.
Figuur 2. Relatieve overvloed aan xyloglucan oligosacchariden in geëtioleerde zaailingen van Arabidopsis, zoals bepaald door Olimp. A) Representatieve xyloglucan oligosaccharide massaspectrum; elk ion vormt een specifieke oligosaccharidestructuur, kunnen structurele isomeren niet te onderscheiden. B) Overeenkomstige staafdiagram voor de bepaling van de relatieve oligosaccharide overvloed.
Figuur 3. In situ Olimp analyse met behulp van geëtioleerde zaailingen van Arabidopsis als voorbeeld. Elk enzym / spijsvertering druppel (gekleurde cirkels) kunnen onafhankelijk van elkaar worden geanalyseerd en een bijbehorende massa spectra kunnen worden verkregen en geanalyseerd.
Figuur 4. Olimp spectrum van de hemicellulose xylaan verkregen door het verteren van Miscanthus blad materiaal met een xylanase (Megazyme).
Discussion
De hier gepresenteerde methode Olimp maakt een zeer gevoelige en snelle analyse van polymeren in de extracellulaire matrices. Olimp combineert de enzymatische release van oligomeren met latere MALDI-TOF-analyse. Het genereren van een MALDI-TOF spectrum duurt minder dan een minuut, vandaar Olimp is geschikt voor een breed scala aan toepassingen, waaronder high-throughput studies zoals mutant schermen. Olimp is niet beperkt tot plant polysacchariden, maar kan mogelijk worden toegepast op een breed scala aan polymeren, alleen beperkt door de beschikbaarheid van specifieke hydrolytische enzymen. Echter, een beperking van Olimp is dat een absolute rijkdom van het polymeer niet kan worden verkregen.
Zoals eerder vermeld Olimp kan worden gebruikt om de structuur van een verscheidenheid aan polysacchariden aanwezig zijn in de extracellulaire matrix van een diversiteit van soorten te bestuderen. Als voorbeeld, Figuur 4 geeft een Olimp spectrum van de belangrijkste hemicellulose in grassoorten, xylaan. Hier was celwand materiaal afkomstig van de gematigde gras Miscanthus verteerd met behulp van een xylanase.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit werk werd gefinancierd door het Energy Biosciences Institute de subsidie OO0G01.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,5-dihydroxybenzoic acid | Sigma-Aldrich | 37550 | 10mg/mL in water |
| BioRex MSZ 501(D) Resin | Bio-Rad | 142-7425 | |
| Endoglucanase | Megazyme | E-CELTR | |
| Xylanase M6 | Megazyme | E-XYRU6 | |
| 3mm metal balls | Retsch | 22.455.0011 | |
| Beat mill | Retsch | Mixer Mill MM400 | |
| MALDI-TOF | Shimadzu Corporation | Axima Performance | |
| MALDI target plate | Kratos Analytical | DE4555TA | |
| SpeedVac | Eppendorf | Vacufuge 5301 | |
| Vacuum manifold | EMD Millipore | MSVMHTS00 | |
| Vacuum pump | Welch Allyn | DryFast Ultra 2032 |
References
- Lerouxel, O. Rapid structural phenotyping of plant cell wall mutants by enzymatic oligosaccharide fingerprinting. Plant Physiology. 130 (4), 1754-1754 (2002).
- Obel, N. Microanalysis of plant cell wall polysaccharides. Molecular Plant. 2 (5), 922-922 (2009).
- Mouille, G. Quantitative trait loci analysis of primary cell wall composition in Arabidopsis. Plant Physiology. 141 (3), 1035-1035 (2006).
- Bauer, S. Development and application of a suite of polysaccharide-degrading enzymes for analyzing plant cell walls. PNAS. 103 (30), 11417-11417 (2006).
- Pauly, M. A xyloglucan-specific endo-beta-1,4-glucanase from Aspergillus aculeatus: expression cloning in yeast, purification and characterization of the recombinant enzyme. Glycobiology. 9 (1), 93-93 (1999).
- Aboughe-Angone, S. Cell wall carbohydrates from fruit pulp of Argania spinosa: structural analysis of pectin and xyloglucan polysaccharides. Carbohydr Res. 343 (1), 67-67 (2008).
- Brown, D. M. Comparison of five xylan synthesis mutants reveals new insight into the mechanisms of xylan synthesis. Plant Journal. 52 (6), 1154-1154 (2007).
- Lee, C. The PARVUS gene is expressed in cells undergoing secondary wall thickening and is essential for glucuronoxylan biosynthesis. Plant Cell Physiol. 48 (12), 1659-1659 (2007).
- Obel, N. Pectin may hinder the unfolding of xyloglucan chains during cell deformation: implications of the mechanical performance of Arabidopsis hypocotyls with pectin alterations. Molecular Plant . , (2009).
- Cavalier, D. M., Keegstra, K. Two xyloglucan xylosyltransferases catalyze the addition of multiple xylosyl residues to cellohexaose. Journal of Biological Chemistry. 281 (45), 34197-34197 (2006).
- Leonard, R. Identification of an Arabidopsis gene encoding a GH95 alpha1,2-fucosidase active on xyloglucan oligo- and polysaccharides. Phytochemistry. 69 (10), 1983-1983 (2008).
- Cavalier, D. M., Keegstra, K. Two xyloglucan xylosyltransferases catalyze the addition of multiple xylosyl residues to cellohexaose. Journal of Biological Chemistry. 281 (45), 34197-34197 (2006).
- Lee, C. H. The irregular xylem9 mutant is deficient in xylan xylosyltransferase activity. Plant and Cell Physiology. 48 (11), 1624-1624 (2007).
- Iglesias, N. Apoplastic glycosidases active against xyloglucan oligosaccharides of Arabidopsis thaliana. Plant and Cell Physiology. 47 (1), 55-55 (2006).
- Fujino, T., Sone, Y., Mitsuishi, Y., Itoh, T. Characterization of cross-links between cellulose microfibrils, and their occurrence during elongation growth in pea epicotyl. Plant Cell Physiol. 41 (4), 486-486 (2000).
- Vanzin, G. F. The mur2 mutant of Arabidopsis thaliana lacks fucosylated xyloglucan because of a lesion in fucosyltransferase AtFUT1. PNAS. 99 (5), 3340-3340 (2002).
- Cavalier, D. M. Disrupting two Arabidopsis thaliana xylosyltransferase genes results in plants deficient in xyloglucan, a major primary cell wall component. Plant Cell. 20 (6), 1519-1519 (2008).
- Hilz, H. A comparison of liquid chromatography, capillary electrophoresis, and mass spectrometry methods to determine xyloglucan structures in black currants. Journal of Chromatography A. 1133 (1-2), 275-275 (2006).
- Pauly, M. Effects of the mur1 mutation on xyloglucans produced by suspension-cultured Arabidopsis thaliana cells. Planta. 214 (1), 67-67 (2001).
