Summary
Questo protocollo descrive come immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) è usato per studiare le alterazioni dinamiche al modello cromatina che regolano la trascrizione indotto da una via di trasduzione del segnale.
Abstract
In risposta ad una varietà di ligandi extracellulari, la STAT (trasduttori di segnale e attivatore della trascrizione) fattori di trascrizione sono rapidamente reclutati dal loro stato latente nel citoplasma ai recettori della superficie cellulare dove vengono attivati da fosforilazione in un singolo residuo tirosina 1. Poi dimerizzano e traslocare al nucleo di guidare la trascrizione dei geni bersaglio, incidono sulla crescita, differenziamento, l'omeostasi e la risposta immunitaria. Non sorprende, dato il loro coinvolgimento nei processi di diffusione delle cellule normali, disregolazione della funzione STAT contribuisce alla malattia umana, in particolare per i tumori 2 e malattie autoimmuni 3.
E 'ben noto che la trascrizione è regolata da alterazioni al modello cromatina 4,5. Queste alterazioni includono le attività di ATP-dipendente complessi, così come modifiche covalenti degli istoni e la metilazione del DNA 6. Poiché l'attivazione STAT dell'espressione genica è sia rapido e transitorio, richiede meccanismi specifici per la modulazione del modello cromatina a STAT-dipendenti loci genici. Per definire questi meccanismi, ci caratterizzano le modificazioni degli istoni e le attività enzimatiche che li generano a loci genici che rispondono alle STAT segnalazione. Questo protocollo descrive immunoprecipitazione della cromatina, un metodo che è prezioso per lo studio di STAT segnalazione alla cromatina nell'espressione genica attivata.
Protocol
PIANIFICAZIONE
Il giorno prima di un esperimento di ChIP è previsto, le cellule devono essere coltivate in modo che un numero sufficiente è disponibile. Si supponga che ogni saggio ChIP richiederà ~ 1-1,5 x 10 7 cellule. Sempre intenzione di fare sia il negativo (IgG) e positivo (pan anticorpi istoni) controlla e ripetizione degli esperimenti.
Suggerimento - Per le celle 2FTGH, ogni saggio ChIP richiede circa un 15 centimetri di tessuto piatto cultura al 80% confluenza.
PARTE 1: PREPARAZIONE ED A SVOLGERE CROMATINA ChIP
- Rimuovere i supporti della cultura e indurre le cellule per i tempi richiesti con 20 ml di 10% siero di vitello cosmica (CCS) / DMEM contenente IFN-gamma a 5 ng / ml. Sostituire i supporti sui piatti uninduced con 20 ml di 10% CCS / DMEM pure.
- In una cappa aspirante, aggiungere 540 microlitri di formaldeide 37% a 20 mL di media (1% di concentrazione finale) nel piatto 15 cm.
Suggerimento - piastra Tilt e aggiungere la formaldeide al pool di supporti - poi placca rocciosa a diffondersi in modo uniforme. - Lasciare reticolazione a procedere per 10 minuti a temperatura ambiente.
- Aggiungi glicina a 0,125 M concentrazione finale per fermare reticolazione.
- Aspirare il vuoto dei media e lavare le cellule una volta con 10 ml di fosfato ghiacciata soluzione salina tamponata (PBS).
- Raccogliere le cellule con un raschietto cellula ~ 7 ml di PBS e combinare le cellule (da 6 piastre) che sono stati trattati in modo identico in tubo da 50 ml su ghiaccio.
- Centrifuga (Beckman Coutler Allegra 12-R centrifuga) a 1800 rpm a 4 ° C per 5 minuti e aspirare il PBS.
Suggerimento - Snap congelare il pellet se fermarsi qui e conservare a -80 ° C. - Risospendere il pellet in 4 mL di tampone gonfiore (25 HEPES mM pH 7,8, 1,5 mM MgCl 2, 10 mM KCl, 0.1% NP40. Aggiungere 1 mM DTT, gli inibitori della proteasi completa e freddo sul ghiaccio prima dell'uso) e trasferimento a 15 mL tubo conico.
Suggerimento - Questo volume tampone gonfiore è appropriato per un piatto 6 pooling (~ 6-9 x 10 7 cellule). Tampone più o meno potrebbe cambiare l'efficienza douncing. - Incubare la sospensione cellulare in ghiaccio per 10 minuti.
- Trasferire la sospensione per un pre-raffreddata 15 ml douncer (Wheaton) e dounce 20 colpi di pestello A.
- Trasferimento dounced cellule di nuovo ad un tubo da 15 ml su ghiaccio.
- Centrifugare a 2500 rpm per 5 minuti a 4 ° C e scartare il surnatante.
- Risospendere il pellet nucleare (~ 200 ul da 6 piastre) in 3 ml (15 volumi pellet) di tampone di sonicazione (50 mM HEPES pH 7,9, 140 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Triton X-100, desossicolato di sodio 0,1%, 0,1% SDS. Aggiungi inibitori della proteasi completa e chill sul ghiaccio al momento dell'uso).
Suggerimento - Questo volume tampone sonicazione è appropriato per un piatto 6 pooling (~ 6-9 x 10 7 cellule). Tampone più o meno potrebbe cambiare l'efficienza sonicazione. - Sonicare sospensione nuclei in ghiaccio per 10 cicli (20 secondi on/40 secondi dal / ampiezza impostazione di 8) usando un Sonicator Misonix 3000 equipaggiato con il microtip. Questo genere si traduce in frammenti di cromatina media 200-1000 bps nel formato.
Suggerimento - Perché sonicatori varierà, l'efficienza sonicazione deve essere determinata empiricamente. Per fare questo, prendete aliquote di 20 l sonicazione prima e dopo ogni ciclo di sonicazione. Calore questi campioni a 65 ° C per 4 ore. Aggiungi il caricamento del buffer del DNA e pilotare un 1% di agarosio / TBE gel per visualizzare frammenti di DNA.) - Trasferimento sonicato materiale da un tubo SS34 centrifuga e centrifugare per 20 minuti a 4 ° C a 13000 rpm in un rotore SS34 (Sorvall RC6 Inoltre centrifuga) per far sedimentare ciò che è di solito una piccola quantità di detriti cellulari.
- Con attenzione trasferire il sopranatante in una provetta da 15 ml conica sul ghiaccio.
- Pre-clear con l'aggiunta di 360 microlitri sperma di salmone DNA / proteina A o G agarosio perle di liquami e dondolo a 4 ° C per almeno 30 minuti.
Suggerimento - Questo passo si riduce il rumore nel saggio che deriva da eventi legame non specifico. - Centrifugare a 1000 rpm a 4 ° C per 5 minuti per far sedimentare le perline agarosio.
- Trasferimento pre-cancellati surnatante in un'altra provetta da 15 ml conica sul ghiaccio.
- Misurare la A260 unità di pre-cancellati cromatina e regolare il volume con tampone di sonicazione di quattro (4) A260 unità (0,2 mg / ml assumendo A260 1 unità = 0,050 mg / ml)
Suggerimento - Per misurare la A260 unità, diluire 10 ml di pre-cancellati cromatina in 190 microlitri DDW; vuoto spettrofotometro con 10 microlitri di buffer sonicazione in 190 microlitri DDW. - Risparmiate il 75 microlitri della cromatina (a 4 A260 unità) come il campione di ingresso e conservare a 20 ° C fino al momento di invertire legami crociati.
Suggerimento - Questo passo è fondamentale per l'analisi dei dati. Non trascurare di prendere il aliquota di ingresso. - Aliquota della cromatina pronto a 1,7 mL microcentrifuga su ice aliquote come 1 ml.
Suggerimento - Se fermarsi qui, a scatto congelare la cromatina preparato in ghiaccio secco e conservare a -80 ° C. NB: cromatina memorizzati possono degradare, producendo risultati non ottimali, in modo da evitare se possibile. - Aggiungere il ChIP-grade anticorpi per i campioni indotto e uninduced set in duplice copia. Aggiungi IgG (2 mg) e fondo di anticorpi istone H3 (15 mL), come i controlli negativi e positivi di indotto e uninduced set di campioni.
Suggerimento - La quantità di anticorpi da utilizzare deve essere determinata empiricamente o vedere la scheda prodotto del fornitore per importi suggeriti. In genere 1-2 mg di un chip di livello anticorpale funziona bene. Il volume appropriato deve essere determinato empiricamente per gli anticorpi che vengono forniti come siero. - Roccia tutti i tubi notte a 4 ° C.
PARTE 2: COLLECT immunocomplessi
- Aggiungere 60 ml di sperma di salmone DNA / proteina A o proteina G agarosio liquami perline di tutti i tubi.
Usa Proteine Suggerimento A per anticorpi policlonali di coniglio e G proteine per gli anticorpi monoclonali murini. - Roccia a 4 ° C per almeno 60 minuti.
- Agglomerare le immunocomplessi (perline agarosio) da microfuging gentilmente a 2000 rpm a 4 ° C per 3 minuti.
- Aspirare il sopranatante.
- Lavare le immunocomplessi con 1 ml di ciascuna delle seguenti tamponi di lavaggio per 10 minuti con dondolo a 4 ° C. Microcentrifuga per 3 minuti a 2000 rpm a 4 ° C tra ogni lavaggio e aspirare il surnatante. Conservare i campioni refrigerata sul ghiaccio. Aggiungi PMSF appena prima dell'uso.
- Sale a basso Wash - 0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-Cl, pH 8.0, 150 mM NaCl, 1 mM PMSF
- Sale alta Wash - 0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-Cl, pH 8.0, 500 mM NaCl, 1 mM PMSF
- LiCl Wash - 0,25 M LiCl, 1% NP-40, desossicolato di sodio 1%, 1 mM EDTA, 10 mM Tris-Cl, pH 8.0, 1 mM PMSF
- Lavare TE - due lavaggi con tampone TE -10 mM Tris-Cl, pH 8.0, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF
- Rimuovere il tampone di lavaggio finale TE e ai talloni, aggiungere 500 microlitri tampone di eluizione (50 mM Tris-Cl, pH 8.0, 10 mM EDTA, 1% SDS).
Suggerimento - Il tampone di eluizione devono essere preparate al momento. - Vortice di mescolare perle di agarosio in tampone di eluizione e calore per 30 minuti a 65 ° C.
Suggerimento - vortice ciascun tubo almeno ogni 10 minuti durante il 30 minuti. - Microcentrifuga per 30 secondi a 2000 rpm e trasferire il eluente in una provetta da microcentrifuga nuovo.
Suggerimento - Durante l'eluizione, scongelare i campioni di ingresso e aggiungere 500 microlitri tampone di eluizione a ciascuno. Includere questi campioni in tutti i passaggi per il futuro. - Aggiungere 5 M di NaCl ad una concentrazione finale di 200 mm a tutti i campioni e vortice.
- Incubare a 65 ° C per una notte (o almeno 4 ore).
PARTE 3: ChIP'd purificare e DNA INGRESSO
- Microcentrifuga tutti i campioni per 30 secondi per la raccolta della condensa sui coperchi.
- Aggiungere 1ml di RNasi A (10 U / mL) a ciascuna provetta ed incubare a temperatura ambiente per 15 minuti.
- Aggiungere 10 L 0,5 M EDTA, 40 microlitri 0,5 M Tris-Cl pH 6,5, 2 microlitri proteinasi K (10 mg / ml) e incubare a 45 ° C per 60 minuti. Suggerimento Preparare una master mix di questi reagenti e aggiungere 52 microlitri per ogni provetta.
- Fenolo / cloroformio / alcool isoamilico estrarre e poi cloroformio / alcool isoamilico estrarre i campioni.
- Aggiungere 2 glicogeno microlitri (25 mg / mL) e 0,1 volumi di acetato di sodio 3M pH 5.2 e vortice.
- Aggiungere 2,5 volumi di etanolo 100% e vortice.
- Incubare a 20 ° C durante la notte.
PARTE 4: ChIP'd purificare e DNA INGRESSO CONTINUATO
- Campioni microcentrifuga per un minimo di 20 minuti a 13000 rpm a 4 ° C per precipitare il DNA / glicogeno pellet.
- Lavare con DNA / glicogeno pellet con 1 ml di etanolo al 70%.
- Aria secca il pellet o rapidamente a secco in centrifuga DNA vuoto velocità Savant.
Suggerimento - Non troppo secco il DNA. - Risospendere DNA / glicogeno pellet in 200 microlitri tampone TE.
- DNA (1 mL) è pronto per la quantificazione tramite real-time PCR. Conservare il DNA rimanente a 20 ° C.
Suggerimento - Utilizzo di più di 1 ml di DNA possono inibire la real-time PCR, in modo da scalare con cautela.
Parte 5: I RISULTATI DI RAPPRESENTANZA:
Campioni di DNA ChIP e ingresso sono quantificati con Real-Time PCR 7,8 (Applied Biosystems 7500 Veloce Real-Time PCR System) utilizzando primers specifici per il locus genico di interesse. Primer che genomica sequenza bersaglio noto per essere arricchito in o privi di modificazioni degli istoni essere analizzati possono essere utilizzati come controlli positivi e negativi. I dati sono presentati come percentuale di ingresso. La procedura di chip dovrebbe essere interamente repeated con tre repliche biologiche per garantire cambiamenti riportati in modificazioni degli istoni sono statisticamente significative.
Ci sono diversi aspetti importanti da considerare quando si utilizzano real-time PCR per quantificare il DNA, compresa la progettazione primer, l'efficienza della PCR, e il modo appropriato per calcolare la percentuale di procedure di ingresso e di normalizzazione. Quando il profiling di occupazione degli istoni modifica attraverso un gene, l'efficienza della PCR devono essere coerenti tra tutte le coppie di primer. Il real-time PCR produttore del sistema in grado di fornire le informazioni necessarie e di formazione.
La figura 1 mostra i risultati rappresentante della cromatina durante immunoprecipitato STAT1 l'attivazione del gene IRF1 9, innescato da IFN-γ.
Figura 1. Occupazione di STAT1, RNA polimerasi II e H3K36me3 è dinamico durante STAT1 attivazione del gene IRF1. (A, B, C) ChIP con α-H3K36me3, α-STAT1 e α-Pol II della cromatina delle cellule raccolte da 2FTGH indotta con IFN-γ per 30 minuti (quadrati rossi), 1,5 ore (cerchi blu), 5 ore ( triangoli verdi) o uninduced (diamanti neri). IgG è il controllo negativo (grigio croci). (D) Pan H3 è un controllo positivo e mostra l'occupazione degli istoni attraverso il locus in indotta (cerchi blu) e le condizioni uninduced (diamanti neri). Il tuffo il -5 bp è dovuto all'esaurimento nucleosoma che si trova nei siti di inizio della trascrizione.
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Discussion
Il protocollo ChIP delineato è stato utilizzato con successo in laboratorio per analisi più di venti differenti modificazioni degli istoni. Inoltre, abbiamo caratterizzato i cambiamenti nella occupazione dei fattori di trascrizione, enzimi che modificano gli istoni, proteine che riconoscono modificazioni degli istoni e la RNA polimerasi II macchinario di trascrizione, in diverse IFN-γ geni indotti. Abbiamo anche utilizzato la procedura per caratterizzare cambiamenti modificazioni degli istoni durante la differenziazione di una cellula staminale del cancro 10.
La qualità dei dati ChIP dipende in ultima analisi sulla efficacia dell'anticorpo utilizzato e non vi è una notevole variabilità tra anticorpi. La mancata ChIP una modifica, quindi, non può essere interpretata nel senso che ha detto la modifica non è presente. Inoltre, i cambiamenti in una modifica particolare osservato in un esperimento di ChIP può semplicemente riflettere un cambiamento nel riconoscimento dei epitopo dagli anticorpi causati da ulteriori modificazioni degli istoni a residui nelle vicinanze. Pertanto, i risultati chip deve essere convalidato con approcci che riguarderanno i cambiamenti osservati in una modificazione degli istoni ad un risultato biologico. Quando questo è fatto, ChIP è un potente mezzo per studiare cromatina a base di meccanismi che contribuiscono alla regolazione dell'espressione genica.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Questo lavoro è supportato dall'Università della Virginia, l'Università della Virginia Cancer Center e The F. Thomas e Kate Miller Jeffress Memorial Trust. Ringraziamo il James E. Darnell Lab (Rockefeller University), Robert Ross Lab (Fordham University) per linee cellulari.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 37% Formaldehyde | Fisher Scientific | BP531-500 | |
| Chloroform/Isoamyl alcohol | Acros Organics | AC32715-5000 | |
| Complete Mini Protease Inhibitors | Roche Group | 1836153 | |
| Cosmic Calf Serum | Hyclone | SH30087.04N | |
| DMEM | Hyclone | SH30243 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP118-500 | |
| Ethanol | Pharmco Products, Inc. | zp1110EP | |
| Glycine | Roche Group | 100149 | |
| Glycogen | Roche Group | 901393 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3784 | |
| IFN-gamma | R&D Systems | 285-IF-100 | |
| IgG | Jackson ImmunoResearch | 109-005-003 | |
| KCl | MP Biomedicals | ||
| LiCl | Sigma-Aldrich | L4408 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Sodium Acetate | Fisher Scientific | BP333-500 | |
| Deoxycholic Acid Sodium Salt | Fisher Scientific | BP349-100 | |
| NaCl | Fisher Scientific | 7647-14-5 | |
| NP40 | US Biological | N3500 | |
| Anti-Histone H3, CT, pan | EMD Millipore | 07-690 | |
| Phenol/chloroform/isoamyl | Fisher Scientific | 108-95-2 | |
| Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | 7647-14-5 | |
| PMSF | EMD Millipore | 50-230-0316 | |
| Proteinase K | 5 PRIME | 2500140 | |
| RNAse A | 5 PRIME | 2500130 | |
| Salmon Sperm DNA/Protein A Agarose | EMD Millipore | 16-157 | |
| Salmon Sperm DNA/Protein G Agaorse | EMD Millipore | 16-201 | |
| SDS | Fisher Scientific | BP166-500 | |
| Tris-Cl | Sigma-Aldrich | T5941 | |
| Triton X-100 | Acros Organics | 327372500 | |
| Anti-K36me3 | Abcam | ab9050 | |
| Anti-STAT1 | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-345X | |
| Anti-RNA Polymerase II | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-899 |
References
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