Summary
Un moyen rapide est décrite afin de mieux connaître la structure des polysaccharides dans une matrice extracellulaire. La méthode tire parti de la spécificité de glycosylhydrolases et la sensibilité de la spectrométrie de masse permettant d'infimes quantités de matériaux à analyser. Cette technique est adaptable pour être utilisé directement sur le tissu lui-même.
Abstract
Le contact direct des cellules à l'environnement est médiatisé dans de nombreux organismes par une matrice extracellulaire. Un aspect commun des matrices extracellulaires est qu'ils contiennent des résidus sucres complexes sous forme de glycoprotéines, des protéoglycanes, et / ou des polysaccharides. Les exemples incluent la matrice extracellulaire des humains et des cellules animales composé principalement de protéines fibrillaires et des protéoglycanes ou les murs polysaccharide à base de cellules de plantes et de champignons, et les protéoglycanes / glycolipide murs à base de cellules de bactéries. Tous ces glycostructures jouent un rôle vital dans la cellule à cellule de communication et de cellule à l'environnement et de signalisation.
Un exemple extraordinaire complexité d'une matrice extracellulaire est présente dans les parois des cellules de plantes supérieures. Leur paroi est constituée presque entièrement de sucres, jusqu'à 75% du poids sec, et se compose des biopolymères les plus abondants sur cette planète. Par conséquent, la recherche est menée comment utiliser ces matériaux les mieux comme une ressource renouvelable neutre en carbone pour remplacer les produits pétrochimiques dérivés de combustibles fossiles. Le principal défi pour la conversion de carburant reste à la réticence de murs à la dégradation enzymatique ou chimique due à la glycostructures uniques présents dans cette biocomposites unique.
Ici, nous présentons une méthode pour l'analyse rapide et sensible de glycostructures parois cellulaires végétales. Cette méthode de profilage Mass Oligo (OLIMP) est basée la libération enzymatique d'oligosaccharides à partir de matériaux mur de faciliter glycosylhydrolases spécifiques et l'analyse subséquente des mélanges d'oligosaccharides solubilisée à l'aide assistée par matrice désorption / ionisation laser à temps de vol de spectrométrie de masse (MALDI-TOF/MS ) 1 (figure 1). OLIMP nécessite murs de seulement 5000 cellules pour une analyse complète, peut être effectué sur le tissu lui-même deux, et se prêtent à des analyses à haut débit 3. Alors que le montant absolu des oligosaccharides solubilisés ne peut pas être déterminée par OLIMP l'abondance relative des différents ions oligosaccharides peuvent être délimitées à partir des spectres de masse donnant un aperçu sur la substitution modèle du polysaccharide natif présent dans le mur.
OLIMP peut être utilisée pour analyser une grande variété de polymères de la paroi, limitée seulement par la disponibilité d'enzymes spécifiques 4. Par exemple, pour l'analyse des polymères présents dans les enzymes de la paroi cellulaire des plantes sont disponibles pour analyser les hémicelluloses xyloglucane utilisant un xyloglucanase 5, 11, 12, 13, xylane utilisant une endo-β 6,7-(1-4)-xylanase , ou pour les polysaccharides pectiques en utilisant une combinaison d'une polygalacturonase et une méthylestérase 8. Par ailleurs, en utilisant les mêmes principes de OLIMP glycosylhydrolase et même des activités glycosyltransférase peuvent être surveillés et déterminée 9.
Protocol
La méthode est illustrée OLIMP sur l'hémicellulose majeurs présents dans les parois cellulaires des plantes dicotylédones, xyloglucane, en utilisant une endoglucanase comme glycosylhydrolase. La méthode est démontrée avec l'ensemble des plants d'Arabidopsis comme source de tissus végétaux. Matériau de la matrice extracellulaire et des enzymes peuvent être remplacés en fonction de l'analyse désirée à l'aide de la même procédure.
1. Paroi cellulaire d'isolation
- Récolte cinq 5 jours de vieux plants d'Arabidopsis entière ou le montant équivalent de votre matériel désiré et de les transférer dans un tube de réaction de 1.5 ml. Assurez-vous que le matériau est placé dans le fond du tube.
- Ajouter deux boules de métal de 3 mm pour le tube de réaction sur le dessus de l'échantillon et enclenchez-gel dans l'azote liquide.
- Broyer l'échantillon congelé en utilisant un broyeur à billes (2:30 min, 25Hz).
- Ajouter 1ml d'éthanol aqueux à 70% de l'échantillon. Retirez les boules de métal à l'aide d'un aimant. Vortex à fond.
- Centrifuger l'échantillon à 14 000 rpm pendant 10 minutes pour culotter les résidus d'alcool insolubles contenant le matériau de paroi cellulaire.
- Retirer délicatement le surnageant par aspiration. Veillez à ne pas perturber le culot.
- Ajouter 1 ml de chloroforme / méthanol (1:1 v / v). Vortex soigneusement de remettre en suspension le culot.
- Centrifuger l'échantillon à 14 000 rpm pendant 10 min et retirez soigneusement le surnageant par aspiration. Veillez à ne pas perturber le culot.
- Sécher l'échantillon à l'aide d'un concentrateur.
2. Solubilisation d'oligosaccharides
- Pour la solubilisation du polysaccharide particulier sous forme de son oligosaccharides resuspendre le culot sec dans 25 pi d'un tampon approprié. Pour le formiate d'ammonium 50 mM endoglucanase, pH 4,5, est utilisé. Ajouter 0.2U d'endoglucanase. Vortex de la suspension et liquide de spin bas.
- Incuber l'échantillon pendant 16 heures à 37 ° C dans un incubateur, en agitant à 300rpm.
- Retirez le solvant de la digestion (eau) en utilisant un concentrateur.
3. Analyse MALDI-TOF des oligosaccharides libérés
- BioRex MSZ 501 perles résine échangeuse de cations sont utilisés pour éliminer les sels et les enzymes de l'échantillon digéré. Conditionner les perles en plaçant une aliquote dans une colonne vide et lavage des billes avec de grandes quantités d'eau.
- Ajouter de 50 à 10 perles BioRex à l'échantillon digéré et séché. Puis ajouter de l'eau 10 ul, pour de petites quantités de matières 5uL d'eau peut être utilisée. Plonger les perles dans la solution par une brève filature le tube. Incuber pendant au moins 10min à température ambiante.
- Spot 2μl matrice (2,5-dihydroxybenzoïque (DHB), 10mg/ml dans l'eau) sur une plaque cible MALDI. Evaporer le solvant sous vide matrice conduisant à cristaux chimiques homogènes matrice.
- 2μl spot de la solution échantillon dessalé au sommet de la matrice de cristaux sur la plaque cible.
Si vous voulez apercevoir un grand nombre d'échantillons ne conserve à repérer pour un maximum de 3min. Ce délai garantit que le premier échantillon repéré n'est pas encore sèche. Attendez une 2min supplémentaires pour assurer un mélange intime de la re-dissous matrice et les molécules de l'échantillon d'oligosaccharides dans le dernier échantillon repéré. Puis sécher la plaque cible sous vide.
Le mélange échantillon / matrice doit se cristalliser en moins de 1min pour permettre la cristallisation homogène. - Placer la plaque de mire dans un spectromètre de masse MALDI-TOF. La machine doit être configurée en mode réflectron positive avec une tension d'accélération de 20000V et un retard de 350 nm, la gamme de masse choisie doit être de 500 à 3000 Da (peut changer dépendant des oligomères attendus). Démarrer tir au laser et recueillir 100-200 spectres par échantillon, qui sont compilées pour générer un spectre moyen représentatif (figure 2A). Ions représentant oligosaccharides spécifiques peuvent être identifiés par leur masse au cours de charge (m / z) Le ratio. Les intensités d'ions (hauteur du pic) de tous les ions d'intérêt devrait être ajoutée à 100% résulte de l'abondance relative de chaque oligosaccharide dans l'échantillon (figure 2B).
4. Dans l'analyse in situ OLIMP
OLIMP peut également être utilisé directement sur les tissus en omettant toute les étapes de préparation du mur. Comme exemple d'Arabidopsis hypocotyles étiolés comme source de tissus végétaux sont utilisés. Encore une fois, une endoglucanase est utilisé pour déterminer la structure de la xyloglucane hémicelluloses. Enzyme et du matériel tissulaire peut être remplacé en fonction de l'analyse désirée à l'aide de la même procédure.
- Récolte un semis étiolées et le placer sur une plaque de MALDI cible vide et de laisser le jeune plant sec.
- Ajouter 0.5μl endoglucanase (0.4U/μl, dissous dans formiate d'ammonium 50 mM, pH 4,5) sur le plant séché à la position désirée. Assurez-vous que la chute de l'enzyme touche partiellement la plaque cible.
- Placer la plaque cible MALDI dans un récipient fermé avec humidité saturante pour éviter que la chute de l'enzyme se dessèche. Incuber la plaque dans la chambre pour 16h à 37 ° C.
- Sécher la plaque cible MALDI avec les tissus de la plante et de la chute d'enzymes sous vide.
- Ajouter 0.5μl matrice (DHB; 10mg / l) sur le dessus de chaque spot enzymes séchés. Laisser reposer pendant 2min.
- Sécher la plaque cible MALDI sous vide.
- Analyser les échantillons avec le MALDI-TOF. Placer la plaque de mire avec le tissu et le spot enzyme / matrice (s) dans un spectromètre de masse MALDI-TOF. La machine doit être configurée en mode réflectron positive avec une tension d'accélération de 20000V et un retard de 350 nm, la gamme de masse choisie doit être de 500 à 3000 Da (peut changer dépendant des oligomères attendus).
- Démarrer tir du laser sur les cristaux de matrice / échantillon suivant le tissu. Assurez-vous que vous ne frappez pas le tissu lui-même, que dans un tel cas, le temps de vol des molécules sera éteint. Recueillir autour de 20 à 50 spectres par endroit, qui sont compilées pour générer un spectre moyen représentatif (figure 3). Ions représentant oligosaccharides spécifiques peuvent être identifiés par leur masse au cours de charge (m / z) Le ratio. Les intensités d'ions (hauteur d'ions) peuvent être signalés et tous les ions d'intérêt devrait être ajoutée à 100% résulte de l'abondance relative de chaque oligosaccharides dans l'échantillon.
5. Les résultats représentatifs
Un exemple d'une analyse de l'OLIMP xyloglucane hémicelluloses présentes dans plants d'Arabidopsis est montré dans la figure 2. En raison des différences de masse des ions et l'enzyme connue bien caractérisés (endoglucanase) la spécificité des ions peuvent être affectés à des structures spécifiques d'oligosaccharides (figure 2A). Évidemment, les isomères structurels ne peuvent pas être distingués. L'hypothèse de base pour la détermination de l'abondance relative des différents oligosaccharides (figure 2B) est que leur facteur de réponse spectrométrie de masse est très similaire à ceux des oligosaccharides. Comme le montre ici, la quantification OLIMP est hautement reproductible. Toutefois, s'il vous plaît noter que la robustesse de la méthode est très dépendante sur le rapport signal sur bruit des différents ions oligosaccharides. Par exemple la contamination par des sels ou des quantités plus faibles d'oligosaccharides peut diminuer ce ratio.
L'analyse OLIMP sur le tissu lui-même (analyse in situ) permet l'étude des zones très petites et définie et implique la préparation des échantillons très peu. Dans l'exemple présenté ici (figure 3) ne qualitatif (mêmes ions), mais des différences quantitatives (variations dans l'intensité des ions) ont été observées entre les pousses et des racines des tissus de la plantule d'Arabidopsis. Permutations des OLIMP-méthode pourrait ainsi conduire à des tissus «imagerie».
Figure 1. Organigramme de la procédure en utilisant des plants d'Arabidopsis OLIMP entier comme une source végétale. Tout d'abord, le tissu est macéré et matériau de paroi cellulaire est préparée (image modifiée à partir Fujino et al. 10). Puis oligosaccharides d'un polysaccharide mur particulier sont libérés en utilisant une hydrolase spécifique. Enfin, les abondances relatives des oligosaccharides solubles sont déterminées par spectrométrie de masse MALDI-TOF.
Figure 2. Abondance relative des oligosaccharides xyloglucane dans les semis étiolés d'Arabidopsis tel que déterminé par OLIMP. A) spectre de masse représentant xyloglucane oligosaccharide; chaque ion représente une structure spécifique d'oligosaccharides, les isomères structurels ne peuvent pas être distingués. B) Diagramme à barres correspondant pour la détermination de l'abondance relative d'oligosaccharides.
Figure 3. Dans l'analyse in situ en utilisant des plants OLIMP étiolés d'Arabidopsis comme exemple. Chaque gouttelette enzyme / digestion (cercles de couleur) peuvent être analysés de manière indépendante et une spectrométrie de masse correspondant peut être obtenu et analysé.
Figure 4. Spectre OLIMP de l'hémicellulose xylane obtenu par digestion du matériel de feuilles de Miscanthus avec une xylanase (Megazyme).
Discussion
La méthode présentée ici permet OLIMP une analyse très sensible et rapide des polymères présents dans les matrices extracellulaires. OLIMP combine la libération enzymatique des oligomères avec subséquentes analyse MALDI-TOF. La génération d'un spectre MALDI-TOF prend moins d'une minute, d'où OLIMP est adapté à un large éventail d'applications, notamment à haut débit des études telles que des écrans mutant. OLIMP n'est pas limitée aux polysaccharides végétaux mais peuvent éventuellement être appliquées à une large gamme de polymères, seulement limitée par la disponibilité de certaines enzymes hydrolytiques. Toutefois, une limitation de OLIMP est que l'abondance absolue du polymère ne peut pas être obtenue.
Comme mentionné précédemment OLIMP peut être utilisé pour étudier la structure d'une variété de polysaccharides présents dans la matrice extracellulaire de la diversité des espèces. À titre d'exemple, la figure 4 représente un spectre OLIMP de l'hémicellulose majeur dans les graminées, le xylane. Ici, matériau de paroi cellulaire dérivée de l'herbe tempérée Miscanthus a été digéré avec une xylanase.
Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Ce travail a été financé par l'énergie Biosciences Institute octroi OO0G01.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,5-dihydroxybenzoic acid | Sigma-Aldrich | 37550 | 10mg/mL in water |
| BioRex MSZ 501(D) Resin | Bio-Rad | 142-7425 | |
| Endoglucanase | Megazyme | E-CELTR | |
| Xylanase M6 | Megazyme | E-XYRU6 | |
| 3mm metal balls | Retsch | 22.455.0011 | |
| Beat mill | Retsch | Mixer Mill MM400 | |
| MALDI-TOF | Shimadzu Corporation | Axima Performance | |
| MALDI target plate | Kratos Analytical | DE4555TA | |
| SpeedVac | Eppendorf | Vacufuge 5301 | |
| Vacuum manifold | EMD Millipore | MSVMHTS00 | |
| Vacuum pump | Welch Allyn | DryFast Ultra 2032 |
References
- Lerouxel, O. Rapid structural phenotyping of plant cell wall mutants by enzymatic oligosaccharide fingerprinting. Plant Physiology. 130 (4), 1754-1754 (2002).
- Obel, N. Microanalysis of plant cell wall polysaccharides. Molecular Plant. 2 (5), 922-922 (2009).
- Mouille, G. Quantitative trait loci analysis of primary cell wall composition in Arabidopsis. Plant Physiology. 141 (3), 1035-1035 (2006).
- Bauer, S. Development and application of a suite of polysaccharide-degrading enzymes for analyzing plant cell walls. PNAS. 103 (30), 11417-11417 (2006).
- Pauly, M. A xyloglucan-specific endo-beta-1,4-glucanase from Aspergillus aculeatus: expression cloning in yeast, purification and characterization of the recombinant enzyme. Glycobiology. 9 (1), 93-93 (1999).
- Aboughe-Angone, S. Cell wall carbohydrates from fruit pulp of Argania spinosa: structural analysis of pectin and xyloglucan polysaccharides. Carbohydr Res. 343 (1), 67-67 (2008).
- Brown, D. M. Comparison of five xylan synthesis mutants reveals new insight into the mechanisms of xylan synthesis. Plant Journal. 52 (6), 1154-1154 (2007).
- Lee, C. The PARVUS gene is expressed in cells undergoing secondary wall thickening and is essential for glucuronoxylan biosynthesis. Plant Cell Physiol. 48 (12), 1659-1659 (2007).
- Obel, N. Pectin may hinder the unfolding of xyloglucan chains during cell deformation: implications of the mechanical performance of Arabidopsis hypocotyls with pectin alterations. Molecular Plant . , (2009).
- Cavalier, D. M., Keegstra, K. Two xyloglucan xylosyltransferases catalyze the addition of multiple xylosyl residues to cellohexaose. Journal of Biological Chemistry. 281 (45), 34197-34197 (2006).
- Leonard, R. Identification of an Arabidopsis gene encoding a GH95 alpha1,2-fucosidase active on xyloglucan oligo- and polysaccharides. Phytochemistry. 69 (10), 1983-1983 (2008).
- Cavalier, D. M., Keegstra, K. Two xyloglucan xylosyltransferases catalyze the addition of multiple xylosyl residues to cellohexaose. Journal of Biological Chemistry. 281 (45), 34197-34197 (2006).
- Lee, C. H. The irregular xylem9 mutant is deficient in xylan xylosyltransferase activity. Plant and Cell Physiology. 48 (11), 1624-1624 (2007).
- Iglesias, N. Apoplastic glycosidases active against xyloglucan oligosaccharides of Arabidopsis thaliana. Plant and Cell Physiology. 47 (1), 55-55 (2006).
- Fujino, T., Sone, Y., Mitsuishi, Y., Itoh, T. Characterization of cross-links between cellulose microfibrils, and their occurrence during elongation growth in pea epicotyl. Plant Cell Physiol. 41 (4), 486-486 (2000).
- Vanzin, G. F. The mur2 mutant of Arabidopsis thaliana lacks fucosylated xyloglucan because of a lesion in fucosyltransferase AtFUT1. PNAS. 99 (5), 3340-3340 (2002).
- Cavalier, D. M. Disrupting two Arabidopsis thaliana xylosyltransferase genes results in plants deficient in xyloglucan, a major primary cell wall component. Plant Cell. 20 (6), 1519-1519 (2008).
- Hilz, H. A comparison of liquid chromatography, capillary electrophoresis, and mass spectrometry methods to determine xyloglucan structures in black currants. Journal of Chromatography A. 1133 (1-2), 275-275 (2006).
- Pauly, M. Effects of the mur1 mutation on xyloglucans produced by suspension-cultured Arabidopsis thaliana cells. Planta. 214 (1), 67-67 (2001).
