Summary
En chirurgie de survie in utero chez la souris permet la manipulation moléculaire de l'expression des gènes pendant le développement. Nous décrivons ici l'utilisation de l'imagerie à haute fréquence à ultrasons pour guider l'injection de vecteurs rétroviraux dans le cerveau de souris au jour embryonnaire (E) 9.5.
Abstract
En chirurgie de survie in utero chez la souris permet la manipulation moléculaire de l'expression des gènes pendant le développement. Cependant, parce que la paroi utérine est opaque durant l'embryogenèse précoce, la capacité de cibler des parties spécifiques de l'embryon pour la microinjection est fortement limitée. Heureusement, l'imagerie par ultrasons à haute fréquence permet la génération d'images qui peuvent être utilisés en temps réel pour guider une aiguille microinjection dans la région embryonnaire de l'intérêt. Nous décrivons ici l'utilisation de l'imagerie telles pour guider l'injection de vecteurs rétroviraux dans le système ventriculaire du cerveau antérieur de souris au jour embryonnaire (E) 9.5. Cette méthode utilise une laparotomie pour permettre l'accès aux cornes utérines, et une plaque spécialement conçue qui permet embryons hôtes d'être baigné dans une solution saline pendant qu'ils sont imagés et injectée. Chirurgies réussies entraînent souvent dans la plupart ou la totalité des embryons injectés survivre à n'importe quel point du temps ultérieur d'intérêts (embryonnaire ou postnatale). Les principes décrits ici peuvent être utilisés avec de légères modifications à effectuer des injections dans le liquide amniotique d'embryons E8.5 (permettant ainsi l'infection ainsi que l'étendue antéro-postérieure du tube neural, qui n'a pas encore fermé), ou dans le système ventriculaire du cerveau à E10.5/11.5. En outre, à la mi-neurogène âges (~ E13.5), l'échographie peut être utilisée injection directe dans les régions cérébrales spécifiques de l'infection virale ou une transplantation de cellules. L'utilisation de l'échographie pour guider les injections in utero chez la souris est une technique très puissante qui permet la manipulation moléculaire et cellulaire des embryons de souris de manière qui serait autrement extrêmement difficile, voire impossible.
Protocol
Partie 1. Préparer la zone chirurgicale
- Si vous travaillez avec des réactifs biologiques dangereux (par exemple des vecteurs rétroviraux), la chirurgie doit être réalisée à l'intérieur d'une armoire de biosécurité II (CSB). Le microscope de rétrodiffusion ultrasonore (UBM) devraient s'asseoir à côté de la BSC, avec le transducteur à l'intérieur du BSC, et maintenu en place par un support moteur contrôlé sur une scène spécialement conçue chirurgicale. Les composants nécessaires pour construire le stade montré dans la vidéo sont répertoriés sur la ligne. Cette liste, avec des images de la scène sous plusieurs angles (disponible sur demande), devrait permettre la construction.
- L'ouverture et la fermeture de la laparotomie (intervention chirurgicale dans laquelle la cavité abdominale est à ciel ouvert pour permettre l'accès aux organes internes) est habituellement réalisée sur un tampon absorbant avec support en plastique. Avant la chirurgie de tous les outils nécessaires (par exemple un rasoir, des ciseaux chirurgicaux, des pinces, chargé autoclip applicateur, etc), et des matériaux (par exemple du PBS, les sutures, l'anesthésie, le titulaire de la souris et la plaque sus-jacente, etc) doivent être stérilisés et placés dans le zone chirurgicale. Limiter la quantité de temps l'incision est ouvert est important pour optimiser les chances de succès à la chirurgie. Toutes les manipulations d'animaux doit être effectué avec des gants qui ont été désinfectés avec MB-10 solution, ou l'équivalent. Une désinfection répétée devrait être réalisée si nécessaire pour assurer que les gants sont stériles.
Partie 2. L'anesthésie de la souris
- Remplir une seringue de 1 cc de la solution anesthésique contenant une partie (50 mg / ml de pentobarbital) Nembutal à 4 parties filtrée stérilisée à 25 mg / ml de sulfate de magnésium dans du PBS. Cela se traduira par une solution qui est de 10 mg / ml de pentobarbital et 20 mg / ml de sulfate de magnésium. Chaque souris devraient être pondérés individuellement, et injectés avec 90 mg par kg de poids corporel pentobarbital (par exemple, une souris 28 g serait injecté avec 250 pi).
- Injecter dans l'abdomen (voie intrapéritonéale, IP) d'une souris enceinte à jour embryonnaire (E) 9.5 (peut utiliser d'autres âges que nécessaire) pénétrer la peau et les muscles abdominaux. Permettez 8-12 minutes pour la souris de devenir non-recevable. L'anesthésie adéquate doit être confirmée par la posture décontractée de l'animal, et le manque de mouvement en réponse à la queue et pincées orteil. Pinçant doucement entre les ongles est très sensible, et l'absence de toute réponse à ces pincements indique que les animaux sont suffisamment anesthésiés. Remarque, même les animaux qui sont complètement insensibles aux pincements queue et pieds peuvent parfois contraction légèrement en réponse à l'incision chirurgicale initiale. Cependant, ceci est une réponse réfléchie et n'indique pas d'anesthésie inadéquate. Baume ophtalmiques à base de pétrole devrait être appliqué sur les yeux de la souris pour éviter le dessèchement pendant la chirurgie.
- Mise en place de la zone chirurgicale et la machine à ultrasons en attendant la souris pour devenir anesthésiés. Puisque l'utilisation de rétrovirus ou lentivirus nécessite BSL2 de confinement, comme indiqué ci-dessus les injections virale doit être effectuée dans un cabinet de biosécurité II. En outre, toutes les solutions et les matériaux jetables qui entre en contact avec le virus doivent être décontaminés avec une solution javellisée à 10%. Les instruments chirurgicaux et appareils d'échographie doivent être traitées avec une solution de stérilisation tels que MB-10 ( http://www.quiplabs.com/mb10.htm ), ou un équivalent utilisé par l'installation en question.
Partie 3. L'exposition des embryons
- Si possible (selon les contraintes de l'installation animal donné et l'espace disponible), il est préférable d'avoir l'aire de préparation chirurgicale dans un endroit séparé de la zone chirurgicale. Cela permettrait de minimiser les chances de contamination croisée entre les animaux. Pour lancer l'opération, placer l'animal sur le dos sur une surface stérile absorbant et laver soigneusement la zone abdominale avec de l'éthanol à 70%. Traitements préopératoire plus vaste peut être utilisé (par exemple, des cycles successifs de la Bétadine et des lavages éthanol à 70%), mais dans notre expérience, cela n'est pas nécessaire pour ce type de chirurgie de survie des rongeurs. En utilisant une lame de rasoir à double tranchant, raser les poils de l'abdomen dans une zone d'environ 1 pouce de large et 1,5 cm de long. Utilisez courts mouvements rapides avec le rasoir à environ un angle de 45 °. Il est important que la zone chirurgicale être convenablement traitée, mais non soumis à un mouillage excessif, car cela peut entraîner refroidissement inutile de l'animal, voire une hypothermie.
- Utiliser beaux ciseaux chirurgicaux faire une une «incision longitudinale à travers la peau en premier, et ensuite à travers le muscle abdominal de l'animal (coupage en traversant le tissu conjonctif de la peau détenant au muscle aidera à la deuxième incision). Notez que tout le soin procédure devrait être prises pour assurer que les outils chirurgicaux restent stériles, et le traitement avec un désinfectant doit être réalisée si nécessaire (c'est à dire si les info-bulles sont en contact avec des non-sterile matériel).
- En utilisant une pince attentivement tirer cornes utérines, et d'enregistrer le nombre d'embryons de chaque côté. Tout en laissant deux embryons exposés adjacentes (sélection dont deux dépendent de la configuration de chaque côté), placez la plupart des cornes utérines de retour dans l'animal. Dans ce contexte, deux embryons seront exposés à un moment donné et baignés dans du PBS, tandis que la mère reste sur le dos.
- Placez l'animal sur son dos dans le support en plexiglas où il sera pendant la chirurgie (Figure1A) *. Ensuite, abaisser la boîte de culture de tissu de 10cm ** (qui doivent être désinfectés avec MB-10 avant de l'utiliser) vers le bas sur la mère, avec une paire de pince placée légèrement à travers la membrane verte silastic (faite en utilisant le caoutchouc de silicone RTV L de base, et durcisseur, les numéros de produits Dow-Corning 3142761 2156946 et, respectivement). Comme vous le bas de la plaque vers le bas sur l'animal, utilisez la pince pour saisir le tissu utérin entre les deux embryons à injecter, et doucement les tirer à travers la membrane. Dans le même temps, la plaque est abaissée complètement vers le bas sur le support, et les punaises sont poussés pour le maintenir en place. Pré-chauffé (à 37 ° C) PBS est ensuite ajouté à l'antenne pour couvrir complètement les embryons.
- Placer la phase d'injection contenant de l'animal et les embryons exposés sous la sonde échographique (Figure1A) pour créer imagerie en temps réel des embryons exposés à travers la paroi utérine (Figure1B). La sonde est ensuite abaissée (en utilisant les commandes motorisées) dans le bain de PBS directement sur les embryons à imager. Les images peuvent être obtenus quand la sonde est d'environ 2-3 mm de l'embryon. Il est très important de s'assurer que la tête de la sonde ne touche pas les embryons comme il oscille d'avant en arrière pour recueillir des images.
* Le détenteur de la mère se repose dans lors de la chirurgie peuvent être facilement réalisés par un atelier d'usinage. Il devrait inclure une base de plexiglas de large, avec deux côtés en plexiglas collé sur le dessus, et un espace entre eux (assez large pour la souris pour s'adapter en position couchée sur le dos). Les côtés devraient avoir un terrain vallée hors d'eux, qui est ensuite rempli avec de la cire noire (par exemple à partir d'un bac de dissection). C'est la cire sert de matériau dans lequel punaises seront pressés de maintenir enfoncée la plaque de PBS que les embryons sont baignés dans l'injection.
Plats 10cm ** bactérienne doit avoir un trou (environ 2cm de diamètre) découpées dans le centre de la partie inférieure (cela peut être fait avec un Heavy Duty Portable Punch et une 13/16 ème meurent centimètre circulaire: http://roperwhitney .com/punching/2-1011.cfm ). En outre, les deux petits trous de chaque côté du trou de centre (environ 1,5 cm environ) doit être brûlé avec une aiguille chauffée à la flamme (ou ils pourraient être faits avec une perceuse bien sûr). Ces trous sont ensuite recouverts avec de la graisse à vide et sera le lieu où l'punaises qui tiennent la plaque sur le support pousser à travers dans la cire noire. La graisse à vide est de prévenir la CPE de s'échapper.
Partie 4. Chargement virus dans une aiguille microinjection
- Mode d'une aiguille de microinjection par biseautage une 1mm (diamètre intérieur) tiré capillaire en verre. La netteté de l'aiguille est critique, et de travailler avec une aiguille suffisamment forte peut sérieusement compromettre la pénétration de la paroi utérine et le sac amniotique, et peut conduire à l'échec expérimental. L'aiguille aiguisée est ensuite placé dans le porte-pipette, qui est relié via un tube d'une microseringue 25 uL monté dans un manuel de perfusion / retrait de la pompe (d'autres dispositifs peuvent être utilisés pour réguler le chargement et le déchargement de l'aiguille, mais c'est ce qui est montré dans la vidéo). Pour une réactivité optimale (pour éviter l'expansion et la compression associée à un système d'air remplie), la microseringue, des tubes, et l'aiguille doit être rempli avec de l'huile minérale.
- Avant de charger l'aiguille s'assurer qu'il n'y ait pas de bulles d'air dans le système de la seringue tout le chemin à la pointe de l'aiguille. Puis reculer d'un petite bulle d'air (1-2 mm de longueur) dans l'aiguille avant de commencer à charger le virus. Cette poche d'air permet de maintenir la séparation entre le virus et l'huile minérale. Le stock viral à être injectée doit contenir polybrène à une concentration finale de 0,08 mg / ml (pour plus d'informations sur la production de virus s'il vous plaît se référer aux références 1, 2). Notez que les stocks de concentrés rétroviraux contiennent généralement une quantité importante de matières particulaires, qui contient la majorité de la matière infectieuse, et ne peuvent donc pas être filtré sans 5 - à la baisse de 10 fois en titre. En outre, selon la préparation, le stock viral peut être visqueux de l'ADN génomique des cellules lysées emballage (particulièrement vrai si vous utilisez 293 cellules pour générer MLV / VSV virus pseudotypées). Si la partie aliquote de virus est visqueux, une petite quantité de DNAse I peuvent et doivent être ajoutées pour desserrer le stock, ou le chargement de l'aiguille sera extrêmement difficile. Une gouttelettes du stock viral (8-10 uL) doit être placé sur un morceau de parafilm stérile en préparation pour le chargement de l'aiguille. Puis, en utilisant la pompe de retrait, soigneuse au chargement de l'attention pour éviter de payer l'aiguille sabots. Placez l'aiguille chargée dans la position micromanipulateur dans la zone d'injection, en faisant attention à ne pas casser l'aiguille sur les embryons, ou la sonde d'échographie. Notez que si pour quelque raison que l'aiguille est chargé de façon significative avant l'injection est de se produire, il peut être utile de dessiner une petite quantité d'air dans la pointe, qui peut être déchargé avant de commencer les injections. Cette poche d'air peut protéger contre le stock viral séchage à la pointe de l'aiguille (un événement qui sera presque toujours rendre cette aiguille chargée inutile).
Partie 5. Échographie injection guidée virale
- L'image en temps réel créé par la sonde à ultrasons est visualisée sur le moniteur vidéo, et peut être utilisé pour guider l'aiguille microinjection dans l'embryon. L'utilisation de ce virus de système peut être injecté dans le sac amniotique à E8.5 ou soit le sac amniotique ou le système ventriculaire du E9.5-E11.5 (Figure1B). C'est la partie la plus difficile de la procédure et nécessite une quantité importante de mains sur l'expérience de maître (de l'ordre de 5-20 heures selon l'enquêteur). La pointe de l'aiguille est évident dans l'image échographique comme le point le plus lumineux sur l'écran, et devraient être vus se déplaçant en conformité avec les réglages de la position de la sonde (en utilisant les commandes motorisées dans le y et z avions, et la commande manuelle dans le X avion). Il est extrêmement important que la direction d'oscillation de la sonde soit parallèle à la longueur de l'aiguille. Ceci assurera que l'aiguille reste dans le plan de l'image lors des mouvements de le positionner à l'injection dans l'embryon.
- L'embryon doit être positionné de telle sorte que la région cible (dans ce cas le ventricule du cerveau antérieur) est facilement visible et accessible à l'aiguille avec la moindre quantité de matériel utérin dans le chemin d'injection. En outre, il est essentiel de ne pas injecter à travers le placenta. Une fois que la région du cerveau cible est aligné avec la direction de l'avancement d'aiguille (en utilisant le bouton sur le micromanipulateur), l'aiguille doit être juste toucher la paroi utérine, puis un coup court rapidement vers l'avant doit pénétrer dans le tissu. Une approche similaire est utilisé pour pénétrer le sac amniotique et le cerveau. Dans certains cas, l'enquêteur et expérimentés peuvent frapper le ventricule en un seul mouvement, surtout si l'aiguille est très forte. La mécanique du déplacement de la sonde, l'aiguille, et les embryons (en déplaçant la mère sur la scène), nécessitent des exercices pratiques à maîtriser.
- Une fois que le nombre souhaité d'embryons a été injecté, à proximité de la paroi abdominale avec 5,0 points de suture en soie. La mécanique de suture ne sont pas spécifiques à ce type de chirurgie. Enfin, l'utilisation autoclips vétérinaires à base de la peau ainsi que sur les points de suture dans le muscle abdominal. Suture de la peau n'est pas recommandée parce que la souris se mâchent sur les points de suture. L'analgésie doit être appliquée à la zone d'incision pour réduire la quantité de douleur ressentie par la souris comme il se réveille. Il est recommandé une solution de bupivacaïne 0,25% être injecté (0,8 ml / kg ou 2 mg / kg) par voie sous cutanée toutes les quelques millimètres le long du site d'incision.
- Alors que la souris récupère doucement l'animal sur un papier absorbant dans une cage propre contenant un sachet de gel (pour faciliter l'alimentation et l'hydratation). Placez la cage sur un ensemble plus chaud, à 37 ° C pour maintenir la température du corps. Lorsque réveillé, placez la souris et le sachet de gel dans une cage propre et revenir à la grille d'origine animale.
- Le jour suivant, vérifiez la souris pour tout saignement vaginal, de contractions abdominales et / ou une apparence générale en détresse, qui indiquent l'avortement. Si c'est le cas, la souris euthanasier immédiatement. Les cheveux bien coiffés et un aspect sain global indiquent récupération réussie de la chirurgie. Les embryons injectés peuvent être sacrifiés embryonnaire ou après la naissance pour une analyse ultérieure. Si le virus exprime un gène rapporteur, comme la phosphatase alcaline humaine (PLAP) ou GFP, une coloration va révéler les zones d'infection virale positive (Figure1C).
Les résultats représentatifs
Embryons injectés peuvent être sacrifiés 1-2 jours après l'injection tout le chemin jusqu'à l'âge adulte. Si le virus exprime un gène rapporteur, comme PLAP ou GFP, alors l'expression journaliste sert à identifier les cellules infectées par des virus et des clones de ces cellules. Par exemple, la figure 1C est une section de tissu d'un cerveau post-natal qui a été infecté in utero à E9.5 avec un vecteur rétroviral exprimant PLAP. Les cellules infectées sont visualisés comme des grappes pourpres après coloration histochimique. En plus d'identifier les cellules infectées par des virus, l'expression de journaliste permet d'examiner la morphologie cellulaire et de la position, ainsi que le statut d'expression génique.
nt ">
Figure 1. Injection virale dans les ventricules du cerveau antérieur E9.5 souris. A. L'animal anesthésié est placé sur la phase d'injection. Deux embryons seraient exposés et placé sous la sonde d'échographie à l'endroit indiqué (flèche). L'aiguille de microinjection rempli de virus est situé près de l'embryon et alignés avec la sonde d'échographie. Ecran B. capture d'une image échographique en temps réel à partir d'un embryon de souris E9.5. V, le ventricule, comme, sac amniotique; UW, la paroi utérine. Les embryons ont été injectés C. avec un virus exprimant au PLAP E10.5. Coloration histochimique de PLAP révèle l'emplacement des événements d'infection virale.
Discussion
Injections virale utilisant guidage échographique peut être réalisée à partir E8.5-E11.5, où seul le sac amniotique peut être injecté à E8.5, tandis que les deux le sac amniotique et le système ventriculaire peut être injecté à partir de E9.5-E11.5. Quand elle est réalisée correctement, les particules virales injectées dans le système ventriculaire à l'aide guidage échographique ont accès à des cellules tapissant le système ventriculaire et, par conséquent, peuvent infecter les différentes structures du cerveau antérieur (néocortex, noyaux gris centraux, diencéphale, yeux, etc), le mésencéphale et rhombencéphale (Figure1C). Virus injecté dans le sac amniotique a accès à des cellules à l'extérieur de l'embryon. En plus de virus, guidage échographique peut également être utilisé pour injecter des cellules dans l'embryon en développement. Par conséquent, cette technique fournit de multiples options à choisir (période de développement, la structure, les virus / cellules) lors de la conception d'une expérience.
Il est essentiel que le virus injecté ou cellules expriment un journaliste pour une identification facile des cellules infectées / injecté. Historiquement, phosphatase alcaline placentaire humaine (PLAP) ou GFP ont été utilisés. Par expérience, nous avons trouvé PLAP peut être un gène rapporteur très utile parce que les deux PLAP histochimique et la coloration immunohistochimique des rendements d'une cellule forte et distincte seule tache qui permet d'analyser la morphologie des cellules et la position, et de procéder à une analyse clonale. Depuis expression de la GFP virale peut être faible, un rapporteur GFP peut-être pas idéal pour la coloration des tissus, mais est utile si l'on veut obtenir des cellules isolées par tri cellulaire par fluorescence (FACS).
Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Micromanipulator | Narishige International | 91084361683D | |
| HI-7 pipette holder | Narishige International | 9108436141 | |
| 10 mm support arm | Carl Zeiss, Inc. | 9108436206 | |
| IP iron base plate | Carl Zeiss, Inc. | 9108436167 | |
| CI-1 connector for pipette holder | Carl Zeiss, Inc. | 9108436257 | |
| 1mm ID tubing | Carl Zeiss, Inc. | 911013 | |
| 3-way luer lock stopcock (pkg 10) | Carl Zeiss, Inc. | K420163-4503 | |
| Motor controller, 2-4 axes | Newport Corp. | 860-c2 | |
| Joystick | Newport Corp. | PMC200-J | |
| Micrometer adapter | Newport Corp. | ADAPT-BM17-375 | |
| Motorized drive | Newport Corp. | CMA-25CC | |
| Cable assembly | Newport Corp. | 860I-10 | |
| 25 mm translation stage | Newport Corp. | UMR8-25 | |
| Micrometer | Newport Corp. | BM17-25 | |
| Base plate | Newport Corp. | M-PBN8 | |
| Inner mounting bracket | Newport Corp. | EQ80-I | |
| Outer mounting bracket | Newport Corp. | EQ80-E | |
| Man. infusion/withdrawl pump | Stoelting Co. | 51222 | |
| 25 μl microsyringe | Stoelting Co. | 51113 | |
| 24"x12"x0.5" metric board plate | Edmund Scientific | NT03-640 | |
| Set of self-adjusting feet | Edmund Scientific | NT34-841 | |
| Bar-type lens holder | Edmund Scientific | NT03-669 | |
| Right angle post clamp | Edmund Scientific | NT53-357 | |
| 2" post holder | Edmund Scientific | NT03-646 | |
| 4” steel post | Edmund Scientific | NT36-499 | |
| 6” steel post | Edmund Scientific | NT36-503 | |
| 12/pk set screws, 1/4-20 x 1/2" | Edmund Scientific | NT03-644 | |
| PBS, pH7.4 | Invitrogen | 10010049 | |
| Slide warmer | Fisher Scientific | Numerous options | |
| Double Edge Razor Blades | Electron Microscopy Sciences | 72000 | |
| Borosilicate Glass O.D: 1.0mm, I.D.: 0.05mm | Sutter Instrument Co. | B100-50-10 | |
| 1cc Insulin Syringe U-100 27G5/8 | BD Biosciences | 329412 | |
| Autoclip Applier | BD Biosciences | 427630 | |
| Autoclips, 9mm (to close skin incision) | BD Biosciences | 427631 | |
| 5.0 Silk sutures | Fisher Scientific | S-1173 | |
| Sterilube ophthalmic ointment | Fera pharmaceuticals | 48102-012-35 | |
| MB-10 or equivalent disinfectant | Quip labs | ||
| 10% bleach | Multiple Suppliers | ||
"One of the following ultrasound backscatter microscopes can be used for this procedure. Although in the video the P40 from Paradigm-Medical is used, the P40 is no longer commercially available, and has been replaced by the P60, which is similarly priced and can be used for the same application. The additional materials described for stage construction are for use with Paradigm-Medical device(s). The Vevo 2100 comes with equipment for small animal imaging.
Anesthetic and Analgesic The Nembutal solution (50 mg/mL injectable sodium pentobarbital; produced by Abbott laboratories) can be obtained from Bulter Schein Animal Health. Note that this is a schedule II controlled substance and requires a Drug Enforcement Agency (DEA) license to obtain. The Bupivacaine solution (0.25%; produced by Hospira, Inc, among others) can be obtained from a number of distributors, including Moore Medical. |
|||
References
- Yee, J. K. Generation of high-titer pseudotyped retroviral vectors with very broad host range. Methods Cell Biol. 43, 99-112 (1994).
- Gaiano, N. A method for rapid gain-of-function studies in the mouse embryonic nervous system. Nat Neurosci. 2, 812-819 (1999).
