Summary
एक तेजी से रास्ते के लिए एक बाह्य मैट्रिक्स में polysaccharides के संरचना में अंतर्दृष्टि लाभ में वर्णित है. विधि glycosylhydrolases की विशिष्टता और जन स्पेक्ट्रोमेट्री की अनुमति विश्लेषण किया जा करने के लिए सामग्री की मात्रा मिनट संवेदनशीलता का लाभ लेता है. इस तकनीक को सीधे ऊतक पर ही इस्तेमाल किया जा अनुकूलनीय है.
Protocol
Olimp विधि के प्रमुख dicot पौधों, xyloglucan के सेल दीवारों में मौजूद hemicellulose पर उदाहरण है, glycosylhydrolase के रूप में एक endoglucanase का उपयोग. विधि प्लान्ट टिशू स्रोत के रूप में पूरे Arabidopsis seedlings के साथ प्रदर्शन किया है. एनजाइम और बाह्य मैट्रिक्स सामग्री वांछित विश्लेषण के आधार पर उसी प्रक्रिया का उपयोग प्रतिस्थापित किया जा सकता है.
1. कोशिका दीवार अलगाव
- हार्वेस्ट पाँच 5 दिन पुरानी पूरे Arabidopsis seedlings या अपने वांछित सामग्री के बराबर राशि और एक 1.5mL प्रतिक्रिया ट्यूब में उन्हें हस्तांतरण. सुनिश्चित करें कि सामग्री ट्यूब के नीचे में रखा जाता है.
- प्रतिक्रिया ट्यूब और तरल नाइट्रोजन में स्नैप - फ्रीज नमूना के शीर्ष पर दो 3mm धातु गेंदों जोड़ें.
- जमी नमूना एक चक्की की गेंद (02:30 मिनट, 25Hz) का उपयोग कर पीस.
- नमूना 1ml 70% जलीय इथेनॉल जोड़ें. धातु गेंदों का उपयोग करते हुए एक चुंबक निकालें. अच्छी तरह भंवर.
- 10min गोली शराब अघुलनशील अवशेषों से युक्त कोशिका दीवार सामग्री के लिए 14,000 rpm पर नमूना अपकेंद्रित्र.
- ध्यान से आकांक्षा से सतह पर तैरनेवाला हटा दें. गोली को परेशान नहीं करने के लिए सुनिश्चित करें.
- क्लोरोफॉर्म / मेथनॉल (01:01 v / v) के समाधान के 1ml जोड़ें. अच्छी तरह भंवर गोली resuspend.
- 10 मिनट के लिए 14,000 rpm पर नमूना अपकेंद्रित्र और ध्यान से आकांक्षा से सतह पर तैरनेवाला हटायें. गोली को परेशान नहीं करने के लिए सुनिश्चित करें.
- एक नमूना concentrator का उपयोग सूखी.
2. Oligosaccharides के solubilization
- Solubilization के लिए अपने oligosaccharides के रूप में विशेष polysaccharide 25μl एक उपयुक्त बफर में सूखी गोली resuspend. Endoglucanase 50mm अमोनियम formate, pH4.5 के लिए प्रयोग किया जाता है. Endoglucanase के 0.2U जोड़ें. भंवर निलंबन और नीचे स्पिन तरल.
- 37 के लिए 16h पर नमूना ° C एक इनक्यूबेटर में सेते हैं, 300rpm में मिलाते हुए.
- पचाने में (पानी) के विलायक एक concentrator का उपयोग निकालें.
3. जारी oligosaccharides के विश्लेषण MALDI-TOF
- BioRex MSZ 501 कटियन विनिमय राल मोती पचा नमूना से लवण और एंजाइम निकालने के लिए किया जाता है. एक खाली स्तंभ में एक विभाज्य रखने और पानी की प्रचुर मात्रा के साथ मोती धोने से मोती हालत.
- पचा और सूखे नमूना 5-10 BioRex मोती जोड़ें. फिर 10μl पानी जोड़ने के लिए पानी की सामग्री 5μl के छोटे मात्रा में इस्तेमाल किया जा सकता है. संक्षिप्त ट्यूब कताई द्वारा समाधान में मोतियों को विसर्जित कर दिया. कमरे के तापमान पर कम से कम 10min के लिए सेते हैं.
- (2,5 dihydroxybenzoic (DHB) एसिड, पानी में 10mg/ml) एक MALDI लक्ष्य थाली पर स्पॉट 2μl मैट्रिक्स. समरूप मैट्रिक्स रासायनिक क्रिस्टल करने के लिए अग्रणी वैक्यूम के अंतर्गत विलायक मैट्रिक्स लुप्त हो जाना.
- लक्ष्य थाली पर मैट्रिक्स क्रिस्टल के शीर्ष पर desalted नमूना समाधान के स्पॉट 2μl.
यदि आप नमूनों की एक बड़ी संख्या में हाजिर करना चाहते हैं केवल 3min की एक अधिकतम के लिए खोलना पर रहते हैं. यह समय फ्रेम सुनिश्चित करता है कि पहले देखा नमूना अभी तक सूखी नहीं है. एक अतिरिक्त 2min के लिए प्रतीक्षा करने के लिए एक पूरी तरह से फिर से भंग और पिछले देखा नमूना में मैट्रिक्स नमूना oligosaccharide अणुओं के मिश्रण सुनिश्चित. फिर एक वैक्यूम के अंतर्गत लक्ष्य थाली सूखी.
मिश्रण / नमूना मैट्रिक्स समरूप crystallization सक्षम 1min से भी कम समय में मणिभ बनाना चाहिए. - लक्ष्य थाली प्लेस MALDI-TOF एक मास स्पेक्ट्रोमीटर में. मशीन 20000V की एक तेजी वोल्टेज और 350 एनएम के एक देरी के साथ सकारात्मक reflectron मोड के लिए सेट किया जाना चाहिए, चयनित जन रेंज 500-3000 दा (मई उम्मीद oligomers पर निर्भर बदलने के). लेजर फायरिंग आरंभ और नमूना प्रति 100-200 स्पेक्ट्रा, जो एक प्रतिनिधि औसत स्पेक्ट्रम (2A चित्रा) उत्पन्न करने के लिए संकलित कर रहे हैं एकत्र. विशिष्ट oligosaccharides प्रतिनिधित्व आयनों प्रभारी अनुपात (मी / z) पर अपने जन से पहचाना जा सकता है. 100 नमूने में प्रत्येक oligosaccharide के रिश्तेदार बहुतायत (चित्रा 2B) में जिसके परिणामस्वरूप% ब्याज के सभी आयनों के आयन तीव्रता (पीक ऊंचाई) जोड़ा जाना चाहिए.
4. सीटू Olimp विश्लेषण में
Olimp भी किसी भी दीवार तैयारी चरणों omitting ऊतक पर सीधे इस्तेमाल किया जा सकता है. एक उदाहरण के रूप में Arabidopsis के hypocotyls etiolated प्लान्ट टिशू स्रोत के रूप में उपयोग किया जाता है. फिर, एक endoglucanase hemicelluloses xyloglucan की संरचना निर्धारित करने के लिए प्रयोग किया जाता है. एनजाइम और ऊतक सामग्री वांछित विश्लेषण के आधार पर उसी प्रक्रिया का उपयोग प्रतिस्थापित किया जा सकता है.
- एक etiolated अंकुर हार्वेस्ट और यह एक खाली MALDI लक्ष्य थाली पर जगह और अंकुर शुष्क.
- वांछित स्थान पर सूखे अंकुर पर 0.5μl endoglucanase (0.4U/μl, 50mm अमोनियम formate में भंग, pH4.5) जोड़ें. यकीन है कि एंजाइम ड्रॉप लक्ष्य थाली आंशिक रूप से छू.
- Saturating नमी के साथ एक बंद कंटेनर में MALDI लक्ष्य थाली प्लेस से बचने कि एंजाइम ड्रॉप बाहर dries. कक्ष में 1 के लिए थाली सेते6 37 डिग्री सेल्सियस
- प्लान्ट टिशू और वैक्यूम के अंतर्गत ड्रॉप एंजाइम के साथ MALDI लक्ष्य थाली सूखी.
- प्रत्येक सूखे एंजाइम स्थान के शीर्ष पर, 0.5μl मैट्रिक्स (10mg / एल DHB) जोड़ें. चलो यह 2min के लिए खड़े हैं.
- वैक्यूम के अंतर्गत MALDI लक्ष्य थाली सूखी.
- MALDI-TOF के साथ नमूनों का विश्लेषण करें. प्लेस और MALDI-TOF एक मास स्पेक्ट्रोमीटर में हाजिर / एंजाइम मैट्रिक्स (ओं) ऊतक के साथ लक्ष्य थाली. मशीन 20000V की एक तेजी वोल्टेज और 350 एनएम के एक देरी के साथ सकारात्मक reflectron मोड के लिए सेट किया जाना चाहिए, चयनित जन रेंज 500-3000 दा (मई उम्मीद oligomers पर निर्भर बदलने के).
- मैट्रिक्स / नमूना क्रिस्टल पर लेजर ऊतक करने के लिए अगला फायरिंग शुरू करो. यकीन है कि आप इस तरह के एक मामले अणुओं की उड़ान के समय बंद हो जाएगा के रूप में ऊतक ही मारा नहीं. हाजिर है, जो एक प्रतिनिधि औसत स्पेक्ट्रम (चित्रा 3) उत्पन्न करने के लिए संकलित कर रहे हैं प्रति 20-50 के आसपास स्पेक्ट्रा लीजिए. विशिष्ट oligosaccharides प्रतिनिधित्व आयनों प्रभारी अनुपात (मी / z) पर अपने जन से पहचाना जा सकता है. आयन तीव्रता (आयन ऊंचाई) और सूचित किया जा सकता है और ब्याज के सभी आयनों 100 नमूने में प्रत्येक oligosaccharides के रिश्तेदार बहुतायत में जिसके परिणामस्वरूप% करने के लिए जोड़ा जाना चाहिए.
5. प्रतिनिधि परिणाम
Hemicelluloses xyloglucan Arabidopsis seedlings में मौजूद की एक Olimp विश्लेषण का एक उदाहरण चित्रा 2 में दिखाया गया है. कारण आयनों की बड़े पैमाने पर मतभेद और प्रसिद्ध विशेषता एंजाइम विशिष्टता (endoglucanase) आयनों विशिष्ट oligosaccharide संरचनाओं (2A चित्रा) को सौंपा जा सकता है. जाहिर है, संरचनात्मक isomers प्रतिष्ठित नहीं किया जा सकता है. विभिन्न oligosaccharides के रिश्तेदार बहुतायत के निर्धारण के लिए बुनियादी धारणा (चित्रा 2B) है कि उनके जन कल्पना प्रतिक्रिया कारक उन oligosaccharides के लिए बहुत समान है. जैसा कि यहाँ दिखाया, Olimp मात्रा का ठहराव अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है. हालांकि, कृपया ध्यान दें कि विधि की मजबूती विभिन्न oligosaccharide आयनों के शोर अनुपात करने के लिए संकेत पर अत्यधिक निर्भर है. उदाहरण के लिए लवण या oligosaccharides की कम मात्रा के साथ संदूषण उस अनुपात में कमी कर सकते हैं.
ऊतक ही (सीटू विश्लेषण में) पर Olimp विश्लेषण बहुत छोटा है और परिभाषित क्षेत्रों के अध्ययन के लिए सक्षम बनाता है और बहुत कम नमूना तैयार शामिल है. यहाँ प्रस्तुत उदाहरण में (चित्रा 3) कोई गुणात्मक (एक ही आयनों), लेकिन मात्रात्मक मतभेद (आयन तीव्रता में भिन्नता) और Arabidopsis अंकुर की जड़ ऊतक शूट के बीच मनाया गया . Olimp विधि के क्रमपरिवर्तन इस प्रकार ऊतक "इमेजिंग" करने के लिए नेतृत्व सकता है.
चित्रा 1. Olimp एक संयंत्र स्रोत के रूप में पूरे Arabidopsis seedlings का उपयोग प्रक्रिया का प्रवाह चार्ट . सबसे पहले, ऊतक macerated है और कोशिका दीवार सामग्री तैयार किया जाता है (चित्र Fujino एट अल से संशोधित 10.) . फिर एक विशेष दीवार polysaccharide के oligosaccharides एक विशिष्ट hydrolase का उपयोग करने के लिए जारी कर रहे हैं. अंत में, घुलनशील oligosaccharides के रिश्तेदार abundances MALDI-TOF मास स्पेक्ट्रोमेट्री का उपयोग करने के लिए निर्धारित कर रहे हैं.
चित्रा 2 Arabidopsis से etiolated seedlings में xyloglucan oligosaccharides के रूप में Olimp द्वारा निर्धारित की सापेक्ष बहुतायत. ए) प्रतिनिधि xyloglucan oligosaccharide जन स्पेक्ट्रम, प्रत्येक आयन एक विशिष्ट oligosaccharide संरचना का प्रतिनिधित्व करता है, संरचनात्मक isomers प्रतिष्ठित किया जा नहीं कर सकते. बी) के रिश्तेदार oligosaccharide बहुतायत के निर्धारण के लिए अनुरूप दंड चित्र.
3 सीटू Olimp उदाहरण के रूप में Arabidopsis के etiolated seedlings के विश्लेषण का उपयोग में चित्रा. प्रत्येक छोटी बूंद / एंजाइम पाचन (रंग हलकों) स्वतंत्र रूप से विश्लेषण किया जा सकता है और इसी जन स्पेक्ट्रा और प्राप्त किया जा सकता है विश्लेषण.
चित्रा 4 hemicellulose एक xylanase (Megazyme) के साथ miscanthus पत्ता सामग्री पचा द्वारा प्राप्त xylan के Olimp स्पेक्ट्रम .
Discussion
Olimp विधि यहाँ प्रस्तुत कोशिकी matrices में मौजूद पॉलिमर के एक बहुत ही संवेदनशील और तेजी से विश्लेषण सक्षम बनाता है. Olimp बाद विश्लेषण MALDI-TOF के साथ oligomers के enzymatic रिलीज को जोड़ती है. MALDI-TOF स्पेक्ट्रम की पीढ़ी कम से कम एक मिनट लगता है, इसलिए Olimp आवेदनों की एक विस्तृत उत्परिवर्ती स्क्रीन जैसे उच्च throughput अध्ययन सहित रेंज के लिए उपयुक्त है. Olimp संयंत्र polysaccharides तक ही सीमित नहीं है, लेकिन संभावित पॉलिमर विशिष्ट hydrolytic एंजाइमों की उपलब्धता द्वारा ही सीमित की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए लागू किया जा सकता है. हालांकि, Olimp की एक सीमा है कि बहुलक का एक निरपेक्ष बहुतायत प्राप्त नहीं किया जा सकता है.
जैसा कि पहले उल्लेख किया Olimp प्रजातियों में से एक विविधता के बाह्य मैट्रिक्स में मौजूद polysaccharides के एक किस्म की संरचना का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. एक उदाहरण के रूप में चित्रा 4 में घास की प्रजातियों में प्रमुख hemicellulose, xylan Olimp स्पेक्ट्रम का प्रतिनिधित्व करता है. यहाँ, कोशिका दीवार शीतोष्ण घास miscanthus से व्युत्पन्न सामग्री xylanase का उपयोग कर पचा गया था.
Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
इस काम ऊर्जा बायोसाइंसेज संस्थान अनुदान OO0G01 द्वारा वित्त पोषित किया गया था.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,5-dihydroxybenzoic acid | Sigma-Aldrich | 37550 | 10mg/mL in water |
| BioRex MSZ 501(D) Resin | Bio-Rad | 142-7425 | |
| Endoglucanase | Megazyme | E-CELTR | |
| Xylanase M6 | Megazyme | E-XYRU6 | |
| 3mm metal balls | Retsch | 22.455.0011 | |
| Beat mill | Retsch | Mixer Mill MM400 | |
| MALDI-TOF | Shimadzu Corporation | Axima Performance | |
| MALDI target plate | Kratos Analytical | DE4555TA | |
| SpeedVac | Eppendorf | Vacufuge 5301 | |
| Vacuum manifold | EMD Millipore | MSVMHTS00 | |
| Vacuum pump | Welch Allyn | DryFast Ultra 2032 |
References
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