Adulta och embryonala skelettmuskler Microexplant Kultur och Isolering av skelettet muskelceller Stem

Summary

Mikro-dissekerade explants teknik är en robust och tillförlitlig metod för att isolera proliferativ skelettmuskelceller från ung, vuxna eller embryonala muskler som en källa till skelett muskelceller stamceller. Unikt, har dessa celler varit kloner som härstammar producera skelettmuskulaturen stamcellslinjer som används för in vivo transplantation.

Abstract

Odlade embryonala och vuxna skelettmuskelceller har ett antal olika användningsområden. Mikro-dissekerade explants teknik som beskrivs i detta kapitel är en robust och tillförlitlig metod för att isolera ett relativt stort antal proliferativ skelettmuskelceller från ung, vuxna eller embryonala muskler som en källa till skelett muskelceller stamceller. Författarna har använt mikro-dissekeras Explantation kulturer för att analysera egenskaper för tillväxt skelettmuskelceller hos vildtyp och dystrofisk muskler. Var och en av komponenterna i vävnaden tillväxt kan nämligen cellöverlevnad, tillväxt, åldrande och differentiering analyseras separat med de metoder som beskrivs här. Nettoeffekten av alla komponenter i tillväxt kan fastställas genom att mäta priser Explantation utväxt. Det mikro-Explantation metod kan användas för att fastställa primära kulturer från ett brett spektrum av olika muskler typer och åldrar, och som beskrivs här, har anpassats av författarna för att isoleringen av embryonala skelettmuskulaturen prekursorer.

Unikt har mikro-Explantation kulturer använts för att härleda klonal (enda cell ursprung) skelettmuskulatur stamceller (SMSC) linjer som kan byggas ut och användas för in vivo-transplantation. In vivo transplanterade SMSC beter sig som funktionellt, vävnads-specifika, satellit celler som bidrar till skelettmuskulaturen fiber förnyelse men som också finns kvar (i satelliten cellen nisch) som en liten pool av odifferentierade stamceller som kan återanvändas isolerade i kulturen med hjälp av mikro-Explantation metoden.

Protocol

Två metoder kan användas för att isolera proliferativ skelettmuskelceller. I den första muskelvävnad är enzymatiskt rötas för att isolera enstaka celler före bordläggningen ut ^1. Den andra metoden är att explantation bitar av muskelvävnad i kulturen att låta celler växa ut under inkubation ^{2, 3.} Den andra metoden beskrivs i detta protokoll. Vävnadskultur själv har sina rötter i Explantation kultur. Året 2007 var det 100-årsdagen av den klassiska experiment Harrison där han erhöll neuron utväxter genom inkubering nerv explants i hängande droppar lymfa ^4. Explantation kultur tekniker har använts och förfinats i en mängd olika sammanhang under de följande 100 åren som ett medel för att generera proliferativ primära kulturer av vuxna och embryonala ^{4, 5.} Principen bakom Explantation tekniken är dock densamma, för att minimera trauma primärcell isolering genom att upprätthålla den tredimensionella strukturen av den förälder vävnaden under de avgörande tidiga stadierna av cell utväxt samtidigt som de var större än celler med en rik närande media på sig att föröka sig. I skelettmuskulaturen finns ytterligare en fördel med att använda explantation kulturen eftersom den rättsakt att skära upp muskelvävnad härmar trauma muskelfiber, den vanliga avtryckaren för satellit-cell aktivering, migration och spridning ^{3, 6.} Vuxen skelettmuskulaturen satellit celler (även kallade myoblasts) är proliferativ stamceller befolkningen ansvarig för muskelfiber reparation och tillväxt ^7.

Skelettmuskulatur explants efterliknar alltså in vivo-miljö regenererande muskler och stimulera övergången stamceller och division. I embryot, härleder de flesta ryggradsdjur skelettmuskulatur (bål och lem muskler) från somites, även somitomeres och GÄL-valv ger upphov till muskulaturen i huvudet ^{8, 9.} Den myotome kan identifieras som två olika grupper av Myf-5 uttrycker stamceller ligger i rygg, mediala och laterala kanter skilja somit, respektive. Respektive dessa celler generera epaxial musklerna i ryggen, som gör åtskillnad på plats, och den ventrala och laterala hypaxial muskulatur (ben, mage och respiratoriska muskler) som kräver migration av muskelceller härrör från somit ^10. Embryonala muskel stamceller migration är under kontroll av Pax 3 ^11. Myf-5 uttrycksformer är avgörande för inrättandet av den embryonala muskulatur och denna betydelse kvarstår för postnatal musklerna där över 98% av aktiverade satellit celler uttrycka Myf-5 ^12. Myf-5 är därför en tillförlitlig och specifik markör för förökar skelettmuskulaturen stamceller befolkningen i både adulta och embryonala vävnader. Embryonala muskel stamceller (även kallad muskelcellerna progenitorceller, skelett prekursorer muskler, myoblasts eller embryonala celler satellit) kan isoleras från somites i ett tidigt skede mus, kyckling och groda embryon ^13. För att isolera myogenic kulturer från embryonala skelettmuskulaturen äldre embryon författarna har anpassat microdissected Explantation tekniken för embryonala vävnader. Ett liknande tillvägagångssätt används av Cossu et al. Generera klonal cellpopulationer från embryonala somit ^{14 14.}

1. Cellodling in vitro av skelettrelaterade muskelceller Stem (SMSC)

SMSC är cellinjer från en enda cell ursprungsbeteckning som har kloner som härrör från primär skelett kulturer muskler Explantation. De kan odlas med hjälp av standardiserad metodik vävnadsodling om tillräcklig vård fattas. Observera att, om inte annat anges, är alla beskrivna manipulationer genomföras under aseptiska förhållanden med hjälp av en huva laminärt flöde (klass 1 eller klass 2 sterila skåp) och alla reagenser kultur värms till 37 ° C i ett vattenbad innan användning.

1. För att få SMSC från flytande kväve lagring (se avsnitt 1.2 för att frysa ner metod) cryovials ska tinas snabbt och att innehållet överförs till 5 ml uppvärmd (37 ° C) DF10 odlingsmedium för omedelbar centrifugering (1.000 g till 3 min) för att ta bort DMSO . Den bästa metoden för att tina celler genom upprepad pipettering av små mängder förvärmda odlingsmedium i flaskan innan de överförs till centrifugrör. Processen för upptining celler bör ske mycket snabbt sedan frysförvarade celler innehåller 10% DMSO som är giftigt för cellerna i rumstemperatur (LD50 ca 2 min).
2. Efter centrifugering supernatanten tas bort och cellerna tvättas genom att åter avbryta cellpelleten i ytterligare 5 ml DF10, centrifugera sedan som tidigare.
3. Cellpelleten blandas sedan för andra gången med 5 ml DF10 och den resulterande cellsuspension överförs till en liten 25 cm ² plast kultur harssel.
4. Kulturer hålls vid 37 ° C i en fuktig kuvös med 5% CO ₂ i luften. Såvida fartyg används med en filtrerad mössa, måste locket av kolven något lossas i flera timmar för att luften i kulturen fartyget till jämvikt med inkubatorn och surgöra av substrat. pH i mediet övervakas genom att införliva ett fenolrött indikator färgämne pH i odlingsmedium.
5. Tinas cellerna måste alltid övervakas 24 timmar efter bordläggning och åter matas med färsk DF10 medel för att avlägsna celler skräp och rester av toxiner (se not 1 och 2).

1,1. SUBKULTUR

För etablerade SMSC linjer när celler når cirka 95% sammanflödet, bör de tas bort från sin kultur fartyget, utspädd och placeras i ett nytt fartyg för att möjliggöra ytterligare tillväxt. Denna subkultur förfarande kan uppnås med hjälp av ett antal olika enzymatiska förfaranden, som trypsin / EDTA de mest använda (se not 3). Det är vanligt (och bra) praxis att växa celler vid densiteter som kräver att de skall omodlas den tredje dagen av tillväxten. För de flesta SMS cellinjer detta kan uppnås genom att dela upp celler 1 / 10 kl varje subkultur. Detta möjliggör noggrann övervakning av celler och gör att de utför vävnadsodling att omedelbart identifiera ovanliga tillväxt beteende (till exempel snabbare tillväxt), vilket kan tyda fenotypiska förändringar i cellinje som omvandling eller minskning av apoptos orsakad av anpassning till kulturen förutsättningar. Dessutom minskar en konsekvent och noggrann subkultur rutin vida förekomsten av sådana händelser.

1. För subkultur med trypsin (trypsinisation) fartyg tas bort från inkubatorn och medelstora kasseras genom aspiration.
2. Celler är sedan tvättas två gånger med sterilt kalcium-och magnesium-fri fosfatbuffrad saltlösning (PBS), 10 ml per disk, tas bort varje gång genom aspiration.
3. Att skilja cellen cellslager (25 mm ² flaska) 1 ml 1 trypsin / EDTA tillsätts och kvar på cellerna vid rumstemperatur i 2 3 min tills cellerna börjar loss (se not 4). Detta kan ses av den erfarna användaren som små hål bildas i något ogenomskinlig cellslager när kolven hålls mot ljuset (se not 5). Även celler bör trypsinised tillräcklig tid för att garantera en enda cell fjädring, bör man inte överexponera SMSC till trypsinisation eftersom detta kommer resultera i höga nivåer av celldöd och dålig fastsättning när celler är åter klädd.
4. För att stoppa trypsin reaktion, serum innehållande medium (DF10) läggs på minst 2 volym (det vill säga dubbelt så stor volym av trypsin lösningen). När subkulturodling en 25 mm ² kolven är det praktiskt att lägga till 9 ml DF10 i detta skede. En 1 / 10 split av celler kan sedan lätt göras genom att späda 1 ml av cellsuspension i en ny 25 mm ² kulturen kolv tillsammans med ytterligare 9 ml rent DF10 medium. Resterande celler kan användas för cell expansion (överföring till ett större fartyg) frysförvarade, (se avsnitt 1.2) eller räknade och klädd i experimentell rätter, brunnar eller plattor för spridning och överlevnad analyser, differentiering, tillväxtfaktor behandling eller andra ändamål (se nedan).

1,2. Frysförvaring av cellinjer och primära kulturer

1. För frysförvaring celler skiljas från sina cellslager för subkultur (avsnitt 3.1.1) och pelleterat genom centrifugering (3 min vid 1000 g).
2. Supernatanten avlägsnas genom aspiration och celler är noggrant och snabbt resuspenderas i 10 ml fryser ner mix (10% DMSO i DF10) innan de åter pelleterat genom centrifugering.
3. Denna gång pellet resuspenderas i tillräcklig fryser ner blandningen så att 0,5 ml cellsuspension per cryovial (se tabell 1) och omedelbart placeras i 80 ° C över natten.
4. Cryovials överförs till flytande kväve följande dag för långsiktig lagring (se not 6). Som med upptining av celler, måste denna process frysförvaring genomföras snabbt. Medan DMSO är skyddande i cellmembranen under frysning det är mycket giftigt för celler till icke-frysning temperaturer.

1,3. Bestämma Cell Tal

1. För att bestämma cellens koncentration av en enda cell avstängning (efter subkultur) ett Neubauer haemocytometer kan användas. För att säkerställa noggrannhet räkna täckglas måste vara säkert monterad på haemocytometer basen (se not 7).
2. En liten droppe cellsuspension placeras sedan nära kanten av täckglaset och kommer att tas upp av kapillärkraft.
3. Celler räknas då med ett inverterat mikroskop med faskontrast belysning. För att öka noggrannheten i den sista cellen koncentration, calnar i räknekammare bör inte överlappa varandra, om de gör det ursprungliga cellsuspension ska spädas och cellerna åter räknas. Klumpar bör undvikas genom noggrann dissociation av celler under trypsinisation och 100-200 celler över en känd yta ska räknas för att få en korrekt uppskattning av cell nummer. Ett bekvämt sätt att använda Neubauer haemocytometer är att räkna celler i 2 eller fler 16 kvadrat set. Celltäthet per milliliter då erhålls genom att dividera summan med antalet räknade set (t.ex. 2) och multiplicera med 10 ^4. Till exempel 100 celler räknade över 2 x 16 kvadrat set = 100 / 2 = 5 x 10 ⁵ celler / ml.

2. Etablera Primär Skelett kulturer Muscle Microexplant

Primär mikro-Explantation kultur kan användas för att isolera SMSC från alla tillgängliga skelettmuskulatur, inklusive de individuella musklerna i fram-och bakbenen, diafragma, rygg-och magmuskler. Metoden för att härleda microexplant kulturer från unga och vuxna muskler beskrivs i detalj av Smith och Schofield ³ och har därefter använts i stor utsträckning att härleda SMS celler från unga, vuxna och äldre mus muskler. Metoden kan också användas för att härleda odlade skelettmuskelceller från fisk ²⁴ och mänskliga skelettmuskulatur (Rao och Smith, opublicerad). Utväxt av SMSC från en mus muskel microexplant illustreras i Figur 1a, b. Metoden har modifierats för isolering av embryonala muskelceller föregångaren (se avsnitt 3). Den grundläggande metoden är följande:

1. Aseptisk dissekering av utvalda muskeln (s) från en nyligen gallrats mus sker med hjälp av sterila instrument, en ren arbetsyta och liberal användning av 70% etanol spray.
2. Isolerade muskler tvättas genom två förändringar i DF20 medium och placeras ut i friska DF20 medium i en 60 mm ² maträtt. Med hjälp av en stereo muskler dissektion mikroskop är noga microdissected under sterila förhållanden att utesluta fett och bindväv.
3. Rengöras muskler bitar klipps sedan i 400 ìm ³ kuber som, med hjälp av juvelerare s pincett, är placerade sig i mitten 60 brunnar i en 96-brunnar innehåller 50 mikroliter DF20 (se not 8). Wells kontrolleras i mikroskop och placeras i inkubatorn. De yttre brunnarna är fyllda med koksaltlösning för att förhindra uttorkning av brunnar med explants (3).
4. Microexplant kvarstad och utväxt görs efter 24-48 h inkubation och därefter 48-72 timmars intervall (beroende på tillväxttakten i de muskler som odlade).
5. För expansion och isolering av SMS celler, bör utväxt kulturer individuellt övervakas för celler med en övervägande SMSC morfologi, dvs sfäriska mononucleate celler med hög refractivity som växer i aggregering kluster (se figur 3.1b).
6. När Explantation utväxt är etablerad enskilda brunnar är trötta (se not 9) genom tillsats av 50 mikroliter steg av medium när mediet försurar på grund av ökad cell densitet. När den väl är full och cellodling nästan konfluenta är brunnar matas av utbyte av 50% av de medel varje gång för att se till att upprätthålla "konditionering" faktorer som utsöndras av celler (se kommentarerna under förutsättning av medel inom ramen för kloning, avsnitt 2.1). För att undertrycka differentiering, ligger på 60-70% sammanflödet primära Explantation utväxter kopplas in kalcium utfiskade-mediet genom att ersätta DF20 medium för kalcium-utfiskade DMEM/F12 (alla tillskott är desamma) för utfodring celler ^3.
7. Explantation betingad medium kan beredas från kulturer i detta skede och lagras för användning under expansion och kloning av primär SMSC (för kloning av metoden, se avsnitt 2.1, figur 1c f). Kulturer är subkultiveras med dispase metoden (se avsnitt 3.5).
8. Kloner som härrör SMSC kan analyseras in vivo genom intramuskulär injektion (Figur 3,1 GK) ^19.
9. Karyotypning kan utföras på kloner som härrör SMSC linjer för att bekräfta diploida status (se avsnitt 2.2, figur 3,1 l) ^25.
10. Denna metod kan anpassas för odling embryonala muskel (avsnitt 3).

2,1. Klonat Härledning

Primär Explantation myoblast kulturer (Figur 1a, b) är ett användbart och precist verktyg för att skapa en mängd olika tillväxt parametrar i vildtyp och mutant skelettmuskulaturen. Klonat härledning, isolering av en cellinje från en enda cell, är ett viktigt steg i isoleringen av skelett muskelceller stamceller och kan också användas för att subclone SMSC linjer transfererats med RNAi konstruktioner eller transgener. Etablerade SMSC och primära Explantation kulturer är mycket densitet beroende och kommer att "Crash "(bort från skålen och dö) om pläterade ut på en för låg celltäthet. Detta beror på att SMSC släppa lösliga faktorer som krävs för att upprätthålla tillväxt och cellöverlevnad. För att simulera en hög densitet kultur och leverera dessa faktorer under kloning process, SMSC klonade i egen betingade medium. Tillsatsen av konditionerat medium var konstaterats vara nödvändigt för att enskilda celler att föröka sig i en isolerad miljö.

1. Konditionerat medium är beredda av prolifererande SMSC odlade för 48 h mellan 33 och 75% sammanflödet.
2. Medierna där dessa celler odlas tas bort efter 48 timmar och filtreras med ett 0,2 filter ìm spruta, vilket garanterar sterilitet betingade medellång och tar bort alla rester av celler och skräp.
3. Detta under förutsättning medium blandas i förhållandet 1:1 med färska odlingssubstrat (kloning medium, se not 10) och används som närsubstrat för enskild cell kloning.
4. För att uppnå en enda cell spädningar celler är dissocierade till en enstaka cellsuspensionen genom noggrann trypsinisation (etablerat SMSC) eller dispase behandling (primär Explantation kulturer) och spädas till en koncentration av en cell per 100 mikroliter kloning medium.
5. 50 mikroliter av denna cellsuspension kan sedan klädd i vardera centrum 60 brunnar i en 96-brunnar.
6. Celler har tillåtelse att ansluta genom inkubation vid 37 ° C i 5% CO ₂ för 6 h och varje brunn sedan försiktigt poäng för förekomst av celler. Brunnar som innehåller 0 eller mer än en cell diskonteras i detta skede.
7. Brunnar som innehåller en enda bifogade cell är noggrant noteras och kolonin härstammar från denna enda cell är noggrant (dagligen under de första dagarna) att säkerställa att endast en koloni, som härrör från en enda cell, är närvarande. Cellinjer var bara härrör från brunnar som innehåller en cell. Figur 1c-e illustrerar expansionen i en sådan härrör cell koloni.
8. När kolonin når sammanflödet i 96-brunnar det kan vara omodlas in i en brunn i en 48-brunnar.
9. Den klonade cellinjer kan sedan försiktigt expanderat till 24 - och 6-brunnar till dess att tillräckligt celler finns tillgängliga för att plattan i en 25 cm ² kolven.
10. Skelettmuskulaturen ursprung dessa kulturer kan påvisas genom ett uttryck för Myf-5 (Figur 1f) eller annan skelettmuskulatur-specifika markörer som MyoD och Pax 7.
11. I detta skede linjer fryses ner innan ytterligare expansion (se tabell 1).

2,2. Karyotypning

Karyotypning är en viktig metod för att övervaka cellens fenotyp. Cellinjer, som person med klonal härledning bör karyotyped att säkerställa att de har behållit ett komplement diploid kromosom utan grov kromosomala omdisponeringar som kan påverka deras fenotyp.

1. För karyotypning celler odlas för sena exponentiella fasen (80% konfluenta) i 25 cm ² odlingskärl (2 dagar efter subkultur) för att maximera andelen mitotiska celler i kulturen.
2. Tjugofyra timmar innan karyotypning cellerna matas med 10 ml färsk odlingsmedium. 0,2 ml 10 mg / ml colchicin (se not 11) läggs sedan till de celler som inkuberas i ytterligare 1 tim vid 37 ° C.
3. Efter 1 h, cellerna är föremål för standarden trypsinisation subkultur procedur förutom att både odlingsmedium och PBS tvättar behålls för att maximera antalet mitotiska skördas cellerna.
4. Det dissocierade celler, behöll medium och PBS tvättar spinns på 1000 g under 3 min till pellets cellerna och supernatanten bort och kastas in i blekmedel.
5. Cellpelleten sedan resuspenderas i 5 ml 0,0075 M kaliumklorid för exakt 4 minuter, innan cellerna igen pelleterat genom centrifugering.
6. De flesta av supernatanten sugs, lämnar en liten mängd (~ 50-100 mikroliter) i röret för resuspension. Resuspendera cellerna genom att ställa basen på falken röret tills en cell slurry uppnås. Cellerna placeras sedan på is och som fastställs i nybakade iskalla fixativ (metanol: isättika i en 3:1 ratio) enligt följande: 10 ml fixeringsvätska långsamt läggas droppvis till cellerna med hjälp av ett litet glas pasteurpipett ( Detta förhindrar cell klumpar).
7. Celler läggs på is i 30 min och sedan pelleterat genom centrifugering varefter cellpellet resuspenderas i 0,5 ml färsk fixativ.
8. Diabilder produceras genom att släppa den fasta cellsuspension på beredd diabilder (se avsnitt 3.2.2.1) höll i en vinkel på 45 °. För att säkerställa väl fördelade metafas sprider pipetten ska hållas minst 30 cm ovanför bilden.
9. Att visualisera kromosomer, är bilderna färgas för 2 min i Leishman är Bets, utspädd med tre volymer av Gurr buffert pH 6,8 strax före användning.
10. Får torka i rumstemperatur och monteras i DePex monteringsmedel.

1. Glas diabilder (Premium objektglas, VWR International, Storbritannien) är förberedda för användning i karyotypning protokollet genom att placera dem över natten i en stor (glas) kärl av svavelsyra.
2. Diabilder placeras sedan under rinnande kranvatten för 8 h och lagras därefter i 70% etanol tills de behövs.
3. Före användning bör diabilder sköljas under rinnande kranvatten i ytterligare 30 min och lufttorkas vid rumstemperatur i 1-2 timmar

3. Etablera Primär Micro-Explantation kulturer från embryon

Tre musstammar användes för att validera denna metod vildtyp (C57BL/10) tillsammans med MDX och CAV3KO (båda dystrofa mutanter). Den dystrofin-brist MDX musen har sitt ursprung spontant i C57BL/10 var denna linje erhållits från Bullfield laboratorium i 1991 och har sedan dess kontinuerligt underhålls i vår inavlade koloni ^26. CAV3KO dystrofa möss, som innehåller en mutation i caveolin-3-genen, var uppfödd på C57BL/10 bakgrunden för 10 generationer innan de används i denna studie ^27. Varje mus rad genererade ett kraftigt reproducerbar utväxt, spridning och överlevnad profil som fosterstadiet specifika och olika för varje stam. Följande protokoll var anpassade för embryon från Smith och Schofield PN (1994) ^3, huvudsakligen i Merrick ^21.

3,1. Embryosamlings

1. För att få iscensatt embryon är par bildas som naturliga (1:1) parningar och kvinnor kontrolleras varje morgon för vaginal pluggar. På dagen av plug-avkänning, är embryon räknas som E0.5 dagar (12 timmar efter befruktning).
2. När slidan pluggar har upptäckts hanarna tas bort från buren för att säkerställa riktigheten av embryonala iscensättning.
3. När önskad embryonala stadiet har uppnåtts (E11.5 till E17.5) mödrar dödas av halsdislokation, är buken rakat, är huden och omgivande områden tvättas med 70% alkohol och livmodern tas bort via en horisontell buksnitt görs med sterila dissekera instrument.
4. Livmodern är sedan tvättas en gång i obearbetad Explantation odlingssubstrat (PECM) innan de släpps ut i en liten skål med färska PECM före dissekering.
5. E11.5 till E17.5 embryon dissekeras från livmodern med hjälp av en dissekera mikroskop och placerade sig i petriskålar som PECM i beredskap för detaljerad microdissection.

3,2. Embryo Microdissection

1. Individuella embryon ytterligare dissekeras att isolera områden rika på skelettmuskulatur (se figur 2a). Hind och framben (hypaxial muskler) är dissekeras ut, liksom den övre och nedre kroppen väggen (främst epaxial skelettmuskulatur). För att göra detta ett snitt längs bröstkorgen, är buken och bäckenet som skapats för att de inre organen av embryot ska tas bort.
2. Att berika för embryonala skelett muskelceller stamceller (eSMSc), är huvudet, ryggmärgen och alla inre organ då bort.
3. I äldre embryon (E15.5-E17.5 embryon) är det också möjligt att ta bort hud och brosk / ben igen för att öka andelen muskelceller i de kulturer.

3,3. Installera kulturer Embryo Microexplant

1. När framben, bakben och övre och nedre väggar kroppen har dissekerat ut de placeras ut i friska PECM och ytterligare microdissected att producera små kuber av vävnad av samma storlek (~ 0,5 mm ^3, figur 2a).
2. Dessa microexplants sedan sättas i centrum 60 brunnar i en 96-håls platta (en Explantation per brunn) innehåller 50μL PECM per brunn. Ett minimum av 60 brunnar med en Explantation per är väl etablerade, studerade per embryo.
3. För odling embryon centrum 60 brunnar kan delas in i regioner som betecknar där Explantation härrör från (Figur 2b). Denna konstruktion gör att 15 brunnar vardera innehåller respektive forelimb, överkroppen vägg, bakdelen och underkropp explants vägg ^21.

3,4. Övervakning utväxt

Utväxt kurs är ett tillförlitligt mått på tillväxten av embryonala skelettmuskler explants och under noggrant kontrollerade förhållanden som beskrivs här är mycket reproducerbar.

1. Explants inkuberas vid 37 ° C och 5% CO ₂ i 3 veckor och fick på 3: e, 7, 14 och 21 dagen i odling med ett inverterat mikroskop. Explants poängsätts efter graden av sammanflödet av celler i varje enskilt bra (figur 3a, e).
2. Fotografiska bilder av kulturer kan vidtas, till exempel med en SLR-kamera ansluten till mikroskopet och 100 ASA Fuji (färg) eller Kodak Tmax (svartvitt) professionell film (Figur 3f).
3. Ett skelettmuskel-specifik antikropp specifik för Myf-5 kan användas för att demonstrera skelettmuskulaturen ursprung eSMSc, beroende på stam 80 95% av celler som isolerats med denna metod är Myf-5 positiva. Andra markörer som MyoD och Pax 7 kan också användas för att demonstrera skelettmuskulaturen ursprunget till dessa cellpopulationer. Även om dessa celler innehåller en mycket hög andel av embryonala skelett muskelceller stamceller det kan inte förutsättas (särskilt för yngre embryon) att de alla är i skelettmuskulaturen ursprung eller att de alla är stamceller. Att isolera rena populationer stamceller är det nödvändigt att kloner härleda primära Explantation kulturer som beskrivs i avsnitt 2.1.

3,5. Odling Primär Embryonala explants

När sammanflytande, Explantation kulturer visar morfologiska funktioner i SMSC (Figur 3f) kan omodlas enligt följande ^{3, 21:}

1. Odlingsmedium tas bort från den valda brunnar, filtreras med hjälp av en 0,2 ìm Acrodisc R_ sprutfilter och behållas för att användas som betingad medium. Mediet kan förvaras vid 4 ° C i en vecka.
2. 100 mikroliter av dispase spätt 1:10 i PECM läggs till varje brunn och plattor sedan tillbaka till 37 ° C inkubator i 20 minuter.
3. En pipettspetsen används sedan för att försiktigt skrapa lossade celler från ytan av väl.
4. Cellsuspensionen sedan centrifugeras vid 1000 g under 3 min till pellets cellerna och supernatanten tas bort och kasseras.
5. Celler är resuspenderas i 200 mikroliter på 1:1 blandning av konditionerat medium och PECM.
6. Cellen blandningen överförs till 48-brunnars plattor för ytterligare expansion.
7. För in vitro-analys celler kan beläggas med en densitet på 5 x 10 ³ celler / cm ² antingen i 48-brunnars plattor (som båda innehåller ett 9 mm ² sterila glas täckglas) eller i 8-väl-glas kammare diabilder. För differentiering analys celler odlas under natten till 50-60% sammanflödet innan de överförs till differentiering tillåtande medium (se avsnitt 4 för in vitro-metod detaljer) i 3 dagar, innan fixeringen.

4. In vitro Analys av skelettrelaterade muskelceller Stem och Primary kulturer

4,1. Beredning av celler

1. Dispase subkultiveras (avsnitt 3.3) primära embryonala Explantation kulturer är pläterade i PECM / betingad medelstora på täckglas i 48-brunnars plattor vid en densitet av 3 x 10 ³ celler / cm ² och tillåtelse att ansluta.
2. För bedömning av apoptos och täckglas spridning tvättas två gånger i PBS, fast i 4% paraformaldehyd (se avsnitt 4.2) i PBS i 20 minuter i rumstemperatur, följt av ytterligare 10 min PBS tvätt.
3. Täckglas förberedd på detta sätt kan lagras vid 4 ° C i upp till 1 vecka i PBS eller PBS / glycin.

4,2. Beredning av Paraformaldehyd Fixative

1. I ett dragskåp väger 4 g paraformaldehyd (PFA, Sigma-Aldrich, Storbritannien) och lägga till en glasflaska på 100 ml steril PBS med en magnetisk omrörare. En ansiktsmask och handskar bör användas som skydd.
2. I ett dragskåp är lösningen värms upp och ständigt rörde på en magnetisk värmeplatta tills pulvret löser sig. Detta tar ungefär 5-10 minuter vid 65 ° C. Försiktighet måste vidtas för att förhindra att temperaturen stiger över 70 ° C, eftersom det finns en risk för att den lösning exploderar vid höga temperaturer.

4,3. Apoptos och spridning analys

1. Fast täckglas (berett enligt avsnitt 4.1) är färgad med 10 mikrogram / ​​ml DAPI i 3 min.
2. Täckglas tvättas en gång i PBS (5 till 10 min) och inverterad på en plats i vectashield monteringsmedium på en glasplatta ^{17, 18.}
3. Kanterna på täckglas tätas med nagellack (se not 12).
4. För lagring, diabilder i folie och placeras vid 20 ° C.
5. För räkning, är bilderna ses under fluorescens (UV-filter) på en upprätt mikroskop och gjorde för apoptotiska och mitotiska celler med en okularfokalplattan. Tjugo slumpmässigt fördelade elnät räknas (motsvarande ~ 1000 celler), och cellerna morfologiskt karakteriseras som icke-apoptotiska, apoptotiska eller mitotiska (Figur 3 g).
6. Mitotiska och apoptotiska index beräknas som en andel av den totala celler.

4,4. Immunohistokemi

Celler fast på täckglas kan också användas för immunohistokemi. För antigenåtervinning använda en tryckkokare täckglas skall vara stadigt fäst glasskivor med vanliga gem. Immunfärgning kan användas för att identifiera celler som förökar sig med hjälp av en antikropp till Ki67 (1 / 1, 000 utspädning), för att fastställa identiteten med hjälp av en antikropp mot Myf-5 (1 / 1 000 utspädning), eller för att undersöka genuttryck (seAvsnitt 4.5). Immunfärgning kan uppnås med hjälp av ett antal metoder, följande (beskrivs i (28, 29)) används rutinmässigt av författarna:

1. Natrium citratbuffert förvärms i tryckkokaren. För antigenåtervinning är diabilder som innehåller sektioneras vävnad placeras i den uppvärmda buffert och värms under tryck i 2 min. Tryck uppnås genom att säkra locket tryckkokaren och utsläppande på vikten. När 2 min hämtning tid har förflutit tryckkokaren därefter noggrant placeras under rinnande kallt kranvatten för att minska trycket. För att förhindra att bufferten kokar upp, bör man inte ta bort locket tills trycket har utjämnats med atmosfärstryck. Trycket är tillräckligt minskar när vikten kan tas bort lätt (utan kraft) och locket avlägsnas. Diabilder sedan bort från buffert och tvättas i rumstemperatur PBS i 10 min.
2. Diabilder är redan blockerad genom att sänka ner dem i 3% väteperoxid / kranvatten i 5 min och sedan tvättas tre gånger i PBS + 0,05% Tween 20 (10 min per tvätt).
3. Blockering sker genom en 30 minuters inkubation i TNB blockerande buffert (levereras i TSA kit) vid rumstemperatur.
4. Primära antikroppen späds i TNB buffert till lämplig utspädning (erhålls genom titrering, se not 12) och inkuberas över natten vid 4 ° C (eller alternativt 1 till 2 timmar i rumstemperatur).
5. Efter tre 10 min tvättar i PBS + 0,05% Tween 20, är ​​bilderna inkuberas i 1 timme vid rumstemperatur i lämpliga biotinylerad second antikroppen späds i TNB buffert.
6. Efter ytterligare tre 10 min tvättar i PBS + 0,05% Tween 20, är ​​bilderna inkuberas i 30 min i Streptavidin-HRP (ges i TSA kit) utspädd 1:100 i TNB buffert och sedan tvättas tre gånger (10 min vardera) i PBS + 0,05% Tween 20.
7. Biotinyl tyramide (förstärkning reagens, TSA Kit) läggs sedan till varje avsnitt för mellan 8 och 15 min (exakt tid bör erhållas genom optimering experiment).
8. Efter förstärkning, diabilder tvätta tre gånger (10 min vardera) i PBS + 0,05% Tween 20 och inkubera i 30 minuter i SA-HRP.
9. Efter ytterligare tre tvättar (10 min vardera) i PBS + 0,05% Tween 20, visualisera med 3,3 _-Diaminobenzidin tetrahydrochloride kromogen (DAB) i 5 till 10 min. Sedan utföra två sista tvättar i vatten innan motfärgning bilderna i hematoxylin och coverslipping. DAB är cancerframkallande och bör hanteras med försiktighet (som för Kolkicin, avsnitt 3.2.2).

4,5. Differentiering

1. SMSC pläterade på täckglas eller diabilder kammare (se not 13) kan också vara differentierad innan fixeringen för myotube analys.
2. För dessa experiment celler klädd vid en densitet av 10 ⁴ / cm ² och tillåtelse att ansluta i 6 till 8 timmar
3. Celler sedan kopplas in till en differentiering begränsande villkor för 3 dagar (se not 14).
4. Differentiering mediet består av DMEM + 0,5% FCS kompletteras med 2% häst serum och 1% glutamin. Denna åtskillnad tillåtande odlingsmedium ersätts med 48 timmars intervall.
5. Täckglas är sedan fast i 4% paraformaldehyd som ovan (avsnitten 3.4.1 och 3.4.2).

4,6. Transfektion av SMSC: Redovisning av transgener och shRNAi Konstruerar

Stamceller och primära kulturer är terapiresistenta transfektion och med en majoritet av metoder för transfektion ränta i SMSC och primära skelettmuskelceller är mycket låg (<10%), förebygga användning av transienta transfektion metoder. För att lösa detta har det varit standard i vårt laboratorium att isolera klonal derivat från transgenen transfekterade kulturer (se avsnitt 3.2.1) Följande transfektion med kalcium fosfat eller lipofectamine. Alternativt celler kan effektivt transfekterade med infektion av viralt förpackade konstruktioner. Figur 1m visar stabila uttryck av β-galaktosidas i PD50A, en klonal SMSC derivat isolerats under G418 urval efter infektion med pIRV, en replikering defekt retrovirus som bär gener för neo/G418 motstånd och β-galaktosidas (19). Denna cellinje användes för att formellt visa att SMSC beter sig som funktionell stamceller in vivo (se figur 3.1). Medan generationen av en stabil klonal cellinje som uttrycker en markör gen är önskvärd för in vivo stamcellstransplantation experiment, det är en tidskrävande och otillfredsställande metod för att analysera geners funktion in vitro. Av dessa skäl författarna har nyligen utvecklat en optimerad ändring av Lipofectamine 2000 transfektion reagens som kan leverera transfektion skattesatser på 60 till 70%. Detta gör att analysen av genfunktion använda övergående transfektion av transgener eller RNAi konstruktioner i SMSC eller primära kulturer Explantation (Figur 3h, i). Författarna använder ett kort hårnål RNAi vektor (pSHAG RNAi) (30) för att generera shRNAi konstruktioner som kan genspecifika inriktning av mRNA uttryck i SMSC. Framgången för shRNAi tekniken beror på två faktorer: (a) en effektiv transfektion metod och (b) utformning av en kort hårnål sekvens som specifikt känner igen målgenen. En shRNAi konstruera riktas till EGFP kan användas för att validera RNAi ÖVERVÄLDIGANDE metoden (Figur 3j, m).

4,7. Optimerad LipofectamineTM 2000 Transfektion Protokoll för SMSC

1. Cellerna är pläterade med 5 till ¹⁰ april celler / cm ² in i kammare bilder i 250 mikroliter DF10 odlingsmedium och odlas för 18 timmar att nå 95% sammanflödet (optimal sammanflödet för varje cellinje bildades genom att bedöma transfektion priser vid olika tätheter).
2. För varje brunn är 0,5 mikrogram av DNA (shRNAi vektorer, transgener) läggs till 33 mikroliter serum-fri DMEM kompletteras med 2 mm glutamin och blandas försiktigt i ett sterilt Eppendorf-rör.
3. För varje brunn är 1,25 mikroliter av Lipofectamine 2000 separat spädas med ytterligare 33 mikroliter serum-fria medel DMEM + glutamin, försiktigt blandas och bevaras i rumstemperatur i 5 minuter
4. DNA och lipofectamine blandningar är sedan snabbt ihop, blandas försiktigt i 60 sekunder genom att pipettera och sedan inkuberas i rumstemperatur i 19 min så att DNA Lipofectamine 2000 komplex bildas.
5. För transfektion är 66 mikroliter av komplexa mix till varje kammare bra och bilderna är försiktigt gungade under 10 s för att garantera lika fördelning av komplex.
6. Cellerna inkuberas i 24 till 72 h vid 37 ° C och 5% CO _2. Beroende på konstruktion, funktionell genuttryck eller shRNAi ÖVERVÄLDIGANDE är först upptäcks mellan 8 och 24 timmar efter transfektion.

5. Representativa resultat

När explants noggrant explanterade från vuxna skelettmuskulatur eller från embryon i explants kommer att börja generera celler inom ett par timmar till 72 timmars inkubation vid 37 ° C (5% CO ₂ / luft) (Figur 3A). Den tid det tar att detta ska ske beror på källan till explants: embryonala explants växer ur snabbare än äldre vuxna skelettmuskulaturen explants. Enligt vår erfarenhet tidpunkten för utväxt är mycket reproducerbar ^{3, 29.} Utbyggnad av cellen befolkningen kommer att ske under en period av dagar (embryo explants) eller veckor (äldre skelettmuskler explants) för att generera hög densitet aggregera SMS-cells primära kulturer (se figur 3B-F för illustration av dessa kulturer). Figur 1 & 3 visa representativa resultat av den framgångsrika härledning och kultur i skelettmuskulaturen och embryonala explants, klonat härledning och in vivo transplantation av skelettmuskulaturen härrör stamceller från vuxna, β-galaktosidas märkning, karyotypning och myf-5 immunohistokemi av embryonala SMSC att illustrera skelettmuskulaturen ursprung . cellen befolkningen Figur 3 visar ett representativt resultat av utväxt poäng (med Myf-5 immunohistokemi att visualisera SMSC), morfologi av embryonala muskel galvaniska element, DAPI färgning för apoptos och shRNAi transfektion protokollet. Ytterligare information finns i figuren legender om dessa två siffror. Figur 2 illustrerar förfarandet från embryo mikro-dissekering för att generera berikad populationer av embryonala skelett muskelceller stamceller.

Tabell 1: Beräkning tabell för att uppskatta antalet cryovials krävs för maximal cellviabiliteten under cell fryser ner protokoll

Skylt / Flask / kammare bild	Volym odlingsmedium	PBS tvättar	Volym av trypsin	Antal frysa ner flaskor (3.1.2)
96-bra	50 mikroliter	2 x 100 mikroliter	25 mikroliter	N / A
48-bra	150 mikroliter	2 x 200 mikroliter	50 mikroliter	N / A
24-bra	500 mikroliter	2 x 700 mikroliter	200 mikroliter	N / A
6-väl	3 mls	2 x 3 mls	500 mikroliter	1
Liten (25 cm 2)	10 mls	2 X 10 mls	1 ml	2
Medium (80 cm 2)	10 mls	2 X 10 mls	3 mls	4
Stor (175 cm 2)	10 mls	2 X 10 mls	5 mls </ Td>	8
Avdelningen och	500 mikroliter	2 x 500 mikroliter	100 mikroliter	N / A

N / A = ej tillämpligt, cell nummer var för låg för att frysa ner om inte flera brunnar frystes ner tillsammans.

Figur 1. Isolering av skelett muskelceller stamceller (SMSC) från microexplants: (A) Tidig utväxt från explanterade vuxna skelettmuskulaturen (dag 2) (b) Fastställda Explantation utväxt som visar aggregerade kulturer och hög celltäthet.. Clonal härledning av SMSC. (C) Enstaka cell isolerade i en 96 brunnar. (D) kolonin enda cell ursprung. (E) Etablerad klonat befolkningen. (F) Kontroll av SMSC identitet med hjälp Myf-5 immunohistokemi. Celler från SMSC klon PD50A (som uttrycker β-galaktosidas) i mottagarländerna möss vid 3 månader (G) och (HJ) 14 månader efter injektion av 2000 PD50A celler i musen tibialis anterior muskeln. (G) Tre smält nyligen (centralt belägna kärnor ) β-galaktosidas-positiva celler (blå fläck) i muskel fiber (längdsnitt). (H) Omfattande bidrag β-galaktosidas-positiva celler (brun fläck, som upptäckts av anti-β-galaktosidas antikropp) i muskelfibrerna (tvärsnitt ). (I) β-galaktosidas-positiv satellit-cell (bruna fläcken, påvisas med anti-β-galaktosidas antikropp). (J) sekundär antikropp-kontroll (ingen missfärgning). (K) β-galaktosidas-positiva celler (blånad) förökar sig i kulturen när isolerade från injicerade värd muskler 12 månader efter injektion. (L) Karyotype av en mus klonal SMSC linje (DMN8) visar normala diploida kromosomen komplement. (M) Histochemistry visar β-galaktosidas uttryck i en koloni av PD50A celler ( Figur 3,1 g, k, reproducerad med tillstånd från AACR press, Smith och Schofield, 1997).

Figur 2. (A) Illustration av embryot dissekering processen. Figuren representerar en E15.5 embryo där ben ursprungliga (brosk) kan lätt identifieras och dissekerade fri från den omgivande skelettmuskulaturen vävnad. I detta skede och i senare skede embryon (E15.5 E17.5), var dermis också bort för att maximera andelen skelett erhållas muskelceller. (B) Inställning av primär Explantation kulturer i en 96-brunnar. Varje embryo användes för att producera en platta som framgår ovan. Vanlig praxis är att plattan replikat av tre separata embryon (tre plattor = 180 brunnar) för att upprätta utväxt priser.

Figur 3. Embryonala primära Explantation kulturer var fick vid 3, 7, 14 och 21 dagar av kultur och tilldelas en representativ utväxt nivå sammanflöde nivå. (AE) C57BL10 E15.5 primära embryonala Explantation kulturer färgats med Myf-5 för att illustrera 0 14% (); 15 24% (+), 25 49% (+), 50 74% (++); 75 100% ( + + +) nivåer av sammanflöde. Andelen brunnar som visar varje nivå av utväxt (varje dag att göra mål) var multipliceras med ett godtyckligt antal (= 1, (+) = 2, + = 3, + + = 4 och + + + = 5) innan sammanställa uppgifter att ge en slutlig utväxt värde. Cirka 85% av vildtyp (C57BL/10) primära eSMSc fläcken för skelettmuskulaturen cellen markör Myf-5. Förstoringen är 10. (F) Etablerad embryonala kulturer har de morfologiska egenskaperna hos vuxna SMSC, bipolär celler (lilla pilen) och sfäriska monomorf celler (stor pil). (G) Identifiering av fragmentering apoptotiska cellkärnor med DAPI färgning. (HI) Höga nivåer (~ 75%) av transfektion av en GFP-uttryckande bygga in SMS cellinjer använda optimerade Lipofectamine 2000 transfektion metod. (I) Räkning av det totala antalet celler är hjälpt av DAPI kontrastfärgning. RNAi med pSHAGshRNAigfp (JM) avskaffas GFP uttryck i SMSC (se (29) För ett exempel på denna konstruktion används som kontroll). (J) Control (mock transfektion) som visar GFP uttryck i en GFP SMSC linje. (K) DAPI kontroll . (L) shRNAiGfp 24 h efter transfektion. (M) DAPI kontroll för shRNAiGfp transfekterade celler i (L).

Figur 4. Dystrofisk, embryonala Myf5-positiva myoblast är hyperproliferative och benägna att apoptos. (A) utväxt graden av embryonala myoblasts från muskel Explantation kultur is ökade både i MDX mutanter från E11.5 och i CAV-3 (-/-) mutanter vid E15.5 och E17.5 i jämförelse med WT explants odlade parallellt. (B) A Myf5-immunostained Explantation. (C) hyperproliferation av embryonala myoblasts i MDX mutanter från E11.5 och i CAV-3 (-/-) mutanter från E15.5, som bestäms av Ki67-positiv immunreaktivitet (D). (E) Förhöjda apoptos från E11.5 i mdx embryon och från E15.5 i CAV-3 (-/-) embryon, vilket framgår av DAPI färgning (F); pilen i F pekar på en apoptotiska celler. * P <0,05 jämfört med WT, ** p <0,01 jämfört med WT, * p <0,05 vid jämförelse MDX med CAV-3 (-/-) (G, H) E15.5 primära odlade WT embryonala myoblasts med Myf5 färgning. (G) och en andra antikropp-kontroll (H). (I) utväxt andelen E11.5 WT explants ökat (* p <0,05) i E11.5 MDX Explantation med luftkonditionering medium (CM), men inte i CAV-3 (-/-) eller WT CM. Felstaplar visar sd Denna siffra återges i författarnas upphovsrätt och publicerades först av bolaget av biologer i Merrick et al. 2009.

6. Anteckningar: kritiska moment och möjliga ändringar

1. När tinade celler har fäst vid mycket låga celltäthet är det klokt att byta ut bara hälften mediet för att förhindra kulturen krascha.
2. SMSC isolerade från dystrofa muskler är känsliga för apoptos och måste behandlas med särskild omsorg. Dystrofisk SMSC (t.ex. DFD-13 cellinje, som grundades av skelettmuskulatur från 5-veckor gamla dystrofa (MDX) möss) bör odlas på högre cell densitet än vanligt för myoblasts. Sådana apoptos-känsliga cellinjer är också frysförvarade vid högre densitet (se avsnitt 1.1 och 1.2) (19).
3. En alternativ metod för att avlägsna celler från en monolager använder dispase, vilket ger en mjukare metod för cell dissociation, med den fördelen att den kan utföras i närvaro av FCS och kalcium (båda finns i DF10). Dispase kan därför användas för att subkultur och expandera primär skelett kulturer muskler Explantation och earlystage SMSC kloner (se avsnitt 2 och 3).
4. För större flaskor mängden trypsin / EDTA används bör ökas enligt följande: 75 mm ^2-kolv (3 ml trypsin) och 175 mm ² kolven (5 ml trypsin). Likaså för mindre ytor minska mängden trypsin används (se tabell 1).
5. Alternativt kan dissociation övervakas med ett inverterat mikroskop, detta rekommenderas för nybörjare.
6. Frysförvaring av cellinjer är oftast utförs med ett konfluenta stor (175 mm ²⁾ plast-fartyg. Mellan 7 och 9 cryovials kan erhållas från ett så stort fartyg, beroende på överlevnad profil cellinje som frysförvarade. Primär kulturer och nyetablerade cellinjer är ofta mycket eldfast frysa förfaranden. För att förbättra återhämtning och framgång frysa ner sådana celler två metoder kan användas (separat eller i kombination). (A) FCS innehåll fryser ner blandningen kan ökas från 10% (till maximalt 50%). (B) fryser ner processen kan bromsas genom att placera cryovials i gasfasen för N2 för 12-24 timmar innan du överför injektionsflaskor som den flytande fasen.
7. Ett bekvämt sätt att kontrollera fast infästning av haemacytometer täckglas är att leta efter Newtons Ringar (rainbow reflektioner i glaset) på täckglas eller alternativt att hålla haemacytometer upp och ned över en öppen hand.
8. En variant av Explantation metoden kan användas för kortsiktiga kulturer för användning i immunohistokemi, spridning eller apoptos analyser. Microdissected explants placeras på glaset med 8-brunnars kammare diabilder. En alternativ metod är att använda 9 mm ² täckglas placeras i 24-brunnars plattor. I båda fallen två explants överförs till varje brunn i 150 mikroliter DF20 medium. Alternativt kan primärkulturer skall omodlas av dispase metoden och klädd ut på täckglas placeras i 24-brunnars plattor eller direkt i 8-brunnars kammare diabilder.
9. För kvantitativ analys av utväxt skattesatser minst 60 brunnar med en Explantation per är väl etablerade, per muskel / musstam. Att etablera tillväxt parametrar för en stam minst tre separata djur måste användas. Plattor och enskilda brunnar är inte matas under utväxt är poäng.
10. För kloning av etablerade SMSC linjer räcker till kultur enskilda celler i en 1:1 blandning av konditionerat medium och DF10 medium. För primära explants är det nödvändigt att höja serum innehållet i substratet till 20%.
11. Colchicin är mycket giftigt och cancerframkallande och bör hanteras med försiktighet. Dubbla handskar och arbeta i ramarna för en utsedd fack är viktigt. Allt engångsmaterial (dvs Gilsontips) placeras i en bägare av blekmedel (5% natriumhypoklorit) över natten innan den kasseras med rikliga mängder vatten följan-wing dag.
12. Vi använder för närvarande primära antikroppar som är specifika för Ki67 och Myf-5 vardera 1 / 1, 000 utspädning. Den optimala utspädning för primära antikroppar behöver upprättas empiriskt för varje antikropp som ska användas och helst även för olika partier av samma antikroppar, även om från samma källa.
13. Avdelningen diabilder kan också användas för denna analys. Innan du fäster celler i 4% PFA är odlingsmedium bort och cellerna tvättas två gånger med 37 ◦ C sterila PBS. Den väl kammare, är packning och lim bort och glaset glider placeras i en 50 ml glasflaska Coplin burk innehåller nyberedd 4% paraformaldehyd i rumstemperatur, som sedan försiktigt gungade på en Gyro-Rocker R_ shaker i 25 min. Bilderna är sedan tvättas två gånger i PBS (rumstemperatur) och antingen användas direkt eller lagras i PBS vid 4 ◦ C (kort sikt, 1-2 veckor) för immunhistokemisk (IHC) analyser.
14. Om mer omfattande myotube bildas krävs primära skelettmuskelceller kan differentieras för upp till 8 dagar.

Discussion

Microdissected Explantation kulturer kan användas för att tillförlitligt och reproducerbart isolera cellpopulationer som innehåller en mycket hög andel (~ 85%) av proliferativ Myf-5 positiva skelettmuskulaturen stamceller (SMSC). Enligt rigoröst kontrollerade kultur villkor som beskrivs här primära Explantation kulturer kan användas för att karaktärisera tillväxten beteenden av genetiskt muterade mus SMSC och kan användas som en metod för att generera myotubes för detaljerad in vitro-analys av differentiering processer. Noggrann underhåll och hantering av dessa kulturer gör långtidsodling och expansion. Hjälp av de metoder som beskrivs här är det också möjligt att härleda klonal skelettmuskulaturen stamcellslinjer från Explantation kulturer med hjälp av en enda cell utspädning. För att uppnå spridning av isolerade enskilda celler under kloning förfarandet, "under förutsättning medium" används för att efterlikna den normala kravet på dessa celler för hög densitet kultur. Metoden kan användas (med ändringar) för att embryonala, vuxna och äldre-vuxna vävnader och vid sidan av musen kan användas för att isolera celler från skelettmuskulaturen av andra arter, inklusive människan (Rao och Smith, opublicerad), kycklingembryo och fisk ( lax) ^24. Kloner som härrör SMSC kan analyseras in vivo genom intramuskulär transplantation och under dessa villkor injiceras SMSC kommer att kombinera med värd myotubes att bilda hybrid muskelfibrerna. Intramuskulärt injiceras SMSC inte bildar tumörer och har hittats i värd muskler i satelliten cellen positionen mer än ett år efter injektion, vilket tyder på att de är föremål för endogena kontroll av satelliten niche.These stamceller celler kan återanvändas isoleras från injicerade värdar som proliferativ SMSC mer än 12 månader efter värd injektion ^19.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM/F12 1:1 mix	Sigma-Aldrich		Liquid medium: (Dulbecco’s Modified Eagles’s medium and Ham’s F12 medium, 1:1 v/v)
100× Glutamine (200mM)	Sigma-Aldrich		Diluted in medium to a 1× concentration of 2 mM (Glutamine HYBRI-MAX R)
Fetal calf serum (FCS)	From a number of different companies		Batch tested on primary cultures and skeletal muscle cell lines. 10-20% supplement to liquid media
Heraeus Labofuge 300	Heraeus Instruments		Lab centrifuge capable of reaching 1,000 rpm
15 ml Falcon centrifuge tubes	Fisher Scientific		Must fit lab centrifuge
Tissue culture plasticware (25, 75 or 175 mm2 tissue culture vessels; 96-well tissue culture plates. 60 mm Petri dishes).	Nalge Nunc international
Humidified CO2 incubator (Heraeus)	Heraeus Instruments		Ours is copper lined, recommended for reducing contamination
Sterile hood with laminar air flow (Heraeus)	Heraeus Instruments		Ours is a Class II hood – suitable for use with Human tissues
Water Bath	Grant Equipment		Maintained always at 37°C
Inverted microscope	Leica Microsystems
70% Ethanol			For sterilization (animals, dissection instruments) and swabbing benches, hood, etc.
Calcium- and magnesium-free phosphate-buffered saline (PBS)	Sigma-Aldrich		Cell culture-tested PBS (Dulbecco’s formula) is purchased as a ready-mixed powder or in tablet form and made up with doubledistilled water before sterilization by autoclave. PBS consists of 2.68 mM potassium chloride (KCl); 1.47 mM potassium phosphate monobasic (KH2PO4); 0.137 M sodium chloride (NaCl); and 8.1 mM sodium phosphatedibasic (Na2HPO4). PBS can be prepared from scratch as follows: 200 mg KCl, 200 mg KH2PO4, 8 g NaCl and 1.15 g Na2HPO4/l of double-distilled water followed bysterilization by autoclave.
CryoTube vials	Nalge Nunc international
A Neubauer haematocytometer and coverslips	Fisher Scientific		For estimating cell counting
Hand counter	Fisher Scientific
Dissection microscope, Zeiss Stemi 1000	Carl Zeiss, Inc.		For preparation of explants
Small sterile hood
Sterile dissection instruments (including Jeweler’s forceps)			Sterilised by autoclave
Sterile plastic collecting vessels (7 ml bijou tubes or 20ml universals)	Nalge Nunc international
Warm PECM	Sigma-Aldrich		Made up in the sterile hood and warmed to 37°C in the tissue culture waterbath. DMEM:F-12 supplemented with 20% FCS, 1% glutamine and + 1% penicillin & streptomycin solution
Dispase (50 μg/ml, equivalent to 6 units/mg)	Available from MP Biomedicals, UK
10 μg/ml 4_,6 Diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride (DAPI).	Sigma-Aldrich		For microscopic visualization of apoptosis and mitosis
Vectashield fluorescent mounting fluid	Vector Laboratories
Fluorescent upright microscope with ultraviolet filter (we use a Nikon Eclipse E600)	Nikon Instruments
Digital camera and imaging software (we use a Nikon Coolpix 995 camera; A Nikon D3 camera	Nikon Instruments
OpenLab4.0a software	PerkinElmer, Inc.
Photoshop CS4	Adobe