Summary
Un modo rapido per guadagnare è descritto lo studio della struttura di polisaccaridi in una matrice extracellulare. Il metodo sfrutta la specificità del glycosylhydrolases e la sensibilità della spettrometria di massa permette piccole quantità di materiale da analizzare. Questa tecnica è adattabile per essere utilizzato direttamente sul tessuto stesso.
Abstract
Il contatto diretto delle cellule con l'ambiente è mediato in molti organismi da una matrice extracellulare. Un aspetto comune delle matrici extracellulari è che essi contengono frazioni di zuccheri complessi in forma di glicoproteine, proteoglicani, e / o polisaccaridi. Alcuni esempi sono la matrice extracellulare degli esseri umani e cellule animali che consistono principalmente di proteine fibrillari e proteoglicani o la base di polisaccaridi pareti delle cellule delle piante e funghi, e il proteoglicani / glicolipide pareti cellulari a base di batteri. Tutti questi glycostructures giocano un ruolo fondamentale nella cellula-cellula e comunicazione cellula-ambiente e di segnalazione.
Un esempio straordinario complesso di una matrice extracellulare è presente nelle pareti delle cellule delle piante superiori. Il loro muro è fatto quasi interamente di zuccheri, fino al 75% del peso secco, e consiste nella più abbondanti biopolimeri presenti su questo pianeta. Pertanto, la ricerca è condotta come utilizzare questi materiali migliori come carbon-neutral delle risorse rinnovabili in sostituzione di prodotti petrolchimici derivati da combustibili fossili. La sfida principale per la conversione del carburante rimane la riluttanza dei muri per degradazione enzimatica o chimica a causa della glycostructures unici presenti in questo biocomposite unico.
Qui, vi presentiamo un metodo per l'analisi rapida e sensibile di glycostructures cellula vegetale muro. Questo metodo di analisi di massa oligo (OLIMP) si basa il rilascio enzimatica di oligosaccaridi da facilitare glycosylhydrolases Pareti di materiali specifici e successiva analisi delle miscele solubilizzato oligosaccaridi utilizzando matrice laser assistita desorbimento / ionizzazione tempo di volo spettrometria di massa (MALDI-TOF/MS ) 1 (Figura 1). OLIMP richiede pareti delle celle solo 5000 per una analisi completa, può essere effettuata sul tessuto stesso 2, ed è suscettibile di high-throughput analisi 3. Mentre la quantità assoluta dei oligosaccaridi solubilizzato non può essere determinata da OLIMP l'abbondanza relativa degli ioni vari oligosaccaridi possono essere delineate dagli spettri di massa dando intuizioni circa la sostituzione-pattern del polisaccaride nativo presente nel muro.
OLIMP può essere utilizzato per analizzare una vasta gamma di polimeri muro, limitato solo dalla disponibilità di enzimi specifici 4. Ad esempio, per l'analisi dei polimeri presenti nei enzimi vegetali della parete cellulare sono disponibili per analizzare i xyloglucan emicellulose utilizzando un xyloglucanase 5, 11, 12, 13, xilano utilizzando un endo-β-(1-4) xilanasi 6,7 , o per polisaccaridi pectiche utilizzando una combinazione di una poligalatturonasi e un methylesterase 8. Inoltre, utilizzando gli stessi principi di OLIMP glycosylhydrolase e anche attività glicosiltransferasi possono essere monitorati e determinato 9.
Protocol
Il metodo OLIMP è esemplificata sulla emicellulosa più importanti presenti nelle pareti cellulari delle piante dicot, xyloglucan, utilizzando un endoglucanase come glycosylhydrolase. Il metodo è dimostrato con tutta piantine di Arabidopsis come fonte di tessuto vegetale. Materiale della matrice extracellulare di enzimi e può essere sostituito in base all'analisi desiderato utilizzando la stessa procedura.
1. Isolamento della parete cellulare
- Harvest cinque 5 giorni di età le piante intere Arabidopsis o l'equivalente del materiale desiderato e trasferirli in una provetta di reazione 1,5 ml. Assicurarsi che il materiale si trova nel fondo della provetta.
- Aggiungere due sfere di metallo tre millimetri al tubo di reazione sulla parte superiore del campione e snap-congelare in azoto liquido.
- Frantumare il campione congelato utilizzando un mulini a palle (2:30 min, 25 Hz).
- Aggiungere 1 ml di etanolo al 70% acquosa al campione. Rimuovere le sfere di metallo con un magnete. Vortex accuratamente.
- Centrifugare campione a 14.000 rpm per 10 minuti per far sedimentare il residuo insolubile alcool contenente il materiale della parete cellulare.
- Rimuovere con cautela il surnatante tramite aspirazione. Fare attenzione a non disturbare il pellet.
- Aggiungere 1 ml di cloroformio / metanolo (1:1 v / v). Vortex a fondo per risospendere il pellet.
- Centrifugare campione a 14.000 rpm per 10 minuti e rimuovere con attenzione il surnatante tramite aspirazione. Fare attenzione a non disturbare il pellet.
- Secco il campione con un concentratore.
2. Solubilizzazione di oligosaccaridi
- Per la solubilizzazione del polisaccaride particolare forma dei suoi oligosaccaridi risospendere il pellet in secco 25μl di un buffer adeguato. Per la formiato endoglucanase ammonio 50 mM, pH4.5, viene utilizzato. Aggiungi 0.2U di endoglucanase. Vortex la sospensione e liquido spin down.
- Incubare il campione per 16h a 37 ° C in un incubatore, agitazione a 300rpm.
- Togliere il solvente del digest (acqua) con un concentratore.
3. MALDI-TOF analisi del oligosaccaridi rilasciato
- BioRex MSZ 501 perle di resina a scambio cationico sono utilizzati per eliminare i sali ed enzimi dal campione digerito. Condizione le perle inserendo una aliquota in una colonna vuota e lavare le perline con abbondante acqua.
- Aggiungi 5-10 perline BioRex al campione digerito e asciugato. Quindi aggiungere acqua 10μl, per piccole quantità di materiale 5μl di acqua può essere utilizzata. Immergere le perline nella soluzione con una breve rotazione del tubo. Incubare per almeno 10 minuti a temperatura ambiente.
- Spot 2μl matrice (2,5-dihydroxybenzoic acido (DHB), 10mg/ml in acqua) su una piastra MALDI. Far evaporare il solvente sotto vuoto matrice porta a cristalli omogenea matrice chimica.
- 2μl posto della soluzione del campione dissalati in cima alla matrice di cristalli sulla piastra bersaglio.
Se si vuole individuare un gran numero di campioni solo continuare a spotting per un massimo di 3 minuti. Questo lasso di tempo assicura che il primo campione individuato non è ancora asciutto. Aspettare un 2min aggiuntivo per assicurare una miscelazione di ri-dissolto matrice e le molecole del campione oligosaccaridi nel campione ultimi maculato. Poi asciugare la piastra bersaglio sotto vuoto.
Il campione / matrice mix dovrebbe cristallizzare in meno di 1 minuto per permettere cristallizzazione omogenea. - Mettere in una piastra segnale MALDI-TOF spettrometro di massa. La macchina deve essere impostata in modalità positiva reflectron con una tensione di accelerazione di 20000V e un ritardo di 350 nm, il range di massa selezionato dovrebbe essere 500-3000 Da (può cambiare dipende dalla oligomeri previsto). Iniziare a sparare il laser e raccogliere 100-200 spettri per campione, che sono compilati per generare uno spettro rappresentativo medio (Figura 2A). Ioni che rappresentano oligosaccaridi specifici possono essere identificati mediante il loro peso su carica (m / z) rapporto. Le intensità di ioni (altezza di picco) di tutti gli ioni di interesse deve essere aggiunto fino al 100% con conseguente abbondanza relativa di ogni oligosaccaridi del campione (Figura 2B).
4. Nell'analisi OLIMP situ
OLIMP può essere utilizzato anche direttamente sul tessuto tralasciando alcuna iniziativa preparazione muro. Come esempio eziolata hypocotyls di Arabidopsis come fonte tessuto vegetale sono utilizzati. Ancora una volta, un endoglucanase viene utilizzato per determinare la struttura del xyloglucan emicellulose. Enzima e il materiale del tessuto possono essere sostituiti in base all'analisi desiderato utilizzando la stessa procedura.
- Harvest uno pianticella eziolata e collocarla su una piastra MALDI vuoto e lasciare che la piantina secca.
- Aggiungi 0.5μl endoglucanase (0.4U/μl, disciolto in formiato di ammonio 50 mM, pH4.5) sulla piantina essiccata nella posizione desiderata. Assicurarsi che la goccia enzima tocca in parte la piastra bersaglio.
- Posizionare la piastra segnale MALDI in un contenitore chiuso con umidità saturazione per evitare che la caduta di enzima si asciuga. Incubare la piastra nella camera per 16h a 37 ° C.
- Asciugare la piastra MALDI con il tessuto della pianta e la caduta di enzima sotto vuoto.
- Aggiungi 0.5μl matrice (DHB; 10 mg / l) in cima ad ogni punto enzima secca. Lasciate riposare per 2 minuti.
- Asciugare la piastra segnale MALDI sotto vuoto.
- Analizzare campioni con il MALDI-TOF. Luogo piastra con il tessuto e l'enzima / matrice spot (s) in un MALDI-TOF spettrometro di massa. La macchina deve essere impostata in modalità positiva reflectron con una tensione di accelerazione di 20000V e un ritardo di 350 nm, il range di massa selezionato dovrebbe essere 500-3000 Da (può cambiare dipende dalla oligomeri previsto).
- Iniziare a sparare il laser sulla matrice / campione cristalli NEXT per il tessuto. Assicuratevi di non colpire il tessuto stesso, come in questo caso il tempo di volo delle molecole sarà spento. Raccogliere intorno 20-50 spettri per punto, che sono compilati per generare uno spettro rappresentativo medio (Figura 3). Ioni che rappresentano oligosaccaridi specifici possono essere identificati mediante il loro peso su carica (m / z) rapporto. Le intensità di ioni (ioni di altezza) possono essere riportati e tutti gli ioni di interesse deve essere aggiunto fino al 100% con conseguente abbondanza relativa di ogni oligosaccaridi nel campione.
5. Rappresentante Risultati
Un esempio di analisi OLIMP del xyloglucan emicellulose presenti in piantine di Arabidopsis è illustrato nella figura 2. A causa delle differenze di massa degli ioni e l'enzima noto ben caratterizzato (endoglucanase) specificità gli ioni possono essere assegnati a specifiche strutture oligosaccaridi (Figura 2A). Ovviamente, isomeri strutturali non possono essere distinte. L'assunto di base per la determinazione della relativa abbondanza dei vari oligosaccaridi (Figura 2B) è che la loro spec fattore di risposta di massa è molto simile per quelli oligosaccaridi. Come mostrato qui, la quantificazione OLIMP è altamente riproducibile. Tuttavia, si ricorda che la robustezza del metodo dipende in larga misura il segnale ai rapporti rumore dei vari ioni oligosaccaridi. Ad esempio la contaminazione con sali o minori quantità di oligosaccaridi può diminuire tale rapporto.
L'analisi OLIMP sullo stesso tessuto (analisi in situ) consente lo studio di aree molto piccole e definito e prevede la preparazione del campione molto poco. Nell'esempio qui presentato (Figura 3) non qualitativa (ioni stesso), ma differenze quantitative (variazione di intensità di ioni) sono state osservate tra le riprese e la radice dei tessuti della piantina Arabidopsis. Permutazioni della OLIMP-metodo potrebbe causare così il tessuto "imaging".
Figura 1. Diagramma di flusso della procedura OLIMP utilizzando piantine di Arabidopsis tutto come fonte vegetale. In primo luogo, il tessuto è macerata e pareti di materiale cellulare è preparato (immagine modificata da Fujino et al. 10). Poi oligosaccaridi di un polisaccaride muro particolare vengono rilasciati utilizzando una idrolasi specifica. Infine, le abbondanze relative delle oligosaccaridi solubili sono determinati utilizzando MALDI-TOF spettrometria di massa.
Figura 2. Abbondanza relativa di oligosaccaridi xyloglucan in piantine di Arabidopsis eziolata come determinato dal OLIMP. A) Rappresentante spettro di massa oligosaccaride xyloglucan; ogni ione rappresenta una struttura specifica oligosaccaridi, isomeri strutturali non possono essere distinte. B) diagramma a barre corrispondenti per la determinazione della relativa abbondanza oligosaccaridi.
Figura 3. Nell'analisi OLIMP situ utilizzando piantine di Arabidopsis eziolata come esempio. Ogni enzima / digestione goccia (cerchi colorati) possono essere analizzati in modo indipendente e spettri di massa corrispondente possono essere ottenuti e analizzati.
Figura 4. Spettro OLIMP del xilano emicellulosa ottenuto da digerire materiale fogliare Miscanthus con un xilanasi (Megazyme).
Discussion
Il metodo OLIMP qui presentata consente una analisi molto sensibile e rapida dei polimeri presenti nelle matrici extracellulari. OLIMP combina il rilascio enzimatico di oligomeri con successiva analisi MALDI-TOF. La generazione di un MALDI-TOF spettro richiede meno di un minuto, quindi OLIMP è adatto per una vasta gamma di applicazioni, tra high-throughput studi come schermi mutante. OLIMP non si limita ai polisaccaridi vegetali, ma può potenzialmente essere applicato a una vasta gamma di polimeri, limitato solo dalla disponibilità di specifici enzimi idrolitici. Tuttavia, una limitazione di OLIMP è che l'abbondanza assoluta del polimero non può essere ottenuto.
Come accennato prima OLIMP può essere usato per studiare la struttura di una varietà di polisaccaridi presenti nella matrice extracellulare di una diversità di specie. A titolo di esempio, la Figura 4 rappresenta uno spettro OLIMP della emicellulosa principali specie di erba, xilano. Qui, parete materiale cellulari derivate da l'erba Miscanthus temperato è stato digerito con un nasi.
Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato finanziato dalla Energy Biosciences Institute concedere OO0G01.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,5-dihydroxybenzoic acid | Sigma-Aldrich | 37550 | 10mg/mL in water |
| BioRex MSZ 501(D) Resin | Bio-Rad | 142-7425 | |
| Endoglucanase | Megazyme | E-CELTR | |
| Xylanase M6 | Megazyme | E-XYRU6 | |
| 3mm metal balls | Retsch | 22.455.0011 | |
| Beat mill | Retsch | Mixer Mill MM400 | |
| MALDI-TOF | Shimadzu Corporation | Axima Performance | |
| MALDI target plate | Kratos Analytical | DE4555TA | |
| SpeedVac | Eppendorf | Vacufuge 5301 | |
| Vacuum manifold | EMD Millipore | MSVMHTS00 | |
| Vacuum pump | Welch Allyn | DryFast Ultra 2032 |
References
- Lerouxel, O. Rapid structural phenotyping of plant cell wall mutants by enzymatic oligosaccharide fingerprinting. Plant Physiology. 130 (4), 1754-1754 (2002).
- Obel, N. Microanalysis of plant cell wall polysaccharides. Molecular Plant. 2 (5), 922-922 (2009).
- Mouille, G. Quantitative trait loci analysis of primary cell wall composition in Arabidopsis. Plant Physiology. 141 (3), 1035-1035 (2006).
- Bauer, S. Development and application of a suite of polysaccharide-degrading enzymes for analyzing plant cell walls. PNAS. 103 (30), 11417-11417 (2006).
- Pauly, M. A xyloglucan-specific endo-beta-1,4-glucanase from Aspergillus aculeatus: expression cloning in yeast, purification and characterization of the recombinant enzyme. Glycobiology. 9 (1), 93-93 (1999).
- Aboughe-Angone, S. Cell wall carbohydrates from fruit pulp of Argania spinosa: structural analysis of pectin and xyloglucan polysaccharides. Carbohydr Res. 343 (1), 67-67 (2008).
- Brown, D. M. Comparison of five xylan synthesis mutants reveals new insight into the mechanisms of xylan synthesis. Plant Journal. 52 (6), 1154-1154 (2007).
- Lee, C. The PARVUS gene is expressed in cells undergoing secondary wall thickening and is essential for glucuronoxylan biosynthesis. Plant Cell Physiol. 48 (12), 1659-1659 (2007).
- Obel, N. Pectin may hinder the unfolding of xyloglucan chains during cell deformation: implications of the mechanical performance of Arabidopsis hypocotyls with pectin alterations. Molecular Plant . , (2009).
- Cavalier, D. M., Keegstra, K. Two xyloglucan xylosyltransferases catalyze the addition of multiple xylosyl residues to cellohexaose. Journal of Biological Chemistry. 281 (45), 34197-34197 (2006).
- Leonard, R. Identification of an Arabidopsis gene encoding a GH95 alpha1,2-fucosidase active on xyloglucan oligo- and polysaccharides. Phytochemistry. 69 (10), 1983-1983 (2008).
- Cavalier, D. M., Keegstra, K. Two xyloglucan xylosyltransferases catalyze the addition of multiple xylosyl residues to cellohexaose. Journal of Biological Chemistry. 281 (45), 34197-34197 (2006).
- Lee, C. H. The irregular xylem9 mutant is deficient in xylan xylosyltransferase activity. Plant and Cell Physiology. 48 (11), 1624-1624 (2007).
- Iglesias, N. Apoplastic glycosidases active against xyloglucan oligosaccharides of Arabidopsis thaliana. Plant and Cell Physiology. 47 (1), 55-55 (2006).
- Fujino, T., Sone, Y., Mitsuishi, Y., Itoh, T. Characterization of cross-links between cellulose microfibrils, and their occurrence during elongation growth in pea epicotyl. Plant Cell Physiol. 41 (4), 486-486 (2000).
- Vanzin, G. F. The mur2 mutant of Arabidopsis thaliana lacks fucosylated xyloglucan because of a lesion in fucosyltransferase AtFUT1. PNAS. 99 (5), 3340-3340 (2002).
- Cavalier, D. M. Disrupting two Arabidopsis thaliana xylosyltransferase genes results in plants deficient in xyloglucan, a major primary cell wall component. Plant Cell. 20 (6), 1519-1519 (2008).
- Hilz, H. A comparison of liquid chromatography, capillary electrophoresis, and mass spectrometry methods to determine xyloglucan structures in black currants. Journal of Chromatography A. 1133 (1-2), 275-275 (2006).
- Pauly, M. Effects of the mur1 mutation on xyloglucans produced by suspension-cultured Arabidopsis thaliana cells. Planta. 214 (1), 67-67 (2001).
