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Biology

वयस्क और भ्रूण के कंकाल की मांसपेशी Microexplant संस्कृति और कंकाल की मांसपेशी स्टेम सेल के अलगाव

Published: September 21, 2010 doi: 10.3791/2051
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1School of Biosciences, University of Birmingham

Summary

सूक्ष्म dissected explants तकनीक कंकाल की मांसपेशी स्टेम कोशिकाओं के स्रोत के रूप में, किशोर, वयस्क या भ्रूण मांसपेशियों से proliferative कंकाल की मांसपेशी कोशिकाओं को अलग करने के लिए एक मजबूत और विश्वसनीय तरीका है. विशिष्ट, इन कोशिकाओं clonally किया गया है कंकाल की मांसपेशी स्टेम सेल लाइनों vivo में प्रत्यारोपण के लिए इस्तेमाल किया उपज के लिए निकाली गई.

Abstract

संवर्धित भ्रूण और वयस्क कंकाल की मांसपेशी कोशिकाओं के विभिन्न उपयोगों के एक नंबर है. सूक्ष्म dissected explants इस अध्याय में वर्णित तकनीक proliferative कंकाल की मांसपेशी स्टेम कोशिकाओं के स्रोत के रूप में, किशोर, वयस्क या भ्रूण मांसपेशियों से कंकाल की मांसपेशी कोशिकाओं के अपेक्षाकृत बड़ी संख्या को अलग करने के लिए एक मजबूत और विश्वसनीय तरीका है. लेखकों सूक्ष्म dissected explant संस्कृतियों का इस्तेमाल किया है के लिए जंगली प्रकार और dystrophic मांसपेशियों में कंकाल की मांसपेशी कोशिकाओं के विकास विशेषताओं का विश्लेषण. ऊतक वृद्धि के घटकों में से प्रत्येक, अर्थात् सेल अस्तित्व, प्रसार, senescence और भेदभाव अलग से यहाँ वर्णित विधियों का उपयोग कर विश्लेषण किया जा सकता है. विकास के सभी घटकों के शुद्ध प्रभाव explant परिणाम की दर को मापने के माध्यम से स्थापित किया जा सकता है है. माइक्रो - explant विधि अलग मांसपेशी प्रकार और उम्र की एक विस्तृत श्रृंखला से प्राथमिक संस्कृतियों की स्थापना की और, के रूप में यहाँ वर्णित है, लेखकों द्वारा अनुकूलित किया गया है भ्रूण कंकाल की मांसपेशी व्यापारियों के अलगाव को सक्षम करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

विशिष्ट, सूक्ष्म explant संस्कृतियों के लिए निकाले जाते इस्तेमाल किया गया है clonal (एकल कक्ष मूल) कंकाल की मांसपेशी स्टेम सेल (SMSC) लाइनों और जो विस्तार vivo में प्रत्यारोपण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. Vivo प्रतिरोपित SMSC में के रूप में कार्य, ऊतक विशिष्ट, उपग्रह कोशिकाओं व्यवहार जो कंकाल की मांसपेशी फाइबर के उत्थान के लिए योगदान लेकिन जो भी undifferentiated स्टेम कोशिकाओं जो किया जा सकता है संस्कृति में फिर से पृथक सूक्ष्म explant विधि का उपयोग कर के एक छोटे से पूल के रूप में बनाए रखा जाता है (उपग्रह सेल आला में).

Protocol

दो दृष्टिकोण proliferative कंकाल की मांसपेशी कोशिकाओं को अलग करने के लिए नियोजित किया जा सकता है. पहली मांसपेशियों के ऊतकों में enzymatically एकल कक्षों बाहर 1 चढ़ाना पहले अलग पचा रहे हैं. दूसरी विधि संस्कृति में मांसपेशियों के ऊतकों के टुकड़े explant कोशिकाओं ऊष्मायन 2, 3 के दौरान विकसित करने की अनुमति है . इस प्रोटोकॉल दूसरी विधि में वर्णित है. टिशू कल्चर ही explant संस्कृति में अपनी जड़ों की है. वर्ष 2007 हैरिसन जिसमें उन्होंने लसीका के 4 बूँदें फांसी में तंत्रिका explants incubating न्यूरॉन outgrowths प्राप्त की क्लासिक प्रयोगों की 100 वीं वर्षगांठ थी. Explant संस्कृति तकनीक का इस्तेमाल किया गया है और परिष्कृत वयस्क और भ्रूण कोशिकाओं 4, 5 के proliferative प्राथमिक संस्कृतियों पैदा करने का एक साधन के रूप में अलग अलग संदर्भों की एक किस्म में आगामी 100 वर्षों में है. explant तकनीक के पीछे सिद्धांत है, तथापि, एक ही रहता है, सेल परिणाम की महत्वपूर्ण प्रारंभिक चरण के दौरान माता पिता के ऊतक के तीन आयामी संरचना को बनाए रखने, जबकि एक अमीर पोषक मीडिया के साथ कोशिकाओं outgrowing प्रदान प्राथमिक सेल अलगाव के आघात को कम से कम जो पैदा करने के लिए. कंकाल की मांसपेशी में है क्योंकि मांसपेशियों के ऊतकों को काटने का कार्य मांसपेशी फाइबर आघात, उपग्रह सेल सक्रियण, प्रवास और प्रसार 3, 6 के लिए सामान्य ट्रिगर mimics explant संस्कृति का उपयोग करने के लिए एक अतिरिक्त लाभ है. वयस्क कंकाल की मांसपेशी उपग्रह कोशिकाओं (myoblasts भी कहा जाता है) proliferative स्टेम सेल मांसपेशी फाइबर की मरम्मत और 7 विकास के लिए जिम्मेदार जनसंख्या हैं.

कंकाल की मांसपेशी explants इस प्रकार regenerating मांसपेशियों के vivo वातावरण में नकल और स्टेम सेल प्रवास और विभाजन को प्रोत्साहित. भ्रूण में, (ट्रंक और अंग की मांसपेशियों) हड्डीवाला कंकाल की मांसपेशी के बहुमत somites से निकला है, हालांकि somitomeres और ब्रान्चियल मेहराब सिर 8, 9 की मांसलता को जन्म दे. myotome दो अलग समूहों के रूप में पहचाना जा सकता है है Myf 5 व्यक्त स्टेम फर्क somite पृष्ठीय औसत दर्जे का है, और पार्श्व किनारों में स्थित है, क्रमशः कोशिकाओं. क्रमशः, इन कोशिकाओं को वापस है, जो बगल में अंतर की epaxial मांसपेशियों उत्पन्न, और उदर और पार्श्व hypaxial (अंगों, पेट, और श्वसन की मांसपेशियों) मांसलता है जो मांसपेशियों somite 10 से स्टेम कोशिकाओं के प्रवास की आवश्यकता होती है. भ्रूण पेशी स्टेम सेल प्रवास 3 11 पैक्स के नियंत्रण के अधीन है. Myf-5 अभिव्यक्ति भ्रूण मांसलता की स्थापना और इस महत्व को प्रसव के बाद मांसपेशियों के लिए बनी रहती है के लिए आवश्यक है, जहां सक्रिय उपग्रह कोशिकाओं के 98% से अधिक व्यक्त Myf-5 12 . Myf-5 इसलिए proliferating कंकाल दोनों वयस्क और भ्रूण के ऊतकों में पेशी स्टेम सेल की आबादी का एक विश्वसनीय और विशिष्ट मार्कर है. भ्रूण पेशी स्टेम कोशिकाओं (भी बुलाया मांसपेशी कोशिका progenitors, कंकाल की मांसपेशी व्यापारियों, myoblasts या यहाँ तक कि भ्रूण उपग्रह कोशिकाओं) प्रारंभिक अवस्था माउस, लड़की और मेंढक 13 भ्रूण के somites से अलग किया जा सकता है. आदेश में भ्रूण बड़े लेखकों भ्रूण के कंकाल की मांसपेशियों से myogenic संस्कृतियों को अलग करने के लिए भ्रूण के ऊतकों के लिए microdissected explant तकनीक अनुकूल है. एक समान दृष्टिकोण Cossu एट अल द्वारा प्रयोग किया जाता है 14. भ्रूण somite 14 से clonal सेल आबादी उत्पन्न.

1. कंकाल की मांसपेशी स्टेम सेल के इन विट्रो सेल संस्कृति में (SMSC)

SMSC एकल कक्ष मूल है जो clonally प्राथमिक कंकाल की मांसपेशी explant संस्कृतियों से प्राप्त किया गया है सेल लाइनों हैं. वे मानक टिशू कल्चर पद्धति का उपयोग कर यदि पर्याप्त ध्यान रखा जाता है संवर्धित किया जा सकता है है. ध्यान दें कि, जब तक अन्यथा इंगित, सभी वर्णित जोड़तोड़ सड़न रोकनेवाला शर्तों के तहत एक लामिना का प्रवाह (कक्षा 1 या कक्षा 2 बाँझ कैबिनेट) डाकू और सभी संस्कृति अभिकर्मकों का उपयोग किया जाता है का उपयोग करने से पहले डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में 37 के लिए गरम कर रहे हैं.

  1. तरल नाइट्रोजन भंडारण (विधि नीचे ठंड के लिए खंड 1.2 देखें) से SMSC लाने cryovials तेजी से thawed होना चाहिए और सामग्री 5 एमएल prewarmed में स्थानांतरित (37 डिग्री सेल्सियस) DF10 तत्काल centrifugation के लिए संस्कृति के माध्यम DMSO (3 मिनट के लिए 1,000 छ) को हटाने के लिए . पूर्व गर्म संस्कृति के माध्यम से छोटी मात्रा के अपकेंद्रित्र ट्यूब करने के लिए स्थानांतरित करने से पहले शीशी में दोहराने pipetting के माध्यम से सबसे अच्छा कोशिकाओं पिघलना विधि है. विगलन कोशिकाओं की प्रक्रिया से बाहर किया जाना चाहिए बहुत जल्दी है के बाद से cryopreserved कोशिकाओं 10% DMSO है जो कोशिकाओं (LD50 मिनट 2 लगभग) कमरे के तापमान पर विषाक्त होते.
  2. निम्नलिखित centrifugation सतह पर तैरनेवाला हटा दिया और फिर एक और 5 DF10 एमएल में निलंबित सेल गोली से कोशिकाओं को धो रहे हैं, तो के रूप में पहले से अपकेंद्रित्र.
  3. सेल गोली तो DF10 5 एमएल और जिसके परिणामस्वरूप सेल निलंबन के साथ दूसरी बार के लिए मिलाया जाता है एक छोटे से 25 सेमी 2 प्लास्टिक संस्कृति किया है के लिए स्थानांतरित कर रहा हैssel.
  4. संस्कृतियों 37 में बनाए रखा जाते हैं ° सी humidified इनक्यूबेटर में हवा में 5% सीओ 2 युक्त. जब तक जहाजों एक फ़िल्टर टोपी के साथ उपयोग किया जाता है, कुप्पी की टोपी थोड़ा कई घंटे के लिए ढीला किया जाना चाहिए संस्कृति बर्तन में हवा इनक्यूबेटर के साथ संतुलित करने के लिए और संस्कृति के माध्यम acidify की अनुमति. माध्यम के पीएच संस्कृति माध्यम में एक phenol लाल डाई पीएच सूचक को शामिल करने के माध्यम से नजर रखी है.
  5. Thawed कोशिकाओं हमेशा और ताजा DF10 मध्यम के साथ फिर से खिलाया चढ़ाना के बाद 24 घंटे नजर रखी जा करने के लिए सेल मलबे और अवशिष्ट विषाक्त पदार्थों को हटाने सुनिश्चित (नोट 1 और 2 देखें ).

1.1. Subculture

स्थापित SMSC लाइनों के लिए, जब कोशिकाओं को लगभग 95% संगम तक पहुँचने, वे अपनी संस्कृति पोत से हटाया जाना चाहिए, पतला और आगे के विकास को सक्षम करने के लिए एक ताजा बर्तन में रखा. इस subculture प्रक्रिया विभिन्न enzymatic प्रक्रियाओं के एक नंबर के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है / trypsin EDTA सबसे अक्सर इस्तेमाल किया जा रहा है (देखें नोट 3). यह सामान्य अभ्यास (और अच्छे) के घनत्व है जो उन्हें विकास के तीसरे दिन पर subcultured करने की आवश्यकता पर कोशिकाओं के विकास. प्रत्येक उपसंस्कृति में सबसे एसएमएस सेल लाइनों के लिए इस बंटवारे 1 / 10 कक्षों के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है. यह कोशिकाओं के सावधान निगरानी की अनुमति देता है और टिशू कल्चर प्रदर्शन तुरंत असामान्य वृद्धि (उदाहरण के लिए तेजी से विकास) व्यवहार जो परिवर्तन या apoptosis में कमी संस्कृति शर्तों के अनुकूलन द्वारा कारण जैसे सेल लाइन प्ररूपी परिवर्तन का संकेत मिलता है की पहचान उन सक्षम बनाता है है. इसके अतिरिक्त, एक सुसंगत और सावधान subculturing दिनचर्या बेहद इस तरह की घटनाओं की घटनाओं को कम कर देता है.

  1. Trypsin (trypsinisation) का उपयोग उपसंस्कृति लिए वाहिकाओं इनक्यूबेटर और उनकी आकांक्षा से खारिज माध्यम से हटा रहे हैं.
  2. कोशिकाओं तो बाँझ के साथ दो बार धोया कैल्शियम और मैग्नीशियम मुक्त फॉस्फेट बफर (पीबीएस) खारा, धोने प्रति 10 एमएल, आकांक्षा द्वारा हर बार हटा दिया.
  3. के करने के लिए सेल (25 मिमी 2 फ्लास्क) monolayer 1 एमएल 1 / trypsin EDTA जोड़ी जाती है और कमरे के तापमान पर 2 3 मिनट के लिए कोशिकाओं पर छोड़ दिया जब तक कोशिकाओं को अलग शुरू (नोट 4 देखें). अलग कर देना छोटे छेद थोड़ा अपारदर्शी monolayer जब फ्लास्क प्रकाश के लिए आयोजित किया जाता है (नोट 5 को देखें) में बनाने के रूप में अनुभवी उपयोगकर्ता के द्वारा देखा जा सकता है. जबकि सेल करने के लिए पर्याप्त समय एक एकल कक्ष निलंबन को सुनिश्चित करने के लिए trypsinised किया जाना चाहिए, देखभाल trypsinisation के लिए SMSC overexpose नहीं लिया होना चाहिए के बाद से यह कोशिका मृत्यु और गरीब लगाव है जब कोशिकाओं को फिर से चढ़ाया जाता है के उच्च स्तर में परिणाम होगा.
  4. 2 मात्रा (यानी दो बार trypsin समाधान की मात्रा) की एक न्यूनतम पर रोक trypsin प्रतिक्रिया, सीरम युक्त मध्यम (DF10) जोड़ा जाता है. जब एक 25 मिमी 2 फ्लास्क subculturing यह सुविधाजनक है कि इस चरण में 9 DF10 एमएल जोड़ने के लिए. कक्षों की एक 1 / 10 विभाजन तो आसानी से एक नई 25 मिमी 2 संस्कृति फ्लास्क में ताजा DF10 माध्यम से एक और 9 एमएल के साथ जिसके परिणामस्वरूप सेल निलंबन के 1 एमएल साथ गिराए द्वारा बनाया जा सकता है है. शेष कोशिकाओं सेल (एक बड़ा पोत के लिए स्थानांतरण) विस्तार, cryopreserved के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है (खंड 1.2 देखें) या प्रयोगात्मक व्यंजन, कुओं assays के प्रसार और अस्तित्व, भेदभाव, वृद्धि कारक उपचार या अन्य प्रयोजनों के लिए या प्लेटों में गिना और मढ़वाया (देखें नीचे).

1.2. सेल लाइन्स और प्राथमिक संस्कृति के cryopreservation

  1. Cryopreservation कोशिकाओं subculture के लिए उनके monolayer (धारा 3.1.1) से अलग और centrifugation (1,000 g पर 3 मिनट) द्वारा pelleted हैं.
  2. सतह पर तैरनेवाला आकांक्षा से निकाल दिया जाता है और कोशिकाओं को ध्यान से और जल्दी से कर रहे हैं मिश्रण नीचे फ्रीज के 10 एमएल (DF10 में 10% DMSO) में फिर से निलंबित कर दिया है इससे पहले कि वे centrifugation द्वारा पुनः pelleted हैं.
  3. इस समय गोली मिश्रण नीचे पर्याप्त फ्रीज में फिर से निलंबित कर दिया cryovial प्रति सेल निलंबन की 0.5 एमएल की अनुमति (देखें तालिका 1) और तुरंत 80 में रखा ° रातोंरात सी.
  4. Cryovials तरल नाइट्रोजन के लिए अगले दिन लंबी अवधि के भंडारण (नोट 6 देखें) के लिए स्थानांतरित कर रहे हैं. कोशिकाओं के विगलन के साथ के रूप में, cryopreservation की इस प्रक्रिया से बाहर किया जा तेजी से किया जाना चाहिए. जबकि DMSO ठंड के दौरान कोशिका झिल्ली के लिए सुरक्षात्मक है यह बहुत गैर ठंड तापमान पर कोशिकाओं को विषाक्त है.

1.3. सेल नंबर का निर्धारण

  1. एक एकल कक्ष निलंबन (निम्नलिखित उपसंस्कृति) के सेल एकाग्रता का निर्धारण एक NEUBAUER haemocytometer इस्तेमाल किया जा सकता है. Coverslip गिनती की सटीकता सुनिश्चित करने के लिए सुरक्षित haemocytometer आधार पर घुड़सवार होना चाहिए (नोट 7 देखें).
  2. सेल निलंबन की एक छोटी सी बूंद तो coverslip के किनारे के करीब रखा जाता है और केशिका कार्रवाई द्वारा लिया जाएगा.
  3. कोशिकाओं तो चरण विपरीत रोशनी के साथ एक औंधा माइक्रोस्कोप का उपयोग करने के लिए गिने जाते हैं. अंतिम सेल एकाग्रता, ग की सटीकता को बढ़ानेगिनती कक्ष में ells नहीं ओवरलैप करते हैं, अगर वे मूल सेल निलंबन और हो पतला चाहिए कोशिकाओं को फिर से गिना जाना चाहिए. Clumping trypsinisation के दौरान कोशिकाओं की पूरी तरह से हदबंदी से बचा जाना चाहिए और एक ज्ञात सतह क्षेत्र पर 100-200 कोशिकाओं को सेल संख्या का सही अनुमान प्राप्त करने के लिए गिना जाना चाहिए. एक सुविधाजनक पद्धति का उपयोग करके NEUBAUER haemocytometer 2 या अधिक 16 वर्ग सेट में कक्षों की गणना है. मिली लीटर प्रति सेल घनत्व तब गिना सेट की संख्या (जैसे 2) द्वारा कुल विभाजित और 4 10 से गुणा करके प्राप्त की है . उदाहरण के लिए, 100 कोशिकाओं 2 x 16 वर्ग = 100 / 2 = 5 x 10 5 कोशिकाओं / एमएल सेट पर गिना.

2. प्राथमिक कंकाल की मांसपेशी Microexplant संस्कृति की स्थापना

प्राथमिक संस्कृति माइक्रो - explant के लिए किसी भी व्यक्ति सामने की मांसपेशियों और हिंद अंग, डायाफ्राम, पीठ और पेट की मांसपेशियों सहित सुलभ कंकाल की मांसपेशी से SMSC अलग करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. किशोर और वयस्क मांसपेशियों से microexplant संस्कृतियों को पाने के लिए विधि विस्तार में स्मिथ और 3 Schofield द्वारा वर्णित है और बाद बड़े पैमाने पर इस्तेमाल किया गया है किशोर, वयस्क और वृद्ध माउस मांसपेशियों से एसएमएस कोशिकाओं प्राप्त है. विधि भी इस्तेमाल किया जा सकता सुसंस्कृत 24 मछली और मानव कंकाल की मांसपेशी (राव और स्मिथ, अप्रकाशित) से कंकाल की मांसपेशी कोशिकाओं को प्राप्त है. SMSC के एक माउस मांसपेशी microexplant से परिणाम चित्रा 1a, ख में सचित्र है. विधि भ्रूण मांसपेशी अग्रदूत साबित कोशिकाओं (धारा 3 देखें) के अलगाव के लिए संशोधित किया गया है . बुनियादी विधि इस प्रकार है:

  1. हौसले से मारी गईं माउस से लक्ष्य की मांसपेशी (ओं) की सड़न रोकनेवाला विच्छेदन बाँझ उपकरणों, एक साफ क्षेत्र में काम करने और उदार 70% इथेनॉल स्प्रे के उपयोग का उपयोग करने के लिए हासिल की है.
  2. पृथक मांसपेशियों DF20 माध्यम से दो परिवर्तन के माध्यम से धो रहे हैं और एक 60 मिमी 2 पकवान में ताजा DF20 मध्यम में रखा गया है. एक स्टीरियो विच्छेदन माइक्रोस्कोप की मांसपेशियों का प्रयोग ध्यान से बाँझ शर्तों के तहत microdissected वसा, संयोजी ऊतक और हड्डी बाहर.
  3. साफ मांसपेशियों टुकड़े तो 400 सुक्ष्ममापी 3 cubes, जो एस जौहरी संदंश का उपयोग व्यक्तिगत रूप से केंद्र में रखा जाता है एक 96 अच्छी तरह से 50 DF20 μL (नोट 8 देखें) युक्त थाली के 60 कुओं में कटौती कर रहे हैं. वेल्स खुर्दबीन के नीचे की जाँच कर रहे हैं और इनक्यूबेटर में रखा है. बाहरी कुओं खारा explants (3) से युक्त कुओं से बाहर सुखाने को रोकने के साथ भर रहे हैं.
  4. Microexplant लगाव और परिणाम के बाद 24-48 घंटे ऊष्मायन और उसके बाद 48-72 घंटे के अंतराल (संवर्धित किया जा रहा है मांसपेशियों के विकास की दर के आधार पर) पर रन है.
  5. विस्तार और एसएमएस कोशिकाओं के अलगाव के लिए, परिणाम संस्कृतियों व्यक्तिगत एक मुख्य रूप से SMSC आकारिकी, यानी उच्च refractivity जो कुल समूहों में बढ़ने (3.1B चित्र देखें) के साथ गोलाकार mononucleate कोशिकाओं के साथ कोशिकाओं के लिए निगरानी की जानी चाहिए.
  6. एक बार explant परिणाम व्यक्तिगत कुओं की स्थापना की तंग आ चुके हैं (नोट 9 को देखें) माध्यम के 50 μL वेतन वृद्धि के अलावा द्वारा जब मध्यम सेल घनत्व में वृद्धि के कारण acidifies. जब अच्छी तरह से पूर्ण और संस्कृति सेल लगभग मिला हुआ है, कुओं हर बार मध्यम के 50% के प्रतिस्थापन से तंग आ चुके हैं "कंडीशनिंग" कोशिकाओं द्वारा secreted कारकों (क्लोनिंग तहत वातानुकूलित माध्यम पर टिप्पणी देखो, 2.1 धारा) के रखरखाव सुनिश्चित करने . भेदभाव को दबाने के लिए, कैल्शियम समाप्त माध्यम में 60-70% संगम प्राथमिक explant outgrowths पर कैल्शियम समाप्त DMEM/F12 (सभी की खुराक ही रहते हैं) के लिए 3 कोशिकाओं भोजन के लिए DF20 मध्यम प्रतिस्थापन से बदल रहे हैं.
  7. Explant वातानुकूलित माध्यम संस्कृतियों से इस स्तर पर तैयार किया जा सकता है और विस्तार और प्राथमिक SMSC (क्लोनिंग विधि के लिए, खंड 2.1, चित्रा -1 सी च देखें) की क्लोनिंग के दौरान उपयोग के लिए भंडारित किया. संस्कृतियों dispase विधि (खंड 3.5 देखें) का उपयोग subcultured हैं .
  8. Clonally व्युत्पन्न SMSC इंट्रामस्क्युलर इंजेक्शन (3.1 चित्रा GK) 19 के द्वारा vivo में विश्लेषण किया जा सकता है.
  9. Karyotyping clonally व्युत्पन्न SMSC तर्ज पर किया जा सकता है द्विगुणित स्थिति की पुष्टि है (खंड 2.2, चित्रा 3.1 एल देखें) 25.
  10. इस पद्धति का संवर्धन भ्रूण मांसपेशियों (3 खंड) के लिए अनुकूलित किया जा सकता है.

2.1. Clonal व्युत्पत्ति

प्राथमिक explant myoblast संस्कृतियों (चित्रा 1a, ख) जंगली प्रकार और उत्परिवर्ती कंकाल की मांसपेशियों में विभिन्न विकास के मापदंडों के एक किस्म की स्थापना के लिए एक उपयोगी और सही उपकरण हैं . Clonal व्युत्पत्ति, एक एकल कोशिका से एक सेल लाइन के अलगाव, कंकाल की मांसपेशी स्टेम कोशिकाओं के अलगाव में एक आवश्यक कदम है और भी subclone SMSC आरएनएआई constructs या transgenes के साथ ट्रांसफ़ेक्ट लाइनों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. स्थापित SMSC और प्राथमिक explant संस्कृतियों अत्यधिक निर्भर घनत्व और "cras जाएगाज "(पकवान से अलग और मरने) अगर बाहर बहुत कम एक सेल घनत्व में चढ़ाया हुआ है क्योंकि SMSC रिलीज घुलनशील कारक हैं जो विकास और सेल अस्तित्व को बनाए रखने के लिए आवश्यक हैं. एक उच्च घनत्व संस्कृति का अनुकरण करने के लिए और के दौरान इन कारकों की आपूर्ति. क्लोनिंग की प्रक्रिया, SMSC स्वयं वातानुकूलित माध्यम क्लोन कर रहे हैं वातानुकूलित माध्यम के अलावा व्यक्ति की कोशिकाओं को एक अलग वातावरण में पैदा करने के लिए अनुमति आवश्यक हो पाया था..

  1. वातानुकूलित माध्यम proliferating 33 और 75% संगम के बीच 48 घंटे के लिए सुसंस्कृत SMSC से तैयार है.
  2. 48 घंटे के बाद मीडिया में जो इन कोशिकाओं बड़े हो रहे हैं हटा दिया जाता है और एक 0.2 सुक्ष्ममापी सिरिंज फिल्टर का उपयोग कर फ़िल्टर, इस वातानुकूलित माध्यम के बाँझपन सुनिश्चित करता है और सभी अवशिष्ट कोशिकाओं और मलबे को हटा.
  3. यह वातानुकूलित माध्यम ताजा मध्यम संस्कृति के साथ एक 1:1 के अनुपात (क्लोनिंग मध्यम; नोट 10 देखें) में मिलाया जाता है और एकल कोशिका क्लोनिंग के लिए संस्कृति मीडिया के रूप में प्रयोग किया जाता है.
  4. एकल कक्ष dilutions कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए सावधान (SMSC स्थापित) trypsinisation या dispase उपचार (प्राथमिक explant संस्कृतियों) द्वारा एक एकल कक्ष निलंबन के लिए अलग है और प्रति 100 μL क्लोनिंग मध्यम एक सेल के एक एकाग्रता को पतला कर रहे हैं.
  5. इस सेल निलंबन के 50 μL तो एक 96 अच्छी तरह से थाली के केन्द्र 60 कुओं में से प्रत्येक में चढ़ाया जा सकता है.
  6. कक्ष 37 में ऊष्मायन द्वारा संलग्न की अनुमति दी जाती है डिग्री सेल्सियस 5% में 6 घंटे और एक अच्छी तरह के लिए सीओ 2 तो ध्यान से कोशिकाओं की उपस्थिति के लिए रन बनाए. 0 या अधिक से अधिक एक सेल युक्त वेल्स इस स्तर पर रियायती हैं.
  7. एक एकल संलग्न सेल युक्त वेल्स ध्यान से नोट कर रहे हैं और इस एकल कक्ष से प्राप्त कॉलोनी ध्यान से पहले कुछ दिनों के दौरान दैनिक निगरानी है कि केवल एक कॉलोनी, एक एकल कोशिका से निकाली गई है, मौजूद है सुनिश्चित. सेल लाइनों केवल एक सेल युक्त कुओं से प्राप्त किए गए -1 सी - ए चित्रा इस तरह के एक एकल सेल व्युत्पन्न कॉलोनी के विस्तार दिखाता है..
  8. एक बार कॉलोनी 96 अच्छी तरह से थाली में संगम तक पहुँचता है, यह अच्छी तरह से एक 48 अच्छी तरह से एक थाली के रूप में subcultured किया जा सकता है.
  9. क्लोन सेल लाइनों तो ध्यान कर सकते हैं 24 में विस्तारित किया जा - और 6 अच्छी तरह प्लेटें जब तक पर्याप्त कोशिकाओं एक 25 सेमी 2 फ्लास्क में थाली करने के लिए उपलब्ध हैं.
  10. इन संस्कृतियों के कंकाल की मांसपेशी मूल Myf-5 की अभिव्यक्ति (चित्रा 1f) या अन्य MyoD और 7 पैक्स के रूप में कंकाल की मांसपेशी विशिष्ट मार्करों के द्वारा प्रदर्शन किया जा सकता है.
  11. इस स्तर पर लाइनों के आगे विस्तार से पहले नीचे जमे हुए हैं (देखें तालिका 1).

2.2. Karyotyping

Karyotyping निगरानी सेल phenotype का एक महत्वपूर्ण तरीका है. सेल लाइनों clonal व्युत्पत्ति द्वारा व्युत्पन्न करने के लिए सुनिश्चित करें कि वे सकल गुणसूत्र rearrangements जो उनके फेनोटाइप को प्रभावित कर सकता है बिना एक द्विगुणित गुणसूत्र पूरक बरकरार रखा है karyotyped होना चाहिए.

  1. Karyotyping कोशिकाओं के लिए 25 सेमी 2 संस्कृति वाहिकाओं में देर घातीय चरण (80% मिला हुआ) (2 दिनों subculturing के बाद) के लिए बड़े हो रहे हैं संस्कृति में mitotic कोशिकाओं के अनुपात को अधिकतम.
  2. पहले कोशिकाओं karyotyping चौबीस घंटे 10 एमएल ताजा संस्कृति के माध्यम से तंग आ चुके हैं. 10 मिलीग्राम / एमएल colchicine (नोट 11 देखें) का 0.2 एमएल तो कोशिकाओं जो आगे एक घंटे के लिए 37 में incubated हैं करने के लिए जोड़ा जाता है डिग्री सेल्सियस
  3. 1 घंटे बाद, कोशिकाओं कि दोनों मध्यम संस्कृति और पीबीएस washes mitotic काटा कोशिकाओं की संख्या को अधिकतम करने के लिए बनाए रखा जाता है को छोड़कर मानक trypsinisation उपसंस्कृति प्रक्रिया के अधीन हैं.
  4. dissociated कोशिकाओं को बनाए रखा, मध्यम और पीबीएस washes के 1000 ग्राम में 3 गोली कोशिकाओं मिनट और सतह पर तैरनेवाला हटा दिया है और ब्लीच में त्याग. लिए घूमती हैं
  5. सेल गोली तो ठीक 4 मिनट के लिए 0.0075 एम पोटेशियम क्लोराइड के 5 एमएल में फिर से निलंबित कर दिया, इससे पहले कि कोशिकाओं को फिर से कर रहे हैं centrifugation द्वारा pelleted.
  6. सतह पर तैरनेवाला के अधिकांश से aspirated, फिर से निलंबन के लिए ट्यूब में एक छोटी राशि (~ 5-10 μL) छोड़ने. बाज़ ट्यूब के आधार flicking तक एक सेल घोल हासिल की है के द्वारा कोशिकाओं Resuspend. कोशिकाओं तो बर्फ पर रखा जाता है और तय हौसले से बनाया लगानेवाला ठंडा (मेथनॉल: एक 3:1 अनुपात में हिमनदों एसिटिक एसिड) में निम्नानुसार: लगानेवाला के 10 एमएल धीरे कोशिकाओं का उपयोग कर एक छोटा गिलास पाश्चर विंदुक dropwise जोड़ा जाता है ( इस सेल clumping को रोकता है).
  7. कक्ष 30 मिनट के लिए बर्फ पर रखा जाता है और फिर जिसके बाद सेल गोली 0.5 एमएल ताजा लगानेवाला में फिर से निलंबित कर दिया centrifugation द्वारा pelleted.
  8. स्लाइड तैयार स्लाइड्स (खंड 3.2.2.1 को देखें) 45 ° का एक कोण पर आयोजित पर तय सेल निलंबन छोड़ने के द्वारा उत्पादित कर रहे हैं. अच्छी तरह से स्थान मेटाफ़ेज़ सुनिश्चित फैलता विंदुक कम से कम 30 सेमी के स्लाइड के ऊपर आयोजित किया जाना चाहिए.
  9. गुणसूत्रों कल्पना करने के लिए, स्लाइड्स Leishman दाग में 2 मिनट के लिए दाग रहे हैं, Gurr बफर पीएच 6.8 के तीन खंडों बस का उपयोग करने के लिए पूर्व के साथ पतला.
  10. स्लाइड्स कमरे के तापमान पर सूख रहे हैं और DePex बढ़ते मध्यम में मुहिम शुरू की.

  1. ग्लास स्लाइड्स (प्रीमियम खुर्दबीन स्लाइड, VWR इंटरनेशनल, यूके) karyotyping प्रोटोकॉल में उपयोग के लिए सल्फ्यूरिक एसिड (कांच) के एक बड़े कंटेनर में उन्हें रातोंरात रखकर तैयार कर रहे हैं.
  2. स्लाइड्स तो 8 घंटे के लिए नल का पानी चलाने के अंतर्गत रखा जाता है और कर रहे हैं तो 70% इथेनॉल में संग्रहीत जब तक की आवश्यकता है.
  3. उपयोग से पहले, स्लाइड एक और आगे 30 मिनट के लिए नल का पानी चल रहा है और हवा 1-2 एच. के लिए कमरे के तापमान पर सूखे के तहत rinsed होना चाहिए

3. भ्रूण से प्राथमिक माइक्रो explant संस्कृति की स्थापना

तीन माउस उपभेदों MDX और CAV3KO (दोनों dystrophic म्यूटेंट) के साथ इस पद्धति, जंगली प्रकार (C57BL/10) के साथ मान्य किया गया. dystrophin की कमी MDX माउस C57BL/10 में अनायास उत्पन्न, इस लाइन Bullfield प्रयोगशाला से 1991 में प्राप्त हुई थी और तब से लगातार हमारे जन्मजात 26 कॉलोनी में बनाए रखा गया है . CAV3KO dystrophic चूहों, जो caveolin-3 जीन में उत्परिवर्तन होते हैं C57BL/10 पृष्ठभूमि पर 10 पीढ़ियों के लिए इस अध्ययन में 27 इस्तेमाल किया जा रहा से पहले नस्ल थे. प्रत्येक माउस लाइन एक robustly प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम, प्रसार और अस्तित्व प्रोफ़ाइल जो भ्रूण चरण विशिष्ट है और प्रत्येक तनाव के लिए अलग था उत्पन्न. निम्नलिखित प्रोटोकॉल स्मिथ और Schofield (1994) पी.एन. 3, 21 Merrick में अनिवार्य रूप से भ्रूण के लिए अनुकूलित किया गया.

3.1. भ्रूण संग्रह

  1. प्राप्त करने के लिए भ्रूण का मंचन किया, जोड़े प्राकृतिक matings (1:1) के रूप में स्थापित कर रहे हैं और महिलाओं योनि प्लग के लिए हर सुबह की जाँच की. प्लग का पता लगाने के दिन में, भ्रूण E0.5 दिन (12 घंटे बाद निषेचन) के रूप में गिने जाते हैं.
  2. एक बार योनि प्लग पाया गया है पुरुषों पिंजरे से हटा रहे हैं भ्रूण मचान की सटीकता सुनिश्चित करने.
  3. जब वांछित भ्रूण चरण तक पहुँच जाता है (E17.5 करने के लिए E11.5) माताओं के गर्भाशय ग्रीवा के अव्यवस्था द्वारा मारे गए हैं, पेट के बाल काटे है, त्वचा और आसपास के क्षेत्रों के 70% शराब के साथ swabbed कर रहे हैं और एक क्षैतिज पेट चीरा के माध्यम से गर्भाशय निकाल दिया जाता है बाँझ विदारक उपकरणों का उपयोग किया.
  4. गर्भाशय तो प्राथमिक explant संस्कृति मध्यम (PECM) में ताजा PECM युक्त विच्छेदन के लिए पहले एक छोटा सा पकवान में रखा जा रहा से पहले एक बार धोया.
  5. E11.5 E17.5 भ्रूण को गर्भाशय से एक विदारक माइक्रोस्कोप का उपयोग विच्छेदित कर रहे हैं और पेट्री विस्तृत microdissection के लिए तत्परता में PECM युक्त व्यंजन में व्यक्तिगत रखा.

3.2. भ्रूण Microdissection

  1. व्यक्तिगत भ्रूण आगे कंकाल की मांसपेशी में अमीर क्षेत्रों (चित्रा 2a देखें) को अलग dissected हैं . हिंद और forelimbs (hypaxial कंकाल की मांसपेशियों) dissected हैं, साथ ही ऊपरी और निचले शरीर दीवार (मुख्यतः epaxial कंकाल मांसपेशियों) के रूप में. छाती की लंबाई के साथ एक चीरा है, पेट और कमर के भ्रूण के आंतरिक अंगों को हटाया जा करने की अनुमति बनाया है.
  2. भ्रूण कंकाल की मांसपेशी स्टेम कोशिकाओं (eSMSc) के लिए समृद्ध करने के लिए, सिर, रीढ़ की हड्डी और सभी आंतरिक अंगों को तो हटा रहे हैं.
  3. पुराने भ्रूण (E15.5 - E17.5 भ्रूण) में यह भी त्वचा और उपास्थि हड्डी / फिर से हटाने के लिए संस्कृतियों में मांसपेशियों की कोशिकाओं के अनुपात में वृद्धि संभव है.

3.3. भ्रूण Microexplant संस्कृति की स्थापना

  1. एक बार forelimbs, hindlimbs और ऊपरी और निचले शरीर दीवारों बाहर वे ताजा PECM में रखा जाता है dissected है और आगे के लिए बराबर आकार (~ 0.5 3 मिमी, चित्रा 2a) के ऊतकों के छोटे cubes उत्पादन microdissected .
  2. ये microexplants तो एक 96 अच्छी तरह से थाली के केन्द्र 60 कुओं (एक explant अच्छी तरह से प्रति) 50μL PECM के प्रति अच्छी तरह से युक्त में डाल रहे हैं. अच्छी तरह से प्रति 60 1 explant युक्त कुओं की एक न्यूनतम स्थापित कर रहे हैं, प्रति भ्रूण अध्ययन किया.
  3. संवर्धन भ्रूण के लिए केंद्र 60 कुओं denoting जहां explant (चित्रा 2b) से निकाली थी क्षेत्रों में subdivided किया जा सकता है . इस डिजाइन के 15 कुओं प्रत्येक युक्त, क्रमशः, forelimb, शरीर के ऊपरी हिस्से की दीवार, hindlimb और कम शरीर दीवार 21 explants अनुमति देता है.

3.4. निगरानी परिणाम

परिणाम दर भ्रूण कंकाल की मांसपेशी explants की वृद्धि दर के एक विश्वसनीय उपाय है और सावधानी से नियंत्रित यहाँ वर्णित शर्तों के तहत अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है.

  1. Explants 37 में incubated कर रहे हैं डिग्री सेल्सियस और 5% से 3 सप्ताह के लिए सीओ 2 रन बनाए और संवर्धन के 3, 7, 14 और 21 दिन पर एक औंधा माइक्रोस्कोप का उपयोग. Explants प्रत्येक अच्छी तरह से व्यक्तिगत (चित्र 3a, ई) में कोशिकाओं के संगम के स्तर के अनुसार रन बनाए हैं.
  2. संस्कृतियों की छवियों फोटोग्राफिक उदाहरण के लिए लिया जा सकता है, एक एसएलआर कैमरा खुर्दबीन और 100 एएसए (रंग) फ़ूजी या कोडक tmax (काले और सफेद) पेशेवर फिल्म (3f चित्रा) से जुड़ी का उपयोग
  3. एक कंकालमांसपेशी विशिष्ट Myf-5 के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी eSMSc के कंकाल की मांसपेशी मूल का प्रदर्शन, तनाव पर इस पद्धति का उपयोग करके अलग कक्षों की 80 95% के आधार पर हैं Myf-5 सकारात्मक इस्तेमाल किया जा सकता है. MyoD और 7 पैक्स के रूप में अन्य मार्करों भी इन सेल आबादी के कंकाल की मांसपेशी मूल को प्रदर्शित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. हालांकि इन कोशिकाओं का भ्रूण कंकाल मांसपेशियों स्टेम कोशिकाओं है यह (विशेष रूप से युवा भ्रूण के लिए) नहीं मान लिया है कि वे कंकाल की मांसपेशी मूल के सभी या वे सभी स्टेम कोशिकाओं रहे हैं कि कर सकते हैं की एक बहुत ही उच्च अनुपात होते हैं. शुद्ध स्टेम सेल आबादी को अलग करने के लिए यह आवश्यक है clonally प्राथमिक explant संस्कृतियों प्राप्त के रूप में धारा 2.1 में वर्णित है.

3.5. Subculturing प्राथमिक भ्रूणीय Explants

एक बार मिला हुआ, explant SMSC (चित्रा 3f) की morphological विशेषताओं को प्रदर्शित संस्कृतियों के रूप में निम्नानुसार 3, 21 subcultured किया जा सकता है है:

  1. संस्कृति मध्यम चयनित कुओं, फ़िल्टर का उपयोग कर एक 0.2 सुक्ष्ममापी Acrodisc R_ सिरिंज फिल्टर से निकाल दिया जाता है और वातानुकूलित माध्यम के रूप में उपयोग के लिए बनाए रखा. मध्यम 4 ° C में 1 सप्ताह के लिए भंडारित किया जा सकता है.
  2. PECM में dispase पतला 1:10 के 100 μL एक अच्छी तरह से जोड़ा जाता है और प्लेटें तो 20 मिनट के लिए 37 ° सी इनक्यूबेटर लौटे.
  3. एक विंदुक टिप तो अच्छी तरह से सतह से ढीला कोशिकाओं को धीरे से परिमार्जन करने के लिए प्रयोग किया जाता है.
  4. सेल निलंबन फिर से 3 मिनट के लिए गोली कोशिकाओं और सतह पर तैरनेवाला निकाल दिया है और त्याग के लिए 1,000 ग्राम पर centrifuged है.
  5. कक्ष वातानुकूलित मध्यम और PECM 1:1 मिश्रण के 200 μL में फिर से निलंबित कर दिया.
  6. सेल मिश्रण आगे विस्तार के लिए 48 अच्छी तरह प्लेटें को सौंप दिया है.
  7. के लिए इन विट्रो विश्लेषण कोशिकाओं में 5 x 10 3 कोशिकाओं / सेमी की एक घनत्व पर चढ़ाया जा सकता है, या तो 48 अच्छी तरह प्लेटें (प्रत्येक एक 9 मिमी 2 बाँझ कांच coverslip युक्त) में या 8-अच्छी तरह से कांच कक्ष स्लाइड्स में 2. भेदभाव विश्लेषण कोशिकाओं के लिए रातोंरात 50-60% संगम बड़े हो रहे हैं इससे पहले कि वे भेदभाव अनुमोदक माध्यम से स्थानांतरित कर रहे हैं (इन विट्रो विधि विवरण में के लिए धारा 4 देख) निर्धारण से पहले 3 दिनों के लिए,.

4. कंकाल की मांसपेशी स्टेम सेल और प्राथमिक संस्कृति के इन विट्रो विश्लेषण में

4.1. प्रकोष्ठों की तैयारी

  1. 3 3 कोशिकाओं 10 / 2 सेमी x के घनत्व पर Dispase subcultured (खंड 3.3) प्राथमिक भ्रूण explant संस्कृतियों PECM / वातानुकूलित माध्यम में 48 अच्छी तरह प्लेटों में coverslips पर चढ़ाया जाता है और संलग्न की अनुमति दी.
  2. Apoptosis और प्रसार coverslips के मूल्यांकन के लिए दो बार पीबीएस में धो रहे हैं, फिक्स्ड (खंड 4.2 देखें) 4% paraformaldehyde में पीबीएस में कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए, एक और आगे 10 मिनट पीबीएस धोने द्वारा पीछा किया.
  3. Coverslips तैयार इस तरह से 4 ° C में पीबीएस / या PBS ग्लाइसिन में 1 सप्ताह के लिए भंडारित किया जा सकता है.

4.2. Paraformaldehyde लगानेवाला की तैयारी

  1. एक धूआं हुड में, 4 ग्राम paraformaldehyde वजन (पीएफए, सिग्मा Aldrich, ब्रिटेन) और एक चुंबकीय उत्तेजक के साथ बाँझ पीबीएस के 100 एमएल के एक कांच की बोतल को जोड़ने. एक चेहरे नकाब और दस्ताने सुरक्षा के लिए पहना होना चाहिए.
  2. एक धूआं हुड में, समाधान गर्म लगातार हड़कंप मच गया जब तक एक चुंबकीय hotplate पर पाउडर घुल. यह 65 डिग्री सेल्सियस पर लगभग 5-10 मिनट लेता है देखभाल के लिए 70 से ऊपर बढ़ती तापमान को रोकने के लिए लिया जाना चाहिए डिग्री सेल्सियस, वहाँ के रूप में उच्च तापमान पर विस्फोट समाधान के एक जोखिम है.

4.3. Apoptosis और प्रसार परख

  1. फिक्स्ड coverslips (जैसा कि खंड 4.1 में तैयार) 10 μg / एमएल DAPI 3 मिनट के लिए के साथ दाग रहे हैं.
  2. Coverslips एक बार पीबीएस (5 to10 मिनट) में धो रहे हैं और vectashield की एक जगह एक गिलास स्लाइड 17, 18 पर बढ़ते मध्यम पर औंधा .
  3. coverslip के किनारों को नाखून वार्निश (नोट 12 देखें) के साथ सील कर रहे हैं.
  4. भंडारण के लिए, स्लाइड पन्नी में लिपटे रहे हैं और 20 डिग्री सेल्सियस पर रखा
  5. गिनती के लिए, स्लाइड प्रतिदीप्ति (यूवी फिल्टर) के तहत एक ईमानदार माइक्रोस्कोप पर देखा जाता है और apoptotic और mitotic कोशिकाओं के लिए एक ऐपिस graticule का उपयोग रन बनाए. बीस बेतरतीब ढंग से वितरित ग्रिड गिने जाते हैं (~ १००० कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व), और आकृति विज्ञान कोशिकाओं गैर apoptotic apoptotic, या mitotic (चित्रा 3 जी) के रूप में विशेषता है.
  6. Mitotic और apoptotic सूचकांक कुल कोशिकाओं के एक अनुपात के रूप में की गणना कर रहे हैं.

4.4. Immunohistochemistry

Coverslips पर तय कक्ष भी immunohistochemistry के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. पुनर्प्राप्ति का उपयोग प्रतिजन के लिए एक प्रेशर कुकर coverslips मजबूती कांच मानक पेपर क्लिप का उपयोग कर स्लाइड्स से जुड़ा होना चाहिए. Immunostaining proliferating कोशिकाओं की पहचान करने के लिए, Ki67 (1 / 1, 000 मन्दन) के लिए एक एंटीबॉडी का उपयोग कर, पहचान स्थापित करने के लिए, Myf-5 (1 / 1, 000 मन्दन) के लिए एक एंटीबॉडी का उपयोग कर, या जीन की अभिव्यक्ति की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है (देखेंखंड 4.5). Immunostaining तरीकों की एक संख्या है, निम्नलिखित (में वर्णित (28, 29)) लेखकों द्वारा नियमित रूप से इस्तेमाल का उपयोग कर प्राप्त किया जा सकता है:

  1. सोडियम साइट्रेट बफर पूर्व प्रेशर कुकर में गर्म. प्रतिजन पुनर्प्राप्ति के लिए, स्लाइड्स sectioned ऊतक युक्त गर्म बफर में रखा जाता है और 2 मिनट के लिए दबाव में गर्म. दबाव मजबूती प्रेशर कुकर ढक्कन लॉकिंग और वजन पर रखकर हासिल की है. एक बार 2 मिनट पुनर्प्राप्ति समय बीत गया है प्रेशर कुकर तो ध्यान से ठंडे पानी के नल चल रहे दबाव को कम करने के तहत रखा है. ऊपर उबलते बफर को रोकने के लिए, देखभाल करने के लिए ढक्कन निकाल नहीं लिया जाना चाहिए जब तक दबाव वायुमंडलीय दबाव के साथ बराबरी है. दबाव पर्याप्त है जब वजन आसानी से हटाया जा सकता है (बिना बल) और ढक्कन हटा कम है. स्लाइड्स तो बफर से हटा रहे हैं और 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पीबीएस में धोया.
  2. स्लाइड्स हैं, उन्हें 5 मिनट के लिए 3% हाइड्रोजन पेरोक्साइड नल पानी / में डुबो और फिर पीबीएस में तीन बार धोया द्वारा पूर्व अवरुद्ध + 0.05% बीच 20 (धो प्रति 10 मिनट).
  3. अवरुद्ध TNB अवरुद्ध बफर में 30 मिनट (TSA किट में आपूर्ति) कमरे के तापमान पर ऊष्मायन द्वारा हासिल की है.
  4. प्राथमिक एंटीबॉडी TNB बफर में उपयुक्त कमजोर पड़ने (अनुमापन द्वारा पर पहुंचे, नोट 12 देखें) से पतला है और 4 में रात भर incubated डिग्री सेल्सियस (या वैकल्पिक रूप से कमरे के तापमान पर 1 से 2 घंटे).
  5. पीबीएस में तीन 10 मिनट washes + 0.05% बीच 20 के बाद, स्लाइड उपयुक्त biotinylated दूसरा TNB बफर में पतला एंटीबॉडी में 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर incubated हैं.
  6. एक और आगे पीबीएस में तीन 10 मिनट washes + 0.05% 20 बीच के बाद, स्लाइड streptavidin-एचआरपी में 30 मिनट (TSA किट में प्रदान) TNB बफर में 1:100 पतला के लिए incubated हैं और फिर तीन बार धोया (10 मिनट प्रत्येक) में पीबीएस + 0.05% बीच 20.
  7. Biotinyl tyramide (प्रवर्धन अभिकर्मक, TSA किट) तो (सटीक समय अनुकूलन प्रयोगों के द्वारा प्राप्त किया जाना चाहिए) के बीच 8 और 15 मिनट के लिए प्रत्येक अनुभाग के लिए जोड़ा है.
  8. निम्नलिखित प्रवर्धन, धोने में तीन बार (10 मिनट पीबीएस में प्रत्येक) + 0.05% 20 बीच और तब एसए एचआरपी में 30 मिनट के लिए सेते स्लाइड.
  9. तीन आगे washes (10 मिनट प्रत्येक) + पीबीएस में 0.05% बीच 20 के बाद, 3,3 का उपयोग करते हुए कल्पना _-5 से 10 मिनट के लिए diaminobenzidine tetrahydrochloride chromogen (थपका). फिर बाहर haematoxylin में स्लाइड्स counterstaining और coverslipping से पहले पानी में दो अंतिम washes ले. थपका एक ज्ञात कैसरजन है और देखभाल के साथ संभाला होना चाहिए (के रूप में Colchicine, खंड 3.2.2 के लिए).

4.5. भेदभाव

  1. Coverslips या कक्ष स्लाइड्स पर चढ़ाया (नोट 13 देखें) SMSC myotube विश्लेषण के लिए निर्धारण से पहले भी भेदभाव किया जा सकता है.
  2. इन प्रयोगों के लिए कोशिकाओं को 4 सेमी 10 / 2 के घनत्व पर चढ़ाया जाता है और एच. 6 से 8 के लिए संलग्न करने की अनुमति दी
  3. कक्ष फिर 3 दिनों (नोट 14 देखें) के लिए भेदभाव अनुमोदक शर्तों के में बंद कर रहे हैं .
  4. भेदभाव मध्यम DMEM से बना है + 0.5% है FCS 2% घोड़े सीरम और 1% glutamine के साथ पूरक. यह भेदभाव अनुमोदक संस्कृति के माध्यम के 48 घंटे के अंतराल पर बदल दिया है.
  5. Coverslips तो ऊपर (धारा 3.4.1 और 3.4.2) के रूप में 4% paraformaldehyde में तय कर रहे हैं.

4.6. SMSC का अभिकर्मक: transgenes और shRNAi constructs की अभिव्यक्ति

स्टेम कोशिकाओं और प्राथमिक संस्कृतियों अभिकर्मक के लिए आग रोक रहे हैं और तरीकों के बहुमत के साथ SMSC और प्राथमिक कंकाल की मांसपेशी कोशिकाओं में अभिकर्मक की दर बहुत कम (<10%) है, क्षणिक अभिकर्मक तरीकों के उपयोग को रोकने. यह हमारी प्रयोगशाला में मानक अभ्यास किया गया है clonal derivates transgene ट्रांसफ़ेक्ट (खंड 3.2.1 देखें) कैल्शियम फॉस्फेट या lipofectamine साथ निम्नलिखित अभिकर्मक संस्कृतियों से अलग इस पर काबू पाने के लिए . वैकल्पिक रूप से कोशिकाओं को कुशलतापूर्वक virally पैक constructs के संक्रमण का उपयोग ट्रांसफ़ेक्ट कर सकते हैं. चित्रा 1m PD50A, एक clonal SMSC pIRV, एक प्रतिकृति के साथ G418 चयन निम्नलिखित संक्रमण के तहत पृथक व्युत्पन्न में β-galactosidase के स्थिर अभिव्यक्ति से पता चलता है neo/G418 प्रतिरोध और β galactosidase (19) के लिए दोषपूर्ण जीन ले जाने retrovirus. यह सेल लाइन के लिए औपचारिक रूप से दिखाना है कि SMSC vivo में कार्यात्मक स्टेम कोशिकाओं के रूप में व्यवहार करते हैं (देखें चित्र 3.1) के लिए इस्तेमाल किया गया था. जबकि एक स्थिर clonal सेल लाइन एक मार्कर जीन व्यक्त की पीढ़ी के लिए vivo में स्टेम सेल प्रत्यारोपण के प्रयोगों में वांछनीय है, यह इन विट्रो में जीन समारोह का विश्लेषण का एक और समय लेने वाली और असंतोषजनक विधि है. इन कारणों के लिए लेखकों को हाल ही में Lipofectamine 2000 अभिकर्मक अभिकर्मक है जो 60 से 70% के अभिकर्मक दर देने में सक्षम है के एक अनुकूलित संशोधन विकसित किया है. यह जीन समारोह का विश्लेषण transgenes या आरएनएआई के क्षणिक अभिकर्मक का उपयोग की अनुमति देता है एस.एम. में constructsएससी या प्राथमिक explant संस्कृतियों (चित्रा 3h, मैं). लेखक एक छोटी सड़क के ढालवाँ आरएनएआई वेक्टर (pSHAG आरएनएआई) (30) का उपयोग करने के लिए shRNAi SMSC में mRNA अभिव्यक्ति की विशिष्ट जीन लक्ष्यीकरण के सक्षम constructs उत्पन्न. shRNAi तकनीक की सफलता के दो तत्वों पर निर्भर करता है: (क) एक कुशल अभिकर्मक विधि और (ख) एक छोटी सड़क के ढालवाँ अनुक्रम है जो विशेष रूप से लक्ष्य जीन की पहचान की डिजाइन. एक shRNAi EGFP आरएनएआई पछाड़ना विधि (3J चित्रा, मीटर) को मान्य करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है निर्देशित निर्माण.

4.7. Optimised LipofectamineTM 2000 SMSC के लिए अभिकर्मक प्रोटोकॉल

  1. कक्ष 5 से 10 4 कोशिकाओं / चैम्बर स्लाइड्स में 250 μL DF10 संस्कृति माध्यम में 2 सेमी में चढ़ाया जाता है और 18 घंटे के लिए सुसंस्कृत के लिए 95% संगम (प्रत्येक कोशिका लाइन के लिए इष्टतम संगम अलग घनत्व पर अभिकर्मक दरों का आकलन करके स्थापित किया गया था) तक पहुँचने.
  2. प्रत्येक अच्छी तरह से, डीएनए (shRNAi वैक्टर, transgenes) के 0.5 μg सीरम मुक्त DMEM के 33 μL 2 मिमी glutamine के साथ पूरक है और एक बाँझ Eppendorf ट्यूब में धीरे मिश्रित जोड़ा जाता है.
  3. प्रत्येक अच्छी तरह के लिए, 2000 Lipofectamine के 1.25 μL सीरम मुक्त मध्यम DMEM glutamine + की एक और आगे 33 μL में अलग पतला है, धीरे मिश्रित और 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर बनाए रखा
  4. डीएनए और lipofectamine घोला जा सकता है तो तेजी से एक साथ जोड़ा, 60 एस के लिए धीरे pipetting द्वारा मिश्रित और फिर 19 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर incubated डीएनए Lipofectamine 2000 परिसरों फार्म करने के लिए अनुमति देते हैं.
  5. अभिकर्मक के लिए, जटिल मिश्रण के 66 μL प्रत्येक कक्ष से जोड़ा जाता है और अच्छी तरह से स्लाइड्स धीरे 10 के लिए एस हिल परिसरों का समान वितरण सुनिश्चित करने के.
  6. कक्ष 24 से 72 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 में incubated हैं . 8 और 24 घंटे पोस्ट - अभिकर्मक के बीच निर्माण, कार्यात्मक जीन की अभिव्यक्ति या shRNAi पछाड़ना के आधार पर पहली बार पता चला है.

5. प्रतिनिधि परिणाम

जब explants ध्यान वयस्क कंकाल की मांसपेशी या भ्रूण से explanted हैं explants ऊष्मायन के 72 घंटे के के लिए कुछ ही घंटों के भीतर 37 डिग्री सेल्सियस (5% सीओ 2 / हवा) (चित्रा 3A). कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए शुरू हो जाएगा यह घटित करने के लिए समय लिया explants के स्रोत पर निर्भर करता है: भ्रूण explants अधिक पुराने वयस्क कंकाल मांसपेशियों explants की तुलना में जल्दी से विकसित हो जाना होगा. हमारे अनुभव में परिणाम के समय अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है 3, 29. सेल की आबादी का विस्तार (भ्रूण explants) दिन या सप्ताह (बड़े कंकाल मांसपेशियों explants) की अवधि खत्म हो करने के लिए उच्च घनत्व कुल एसएमएस सेल संस्कृतियों प्राथमिक उत्पन्न (इन संस्कृतियों के उदाहरण के लिए 3B एफ चित्रा देखें). 1 और 3 आंकड़े सफल और कंकाल की मांसपेशी और भ्रूण explants, clonal व्युत्पत्ति और कंकाल व्युत्पन्न वयस्क स्टेम सेल, β-galactosidase लेबलिंग, karyotyping और immunohistochemistry myf 5 भ्रूण SMSC के कंकाल की मांसपेशी के मूल वर्णन की मांसपेशी के vivo में प्रत्यारोपण की व्युत्पत्ति संस्कृति के प्रतिनिधि परिणाम दिखाने भ्रूण मांसपेशियों प्राथमिक कोशिकाओं की आकारिकी, सेल apoptosis और shRNAi अभिकर्मक प्रोटोकॉल के लिए DAPI धुंधला चित्रा 3 आबादी परिणाम स्कोरिंग के एक प्रतिनिधि के परिणाम (Myf-5 immunohistochemistry का उपयोग करने के लिए SMSC कल्पना) से पता चलता है. इन दोनों आंकड़ों से संबंधित आंकड़ा किंवदंतियों में अधिक जानकारी पाया जा सकता है चित्रा 2 से भ्रूण कंकाल की मांसपेशी स्टेम कोशिकाओं की समृद्ध आबादी उत्पन्न भ्रूण विच्छेदन सूक्ष्म से प्रक्रिया दिखाता है .

तालिका 1: गणना तालिका प्रोटोकॉल नीचे सेल फ्रीज के दौरान अधिकतम सेल व्यवहार्यता के लिए आवश्यक cryovials की संख्या का अनुमान

प्लेट / फ्लास्क / चैम्बर स्लाइड संस्कृति माध्यम के वॉल्यूम पीबीएस washes Trypsin की मात्रा फ्रीज की शीशियों के नीचे संख्या (3.1.2 )
96 अच्छी तरह से 50 μL 2 एक्स 100 μL 25 μL N / A
48 अच्छी तरह से 150 μL 2 एक्स 200 μL 50 μL N / A
24 अच्छी तरह से 500 μL 2 एक्स 700 μL 200 μL N / A
6 अच्छी तरह से 3 MLS 2 एक्स 3 MLS 500 μL 1
छोटा (25 2 सेमी) 10 MLS 2 एक्स 10 MLS 1 एमएल 2
मध्यम (80 2 सेमी) 10 MLS 2 एक्स 10 MLS 3 MLS 4
बड़े (2 सेमी 175) 10 MLS 2 एक्स 10 MLS 5 MLS </ P> 8
अच्छी तरह से चैंबर 500 μL 2 एक्स 500 μL 100 μL N / A

N / A = नहीं लागू, कक्ष संख्या भी कम करने के लिए नीचे स्थिर थे जब तक कई कुओं नीचे एक साथ जमे हुए थे.

चित्रा 1
चित्रा 1. Microexplants से कंकाल की मांसपेशी स्टेम कोशिकाओं (SMSC) के अलगाव: (ए) explanted वयस्क कंकाल की मांसपेशी (2 दिन) से प्रारंभिक परिणाम (बी) स्थापित explant परिणाम एकत्रित संस्कृतियों और उच्च घनत्व सेल दिखा. SMSC के clonal व्युत्पत्ति (सी) एकल कोशिका एक 96 अच्छी तरह से थाली में (डी) एकल कक्ष मूल के कॉलोनी (ई) clonal आबादी की स्थापना की. SMSC Myf-5 immunohistochemistry का उपयोग पहचान के सत्यापन (एफ) पृथक. . SMSC क्लोन (β-galactosidase व्यक्त) के 3 महीने में मेजबान चूहों में PD50A (जी) और (HJ) से प्राप्त कोशिकाओं के रूप में 14 महीने के बाद 2,000 माउस tibialis पूर्वकाल मांसपेशी. में PD50A कोशिकाओं के इंजेक्शन (G) हाल ही में तीन इनकार (केन्द्र स्थित नाभिक ) मांसपेशी फाइबर में β-galactosidase पॉजिटिव कोशिकाओं (नीला दाग) (अनुदैर्ध्य अनुभाग) (एच) का व्यापक योगदान β-galactosidase मांसपेशी फाइबर में सकारात्मक (भूरे रंग के दाग, विरोधी β galactosidase एंटीबॉडी के द्वारा पाया) कोशिकाओं (अनुप्रस्थ अनुभाग. ) (मैं). β Galactosidase - उपग्रह सकारात्मक (भूरे रंग के दाग, विरोधी β galactosidase एंटीबॉडी के द्वारा पाया) सेल (जे) माध्यमिक एंटीबॉडी (नहीं धुंधला हो जाना) नियंत्रण (कश्मीर). β-Galactosidase पॉजिटिव कोशिकाओं (नीला दाग) संस्कृति में पैदा जब इंजेक्शन मेजबान की मांसपेशियों से अलग 12 महीनों के बाद इंजेक्शन (एल) एक माउस clonal SMSC (DMN8) लाइन सामान्य द्विगुणित के पूरक हैं. गुणसूत्र (एम) Histochemistry PD50A कोशिकाओं की एक कॉलोनी में β-galactosidase अभिव्यक्ति दिखा दिखा के Karyotype ( चित्रा 3.1 छ, कश्मीर, AACR प्रेस, स्मिथ और Schofield, 1997) से अनुमति के साथ reproduced .

चित्रा 2
चित्रा 2. (क) भ्रूण विच्छेदन की प्रक्रिया का चित्रण है . आंकड़ा एक E15.5 भ्रूण जहां मौलिक हड्डी (उपास्थि) और आसानी से पहचान सकता है आसपास के कंकाल की मांसपेशी ऊतक के मुक्त dissected का प्रतिनिधित्व करता है. इस स्तर पर, और बाद में मंच भ्रूण में (E17.5 E15.5), dermis भी कंकाल की मांसपेशी प्राप्त कोशिकाओं के अनुपात को अधिकतम करने के हटा दिया गया था. (बी) प्राथमिक explant संस्कृतियों की एक 96 अच्छी तरह से थाली में सेटअप. प्रत्येक भ्रूण के लिए एक प्लेट के रूप में ऊपर देखा उत्पादन के लिए इस्तेमाल किया गया था. हमेशा की तरह अभ्यास थाली करने के लिए तीन अलग भ्रूण (तीन प्लेटें = 180 कुओं) replicates परिणाम दरों की स्थापना.

चित्रा 3
चित्रा 3. भ्रूण प्राथमिक explant संस्कृतियों संस्कृति के 3, 7, 14 और 21 दिनों में रन बनाए थे और संगम स्तर का एक परिणाम स्तर के प्रतिनिधि को सौंपा. 15 24% (+);; 25 49% (+), 50 74% (++); 75 100% ((एई) C57BL10 E15.5 प्राथमिक भ्रूण explant संस्कृतियों Myf-5 के साथ दाग 0 14 (%) वर्णन + + +) संगम के स्तर. डेटा collating के परिणाम के प्रत्येक स्तर स्कोरिंग के प्रत्येक दिन पर दिखा कुओं के अनुपात से पहले एक मनमाना संख्या (, (+) = 2; + = 3 + = 4 और + + + 5 = = 1) से गुणा किया गया था अंतिम परिणाम मान दे. जंगली प्रकार (C57BL/10) प्राथमिक eSMSc के लगभग 85% कंकाल की मांसपेशी सेल मार्कर Myf 5 के लिए दाग. आवर्धन 10 (एफ) स्थापित भ्रूण संस्कृतियों वयस्क SMSC, द्विध्रुवी कोशिकाओं (छोटे तीर) और गोलाकार monomorphic कोशिकाओं (बड़े तीर) के morphological विशेषताओं (G) apoptotic नाभिक fragmenting DAPI धुंधला का उपयोग कर की पहचान है. (HI) के उच्च स्तर है. (~ 75%) एसएमएस सेल लाइनों का उपयोग कर अनुकूलित Lipofectamine 2000 अभिकर्मक विधि (आई) कुल सेल संख्या की गिनती में एक निर्माण GFP-व्यक्त अभिकर्मक के DAPI counterstain द्वारा सहायता प्राप्त है. PSHAGshRNAigfp (जेएम) का उपयोग आरएनएआई (निर्माण किसी नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया इस का एक उदाहरण के लिए (29 देख)) SMSC में GFP अभिव्यक्ति abolishes. (जम्मू) नियंत्रण (नकली अभिकर्मक) एक GFP SMSC लाइन में GFP अभिव्यक्ति दिखा ( कश्मीर) DAPI नियंत्रण (एल) shRNAiGfp के अभिकर्मक के बाद 24 घंटे (एम). DAPI shRNAiGfp ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं के लिए नियंत्रण में (एल) .

चित्रा 4
चित्रा 4. Dystrophic, भ्रूण Myf5 पॉजिटिव myoblast hyperproliferative और apoptosis के लिए प्रवण हैं. (ए) भ्रूण myoblasts की मांसपेशियों explant संस्कृति से परिणाम की दर मैंदोनों E11.5 से MDX म्यूटेंट और CAV-3 E15.5 और E17.5 पर (-/-) म्यूटेंट में वृद्धि हुई है जब समानांतर में सुसंस्कृत WT explants के साथ तुलना में (बी) एक explant Myf5 - immunostained. ( सी) E15.5 से E11.5 से MDX म्यूटेंट और (-/-) CAV-3 म्यूटेंट में भ्रूण myoblasts, के रूप में Ki67 पॉजिटिव immunoreactivity (डी) के द्वारा निर्धारित की Hyperproliferation (ई) MDX भ्रूण में E11.5 से ऊंचा apoptosis और (-/-) CAV-3 भ्रूण में E15.5 DAPI धुंधला (एफ) द्वारा दिखाया के रूप में से एफ अंक में तीर apoptotic सेल करने के लिए. * पी <0.05 WT के साथ तुलना में, ** पी <0.01 WT के साथ तुलना में, * <0.05 जब CAV-3 (-/-) (जी, एच) के साथ MDX तुलना E15.5 प्राथमिक Myf5 धुंधला के साथ सुसंस्कृत WT भ्रूण myoblasts p (जी) और एक दूसरे प्रतिरक्षी नियंत्रण (एच) (मैं). E11.5 WT explants के परिणाम की दर (पी * <0.05) E11.5 MDX मध्यम explant वातानुकूलित (मुख्यमंत्री) में वृद्धि हुई है, लेकिन नहीं CAV -3 में (-/-) या WT मुख्यमंत्री. त्रुटि बार्स का संकेत मिलता है एसडी यह आंकड़ा लेखकों कॉपीराइट के अधीन reproduced है और पहले Merrick एट अल, 2009 में जीव की कंपनी द्वारा प्रकाशित किया गया था.

6. नोट: महत्वपूर्ण कदम है और संभव संशोधनों

  1. जब thawed कोशिकाओं को बहुत कम घनत्व सेल में संलग्न है केवल आधा माध्यम संस्कृति दुर्घटना को रोकने की जगह यह समझदारी है.
  2. Dystrophic पेशी से अलग SMSC apoptosis के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं और विशेष देखभाल के साथ इलाज किया जाना चाहिए है. Dystrophic SMSC (जैसे dfd-13 सेल लाइन है, जो कंकाल की मांसपेशी से प्राप्त 5 सप्ताह पुरानी (MDX) dystrophic चूहों से स्थापित किया गया था के रूप में) myoblasts के लिए सामान्य से अधिक उच्च घनत्व सेल को विकसित किया जाना चाहिए. इस तरह apoptosis के प्रति संवेदनशील सेल लाइनों को भी उच्च घनत्व (धारा 1.1 और 1.2 देखें) (19) पर cryopreserved हैं.
  3. एक monolayer से कोशिकाओं को हटाने की एक वैकल्पिक विधि dispase, जो लाभ है कि यह FCS और कैल्शियम (DF10 में दोनों वर्तमान) की उपस्थिति में किया जा सकता है के साथ सेल हदबंदी के एक gentler विधि प्रदान करता है, का इस्तेमाल करता. Dispase इसलिए subculture के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और प्राथमिक कंकाल की मांसपेशी explant संस्कृतियों और earlystage SMSC क्लोन (धारा 2 और 3 देखें) का विस्तार.
  4. बड़ा बोतल के लिए trypsin / EDTA प्रयोग किया जाता की मात्रा को बढ़ाया जाना चाहिए इस प्रकार है: 75 मिमी 2 (3 एमएल trypsin) फ्लास्क और 175 मिमी 2 फ्लास्क (5 एमएल trypsin) . इसी तरह छोटे सतह क्षेत्रों के लिए trypsin की राशि इस्तेमाल किया (देखें तालिका 1) कम.
  5. वैकल्पिक रूप से, पृथक्करण एक औंधा माइक्रोस्कोप का उपयोग करते हुए नजर रखी जा सकता है, यह beginners के लिए सिफारिश की है.
  6. सेल लाइनों के cryopreservation आमतौर पर बाहर मिला बड़े (175 मिमी 2) प्लास्टिक पोत का उपयोग किया जाता है . Cryovials 7 और 9 के बीच ऐसे ही एक बड़े जहाज से प्राप्त किया जा सकता है सेल लाइन cryopreserved जा रहा है के अस्तित्व प्रोफ़ाइल पर निर्भर करता है. प्राथमिक संस्कृतियों और नव स्थापित सेल लाइनों अक्सर बहुत नीचे प्रक्रियाओं फ्रीज दुर्दम्य हैं. वसूली और नीचे ऐसी कोशिकाओं दो दृष्टिकोण इस्तेमाल किया जा सकता है (या अलग संयोजन में) को ठंड की सफलता में सुधार करने के लिए. (ए) मिश्रण नीचे फ्रीज के FCS सामग्री 10% (50% की एक अधिकतम करने के लिए) से बढ़ाया जा सकता है. (बी) प्रक्रिया नीचे फ्रीज N2 भाप चरण में cryovials तरल चरण के लिए शीशियों स्थानांतरित करने से पहले 12-24 घंटे के लिए रखकर धीमा हो सकता है.
  7. Haemacytometer coverslip की फर्म लगाव की जांच के लिए एक सुविधाजनक तरीका coverslip पर या वैकल्पिक रूप से न्यूटन (गिलास में इंद्रधनुष प्रतिबिंब) अंगूठियां, एक खुले हाथ पर haemacytometer उल्टा पकड़ के लिए लग रही है.
  8. Explant विधि का एक भिन्नरूप immunohistochemistry प्रसार, या apoptosis assays में उपयोग के लिए अल्पकालिक संस्कृतियों के लिए नियोजित किया जा सकता है. Microdissected explants 8 अच्छी तरह चैम्बर स्लाइड्स का उपयोग करते हुए कांच पर रखा जाता है. एक वैकल्पिक तरीका 9 मिमी 2 24 अच्छी तरह प्लेटें में रखा coverslips का उपयोग करने के लिए है. दोनों ही मामलों में दो explants 150 μL DF20 मध्यम में एक अच्छी तरह से स्थानांतरित कर रहे हैं. वैकल्पिक रूप से, प्राथमिक संस्कृतियों dispase विधि द्वारा subcultured हो सकता है और 24 अच्छी तरह प्लेटें में रखा coverslips पर बाहर या सीधे 8 अच्छी तरह चैम्बर स्लाइड्स में चढ़ाया.
  9. 60 प्रति 1 explant युक्त कुओं की एक न्यूनतम परिणाम दरों के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए अच्छी तरह से स्थापित कर रहे हैं, मांसपेशियों / माउस तनाव के प्रति. एक तनाव कम से कम तीन अलग जानवरों का इस्तेमाल किया जाना चाहिए के लिए वृद्धि पैरामीटर की स्थापना. प्लेट्स और व्यक्तिगत कुओं जबकि परिणाम रन किया जा रहा है नहीं खिलाया जाता है.
  10. क्लोनिंग स्थापित SMSC लाइनों के लिए यह संस्कृति वातानुकूलित मध्यम और मध्यम DF10 के एक 1:1 मिश्रण में एकल कक्षों के लिए पर्याप्त है. प्राथमिक explants के लिए यह आवश्यक है करने के लिए 20% करने के लिए मध्यम संस्कृति के सीरम सामग्री में वृद्धि.
  11. Colchicine बेहद जहरीला है और एक ज्ञात कैसरजन है और उचित देखभाल के साथ संभाला जाना चाहिए है. डबल gloving और एक नामित ट्रे की सीमीत में काम करना आवश्यक है. सभी disposables (यानी Gilson) युक्तियाँ ब्लीच की एक बीकर में रखा जाता है (5% सोडियम hypochlorite) पानी की प्रचुर मात्रा में दिन follo विंग के साथ निपटान से पहले रात भर.
  12. वर्तमान में हम प्राथमिक Ki67 और Myf-5 विशिष्ट एंटीबॉडी 1 / 1, 000 कमजोर पड़ने पर प्रत्येक का उपयोग करें. प्राथमिक एंटीबॉडी के लिए इष्टतम कमजोर पड़ने empirically प्रत्येक के लिए इस्तेमाल किया और एक ही एंटीबॉडी के विभिन्न बैचों के लिए आदर्श भी एंटीबॉडी के लिए स्थापित किया, तब भी जब एक ही स्रोत से प्राप्त की जरूरत है.
  13. चैंबर स्लाइड्स भी इस परख के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. पीएफए ​​में 4% कोशिकाओं फिक्सिंग के पहले, संस्कृति के माध्यम निकाल दिया है और कोशिकाओं को 37 ◦ सी बाँझ पीबीएस के साथ दो बार धोया. अच्छी तरह से कक्षों, गैस्केट और गोंद को हटा रहे हैं गिलास एक 50 एमएल कांच Coplin कमरे के तापमान है, जो फिर धीरे से 25 मिनट के लिए एक Gyro घुमाव R_ हिलनेवाला पर हिल हौसले से तैयार 4% paraformaldehyde युक्त जार में रखा स्लाइड. स्लाइड्स तो में पीबीएस दो बार धोया (कमरे के तापमान) और या तो तुरंत इस्तेमाल किया या 4 में पीबीएस में संग्रहीत ◦ सी (अल्पावधि, 1-2 सप्ताह) immunohistochemical विश्लेषण (आईएचसी) के लिए.
  14. यदि अधिक व्यापक myotube गठन की आवश्यकता है 8 दिनों के लिए प्राथमिक कंकाल की मांसपेशी कोशिकाओं विभेदित किया जा सकता है.

Discussion

Microdissected explant संस्कृतियों मज़बूती और reproducibly proliferative Myf-5 सकारात्मक कंकाल की मांसपेशी स्टेम कोशिकाओं (SMSC) की एक बहुत ही उच्च अनुपात (~ 85%) से युक्त सेल आबादी को अलग करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. यहाँ वर्णित कड़ाई से नियंत्रित संस्कृति शर्तों के तहत प्राथमिक explant संस्कृतियों के लिए आनुवंशिक उत्परिवर्ती माउस SMSC के विकास व्यवहार की विशेषताएँ और भेदभाव प्रक्रियाओं के इन विट्रो विश्लेषण में विस्तृत लिए myotubes पैदा करने का एक साधन के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है इस्तेमाल किया जा सकता है. संभल के रखरखाव और इन संस्कृतियों के हेरफेर लंबी अवधि संस्कृति और विस्तार के लिए सक्षम बनाता है. यहाँ वर्णित विधियों का प्रयोग यह भी संभव है करने के लिए एकल कक्ष के कमजोर पड़ने के माध्यम से क्लोनल कंकाल explant संस्कृतियों से पेशी स्टेम सेल लाइनों प्राप्त. क्लोनिंग प्रक्रिया के दौरान अलग एकल कक्षों के प्रसार, "वातानुकूलित मध्यम" उच्च घनत्व संस्कृति के लिए इन कोशिकाओं की सामान्य आवश्यकता की नकल करने के लिए प्रयोग किया जाता है को प्राप्त करने. विधि भ्रूण, वयस्क और वृद्ध वयस्क ऊतकों को लागू (संशोधन के साथ) है और माउस के लिए इसके अलावा में सहित अन्य प्रजातियों के कंकाल की मांसपेशियों से कोशिकाओं मानव (राव और स्मिथ, अप्रकाशित), लड़की भ्रूण और मछली को अलग करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ( ) सामन 24. Clonally व्युत्पन्न SMSC इंट्रामस्क्युलर प्रत्यारोपण द्वारा vivo में विश्लेषण किया जा सकता है है और इन शर्तों के तहत इंजेक्शन SMSC मेजबान myotubes के साथ गठबंधन करने के लिए संकर मांसपेशी फाइबर के रूप में होगा. Intramuscularly अंतःक्षिप्त SMSC ट्यूमर फार्म नहीं है और इंजेक्शन के बाद एक वर्ष से अधिक उपग्रह सेल की स्थिति में मेजबान की मांसपेशियों में पाया गया है, सुझाव है कि वे उपग्रह स्टेम सेल niche.These कोशिकाओं द्वारा अंतर्जात नियंत्रण के अधीन हैं किया जा सकता है फिर इंजेक्शन से अलग मेजबान 19 इंजेक्शन के बाद 12 महीने से अधिक proliferative SMSC के रूप में मेजबान.

Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

हम पैट्रिक Paddison shRNAi शटल सदिश के अपने उपहार के लिए धन्यवाद. एंजेला स्लोअन चित्रा 3 में GFP आरएनएआई छवि उत्पन्न. हम भी उनके समर्थन के लिए निम्नलिखित शरीर धन धन्यवाद:
पेशी Dystrophy अभियान अनुदान संख्या RA2/592/2, अनुदान 02BHM04 संख्या, रॉयल सोसाइटी अनुदान संख्या 574006.G503/1948./JE और बीबीएसआरसी अनुदान संख्या 6/SAG10077 स्पार्क्स.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM/F12 1:1 mix Sigma-Aldrich Liquid medium: (Dulbecco’s Modified Eagles’s medium and Ham’s F12 medium, 1:1 v/v)
100× Glutamine (200mM) Sigma-Aldrich Diluted in medium to a 1× concentration of 2 mM (Glutamine HYBRI-MAX R)
Fetal calf serum (FCS) From a number of different companies Batch tested on primary cultures and skeletal muscle cell lines. 10-20% supplement to liquid media
Heraeus Labofuge 300 Heraeus Instruments Lab centrifuge capable of reaching 1,000 rpm
15 ml Falcon centrifuge tubes Fisher Scientific Must fit lab centrifuge
Tissue culture plasticware (25, 75 or 175 mm2 tissue culture vessels; 96-well tissue culture plates. 60 mm Petri dishes). Nalge Nunc international
Humidified CO2 incubator (Heraeus) Heraeus Instruments Ours is copper lined, recommended for reducing contamination
Sterile hood with laminar air flow (Heraeus) Heraeus Instruments Ours is a Class II hood – suitable for use with Human tissues
Water Bath Grant Equipment Maintained always at 37°C
Inverted microscope Leica Microsystems
70% Ethanol For sterilization (animals, dissection instruments) and swabbing benches, hood, etc.
Calcium- and magnesium-free phosphate-buffered saline (PBS) Sigma-Aldrich Cell culture-tested PBS (Dulbecco’s formula) is purchased as a ready-mixed powder or in tablet form and made up with doubledistilled water before sterilization by autoclave. PBS consists of 2.68 mM potassium chloride (KCl); 1.47 mM potassium phosphate monobasic (KH2PO4); 0.137 M sodium chloride (NaCl); and 8.1 mM sodium phosphatedibasic (Na2HPO4). PBS can be prepared from scratch as follows: 200 mg KCl, 200 mg KH2PO4, 8 g NaCl and 1.15 g Na2HPO4/l of double-distilled water followed bysterilization by autoclave.
CryoTube vials Nalge Nunc international
A Neubauer haematocytometer and coverslips Fisher Scientific For estimating cell counting
Hand counter Fisher Scientific
Dissection microscope, Zeiss Stemi 1000 Carl Zeiss, Inc. For preparation of explants
Small sterile hood
Sterile dissection instruments (including Jeweler’s forceps) Sterilised by autoclave
Sterile plastic collecting vessels (7 ml bijou tubes or 20ml universals) Nalge Nunc international
Warm PECM Sigma-Aldrich Made up in the sterile hood and warmed to 37°C in the tissue culture waterbath. DMEM:F-12 supplemented with 20% FCS, 1% glutamine and + 1% penicillin & streptomycin solution
Dispase (50 μg/ml, equivalent to 6 units/mg) Available from MP Biomedicals, UK
10 μg/ml 4_,6 Diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride (DAPI). Sigma-Aldrich For microscopic visualization of apoptosis and mitosis
Vectashield fluorescent mounting fluid Vector Laboratories
Fluorescent upright microscope with ultraviolet filter (we use a Nikon Eclipse E600) Nikon Instruments
Digital camera and imaging software (we use a Nikon Coolpix 995 camera; A Nikon D3 camera Nikon Instruments
OpenLab4.0a software PerkinElmer, Inc.
Photoshop CS4 Adobe

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