פרוטוקול זה מתאר כיצד הכרומטין immunoprecipitation (שבב) משמש ללימוד שינויים דינאמיים לתבנית הכרומטין המווסתים את שעתוק המושרה על ידי במסלול הולכת אותות.
Abstract
בתגובה במגוון ligands תאית, STAT (מתמר אותות activator של שעתוק) גורמי תעתוק מגויסים במהירות ממצב רדום בציטופלסמה שלהם על פני הקולטנים בתא שבו הם מופעלים על ידי זרחון על שיירי טירוזין יחיד 1. לאחר מכן הם dimerize ו translocate לגרעין לכונן שעתוק של גני מטרה, להשפיע, צמיחה בידול, הומאוסטזיס ואת התגובה החיסונית. באופן לא מפתיע, בהתחשב מעורבות נרחבת שלהם תהליכים בתא נורמלי, dysregulation של הפונקציה STAT תורם למחלות האדם, במיוחד סרטן מחלות אוטואימוניות 2 ו 3.
היא מבוססת היטב כי שעתוק מווסתת על ידי שינויים לתבנית הכרומטין 4,5. שינויים אלה כוללים את הפעילות של ה-ATP תלוי קומפלקסים, כמו גם השינויים היסטון קוולנטיים ו מתילציה בדנ"א 6. בגלל הפעלת STAT של ביטוי גנים הוא גם מהיר חולף, זה דורש מנגנונים ספציפיים עבור התבנית ויסות הכרומטין ב STAT תלויי לוקוסים גן. כדי להגדיר מנגנונים אלה, אנו לאפיין את השינויים היסטון והפעילות האנזימטית שיוצרים אותם לוקוסים גן להגיב איתות STAT. פרוטוקול זה מתאר הכרומטין immunoprecipitation, שיטה כי הוא בעל ערך לחקר STAT איתות הכרומטין ביטוי גנים מופעלים.
Protocol
תכנון יום לפני ניסוי השבב המתוכנן, התאים צריכים להיות מתורבת, כך מספר מספיק זמין. נניח כי כל CHIP assay ידרוש ~ 1-1.5 7 x 10 תאים. תמיד מתכנן לעשות הן שליליות (IgG) חיובי (נוגדן היסטון מחבת) בקרות ניסויים כפולים. עצה – עבור תאים …
Discussion
פרוטוקול שבב התווה שימש בהצלחה במעבדה כדי assay יותר מעשרים שינויים היסטון אחרת. בנוסף, יש לנו מאופיין בשינויים התפוסה של גורמי שעתוק, היסטון, שינוי אנזימים, חלבונים המזהים שינויים היסטון ואת השנייה RNA פולימראז מכונות שעתוק, בכמה IFN-γ גנים המושרה. השתמשנו גם את ההליך כדי …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכת על ידי אוניברסיטת וירג'יניה, אוניברסיטת וירג'יניה Cancer Center ו פ תומאס קייט מילר Jeffress הזיכרון אמון. אנו מודים E. ג'יימס דרנל מעבדה (אוניברסיטת רוקפלר) רוס רוברט לאב (אוניברסיטת פורדהם) של שורות תאים.
Buro, L. J., Shah, S., Henriksen, M. A. Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells. J. Vis. Exp. (41), e2053, doi:10.3791/2053 (2010).