Summary
Este protocolo descreve como imunoprecipitação da cromatina (chip) é usado para estudar as alterações dinâmicas ao modelo de cromatina que regulam a transcrição induzida por uma via de transdução de sinal.
Abstract
Em resposta a uma variedade de ligantes extracelulares, o STAT (transdutor de sinal e ativador de transcrição) fatores de transcrição são rapidamente recrutados a partir de seu estado latente no citoplasma aos receptores da superfície celular, onde elas são ativadas por fosforilação de um resíduo de tirosina único 1. Eles, então, dimerizam e translocar para o núcleo de dirigir a transcrição de genes-alvo, afetando o crescimento, diferenciação homeostase, e da resposta imune. Não é de surpreender, dado o seu envolvimento generalizado nos processos celulares normais, desregulação da função STAT contribui para a doença humana, especialmente para cânceres 2 e doenças auto-imunes 3.
Está bem estabelecido que a transcrição é regulada por alterações ao modelo de cromatina 4,5. Essas alterações incluem as atividades de ATP-dependente complexos, bem como modificações covalentes das histonas e metilação do DNA 6. , Pois a ativação STAT da expressão do gene é rápida e transitória, que requer mecanismos específicos para o modelo modular a cromatina em loci STAT-dependente gene. Para definir esses mecanismos, caracterizamos as modificações das histonas e as atividades enzimáticas que gerá-los em loci de genes que respondem a STAT sinalização. Este protocolo descreve imunoprecipitação da cromatina, um método que é valioso para o estudo de sinalização para STAT cromatina na expressão dos genes ativados.
Protocol
PLANEJAMENTO
Um dia antes de um experimento ChIP está prevista, as células devem ser cultivadas para que um número suficiente disponível. Suponha que cada ensaio ChIP exigirá ~ 1-1,5 x 10 7 células. Sempre planeje fazer ambos os controles negativo (IgG) e positivo (anticorpo pan histona) e as experiências duplicadas.
Dica - Para as células 2FTGH, cada ensaio ChIP requer cerca de 15 centímetros um prato de cultura de tecidos em 80% confluência.
PARTE 1: PREPARE cromatina e PERFORM ChIP
- Remova a mídia de cultura e induzir as células para os tempos necessários com 20 mL de 10% cósmica soro bovino (CCS) / DMEM contendo IFN-gama a 5 ng / mL. Substituir os meios de comunicação sobre as placas uninduced com 20 mL de 10% CCS / DMEM também.
- Em uma capela, adicione 540 mL de formaldeído 37% para 20 mL dos meios de comunicação (1% concentração final) no prato de 15 cm.
Dica - placa Tilt e adicione o formaldeído para o pool de mídia - em seguida, placa de rock a se espalhar uniformemente. - Permitir reticulação para prosseguir por 10 minutos em temperatura ambiente.
- Adicionar glicina a 0,125 M concentração final para parar de reticulação.
- Vácuo aspirar a mídia e lavar as células uma vez com 10 mL de fosfato de gelo frio solução salina tamponada (PBS).
- Coletar células com um raspador de células em ~ 7 mL PBS e combinar células (de 6 placas) que foram tratados de forma idêntica em 50 mL do tubo cônico no gelo.
- Centrifugação (Beckman Coutler Allegra 12-R Centrífuga) a 1800 rpm a 4 ° C por 5 minutos e aspirar o PBS.
Dica - Encaixe congelar o pellet celular se parando aqui e armazenar a -80 ° C. - Ressuspender o pellet celular em 4 mL de buffer Inchaço (25 mM HEPES pH 7,8, 1,5 mM MgCl 2, 10 mM KCl, 0,1% NP40. Adicione 1 mM DTT, os inibidores da protease completa e frio no gelo antes de usar) e transferir para a 15 mL tubo cônico.
Dica - Este volume tampão inchaço é apropriado para uma placa de 6 pooling (~ 6-9 x 10 7 células). Buffer de mais ou menos pode mudar a eficiência douncing. - Incubar a suspensão de células no gelo por 10 minutos.
- Transferência de suspensão para um pré-refrigerados 15 mL douncer (Wheaton) e Dounce 20 cursos com pilão A.
- Transferência dounced células de volta para um tubo cônico de 15 mL no gelo.
- Centrifugar a 2500 rpm por 5 minutos a 4 ° C e desprezar o sobrenadante.
- Ressuspender o pellet nuclear (~ 200 mL de 6 placas) em 3 mL (15 volumes pellet) de tampão de sonicação (50 mM HEPES pH 7,9, 140 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Triton X-100, desoxicolato de sódio 0,1%, 0,1% SDS. Adicionar inibidores da protease completa e frio no gelo pouco antes de usar).
Dica - Este volume tampão de sonicação é apropriado para uma placa de 6 pooling (~ 6-9 x 10 7 células). Buffer de mais ou menos pode mudar a eficiência sonicação. - Sonicate núcleos suspensão em gelo por 10 ciclos (20 segundos on/40 segundos fora amplitude / configuração de 8) usando um sonicador Misonix 3000 equipado com o MICROTIP. Isso normalmente resulta em fragmentos de cromatina média 200-1000 bps em tamanho.
Dica - Como sonicators irá variar, a eficiência sonicação deve ser determinada empiricamente. Para isso, tomar as alíquotas de 20 mL antes de sonicação e após cada ciclo de sonicação. Calor estas amostras a 65 ° C por 4 horas. Adicionar tampão de carregamento DNA e executar um padrão de 1% gel agarose / TBE para visualizar fragmentos de DNA). - Transferência sonicado material a um tubo de centrífuga SS34 e centrifugar por 20 minutos a 4 ° C a 13000 rpm em um rotor SS34 (Sorvall RC6 Além disso Centrífuga) para pellet o que é geralmente uma pequena quantidade de restos celulares.
- Transferir cuidadosamente o sobrenadante para um tubo cônico de 15 mL no gelo.
- Pré-claro pela adição de 360 mL de esperma de salmão DNA / proteína A ou G agarose slurry contas e balanço a 4 ° C por pelo menos 30 minutos.
Dica - Esta etapa diminui o ruído no ensaio que surge da não-específicos eventos de ligação. - Centrifugar a 1000 rpm a 4 ° C por 5 minutos para agregar as contas de agarose.
- Transferência de pré-limpo sobrenadante para outro tubo cônico de 15 mL no gelo.
- Medir o A260 unidades da cromatina pré-limpo e ajustar o volume com tampão de sonicação para quatro (4) A260 unidades (0,2 mg / mL assumindo uma unidade de A260 = 0,050 mg / ml)
Dica - Para medir o A260 unidades, diluir 10 mL de pré-limpo cromatina em 190 mL DDW; espectrofotômetro em branco com 10 mL tampão de sonicação em DDW 190 mL. - Economize 75 mL da cromatina (em 4 A260 unidades) como a amostra de entrada e armazenar a 20 ° C até que esteja pronto para reverter ligações cruzadas.
Dica - Este passo é crucial para a análise de dados. Não negligencie a tomar a alíquota de entrada. - Alíquota cromatina preparada para 1,7 mL em tubos de microcentrífuga ice como um alíquotas mL.
Dica - Se parar aqui, snap congelar a cromatina preparada em gelo seco e armazenar a -80 ° C. NB: cromatina armazenados podem degradar, produzindo menos do que os melhores resultados, por isso evite se possível. - Adicionar os anticorpos ChIP-grade para as amostras induzido e uninduced conjuntos em duplicata. Adicionar IgG (2 mg) e anticorpo pan H3 Histone (15 mL), como os controles positivos e negativos para conjuntos induzido e uninduced amostras.
Dica - A quantidade de anticorpos para o uso deve ser determinada empiricamente, ou ver a folha do fornecedor do produto para quantidades sugeridas. Tipicamente 1-2 mg de um anticorpo ChIP-grade funciona bem. O volume apropriado deve ser determinado empiricamente para anticorpos que são fornecidos como soro. - Rocha todos os tubos durante a noite a 4 ° C.
PARTE 2: COLLECT imunocomplexos
- Adicionar 60 mL de esperma de salmão A ou proteína G DNA / Protein agarose slurry contas em todos os tubos.
Proteína Use Uma dica para o coelho e anticorpos policlonais G proteína de anticorpos monoclonais de rato. - Rocha a 4 ° C durante pelo menos 60 minutos.
- Pellet a imunocomplexos (contas de agarose) por microfuging delicadamente a 2000 rpm a 4 ° C por 3 minutos.
- Aspirar o sobrenadante.
- Lavar os imunocomplexos com 1 mL de cada um dos Buffers Wash seguintes por 10 minutos com balanço a 4 ° C. Microcentrífuga por 3 minutos a 2000 rpm a 4 ° C entre cada lavagem e aspirar o sobrenadante. Manter as amostras refrigeradas em gelo. Adicionar PMSF pouco antes de usar.
- Lavar Sal baixo - 0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-Cl, pH 8,0, 150 mM NaCl, 1 mM PMSF
- Lavar Sal alta - 0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-Cl, pH 8,0, 500 mM NaCl, 1 mM PMSF
- LiCl Wash - 0,25 M LiCl, 1% NP-40, desoxicolato de sódio 1%, 1 mM EDTA, 10 mM Tris-Cl, pH 8,0, 1 mM PMSF
- TE Wash - duas lavagens com tampão TE -10 mM Tris-Cl, pH 8,0, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF
- Remova o tampão de lavagem final, TE e para as contas, adicionar 500 mL de buffer de eluição (50 mM Tris-Cl, pH 8,0, 10 mM EDTA, SDS 1%).
Dica - O tampão de eluição deve ser preparada imediatamente. - Vortex para misturar contas agarose em tampão de eluição e calor durante 30 minutos a 65 ° C.
Dica - vórtice cada tubo, pelo menos, a cada 10 minutos durante este 30 minutos. - Microcentrífuga por 30 segundos a 2000 rpm e transferir o eluente a um tubo de microcentrífuga novo.
Dica - Durante a eluição, descongelar as amostras de entrada e adicionar 500 mL de buffer de eluição a cada um. Incluir essas amostras em todas as etapas daqui para frente. - Adicionar 5 M NaCl para uma concentração final de 200 mM para todas as amostras e vortex.
- Incubar a 65 ° C durante a noite (ou pelo menos 4 horas).
PARTE 3: ChIP'd purificar e DNA ENTRADA
- Microcentrífuga todas as amostras por 30 segundos para coletar condensação na tampa.
- Adicionar 1μL de RNAse A (10 U / mL) a cada tubo e incubar à temperatura ambiente por 15 minutos.
- Adicionar 10 mL 0,5 M EDTA, 40 mL 0,5 M Tris-Cl pH 6,5, 2 mL de Proteinase K (10 mg / mL) e incubar a 45 ° C por 60 minutos. Dica Prepare uma mistura mestre destes reagentes e adicionar 52 mL de cada tubo.
- Fenol / clorofórmio / isoamílico extrato de álcool e, em seguida, clorofórmio / álcool isoamílico extrair amostras.
- Adicione 2 mL de glicogênio (25 mcg / mL) e 0,1 volumes de acetato 3M pH 5,2 e Na vortex.
- Adicionar 2,5 volumes de etanol 100% e vortex.
- Incubar a 20 ° C durante a noite.
PARTE 4: ChIP'd purificar e DNA ENTRADA CONTINUAÇÃO
- Amostras de microcentrífuga para um mínimo de 20 minutos a 13000 rpm a 4 ° C para precipitar o DNA / glicogênio pellets.
- Lavar com DNA / glicogênio pellets com 1 ml de etanol 70%.
- Ar seco a pellets ou rapidamente seco em centrífuga a vácuo DNA velocidade Savant.
Dica - Não mais seco do DNA. - Ressuspender DNA / glicogênio pellets em 200 mL de buffer TE.
- DNA (1 mL) está pronto para a quantificação através de PCR em tempo real. DNA loja restantes a 20 ° C.
Dica - Usando mais de 1 mL de DNA pode inibir as reações PCR em tempo real, assim que a escala com cautela.
Parte 5: resultados representativos:
Amostras de DNA ChIP e de entrada são quantificados com o Real-Time PCR 7,8 (Applied Biosystems 7500 Rápido Real-Time PCR System) utilizando primers específicos para o locus do gene de interesse. Primers que seqüência alvo do genoma conhecido por ser enriquecido em falta ou nas modificações das histonas sendo analisadas podem ser usados como controles positivos e negativos também. Os dados são apresentados como percentual de entrada. O procedimento chip deve ser totalmente repeated com três repetições biológicas para garantir mudanças relatadas em modificações das histonas são estatisticamente significativas.
Existem várias questões importantes a considerar quando se usa PCR em tempo real para quantificar DNA, incluindo a concepção primer, eficiência da PCR, ea forma adequada para calcular o percentual de procedimentos de entrada e de normalização. Ao perfil de ocupação de modificação das histonas através de um gene, a eficiência da PCR deve ser consistente entre todos os pares de primers. O real-time PCR fabricante do sistema pode fornecer as informações e treinamento necessários.
A Figura 1 mostra resultados representativos da cromatina durante immunoprecipitated STAT1 ativação do gene IRF1 9, desencadeada por IFN-γ.
Figura 1. Ocupação de STAT1, RNA polimerase II e H3K36me3 é dinâmico durante STAT1 ativação do gene IRF1. (A, B, C) chip com α-H3K36me3, α-STAT1 e α-Pol II da cromatina coletados a partir de células 2FTGH induzida com IFN-γ por 30 minutos (quadrados vermelhos), 1,5 horas (círculos azuis), 5 horas ( triângulos verdes) ou uninduced (diamantes negros). IgG é o controle negativo (cinza cruzes). (D) Pan H3 é o controle positivo e mostra a ocupação das histonas em todo o lugar no induzido (círculos azuis) e as condições uninduced (diamantes negros). O mergulho em torno de -5 pb é devido ao esgotamento nucleosome que é encontrado em locais de início da transcrição.
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Discussion
O protocolo descrito ChIP tem sido usado com sucesso em laboratório para ensaio de mais de vinte diferentes modificações das histonas. Além disso, têm caracterizado as mudanças na ocupação de fatores de transcrição, histonas modificando-enzimas, proteínas que reconhecem modificações das histonas eo RNA polimerase II maquinaria de transcrição, em vários IFN-γ genes induzidos. Temos também o procedimento utilizado para caracterizar as mudanças em modificações das histonas durante a diferenciação de células-tronco de um câncer 10.
A qualidade dos dados do chip, em última análise depende a eficácia do anticorpo utilizado e há considerável variabilidade entre os anticorpos. A falha em um chip de modificação, portanto, não pode ser interpretado como significando que disse modificação não está presente. Além disso, mudanças em uma modificação particular observada em um experimento de chip pode simplesmente refletir uma mudança no reconhecimento do epítopo pelo anticorpo adicionais causados por modificações na histona resíduos nas proximidades. Portanto, os resultados devem ser validados ChIP com abordagens que relacionam as mudanças observadas em uma modificação da histona a um resultado biológico. Quando isso é feito, ChIP é uma maneira poderosa para estudar mecanismos baseados cromatina que contribuem para a regulação da expressão gênica.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Este trabalho é apoiado pela Universidade de Virginia, a Universidade de Virginia Cancer Center e The Thomas F. Miller e Kate Jeffress Memorial Trust. Agradecemos ao James E. Darnell Lab (Rockefeller University), a Robert Ross Lab (Fordham University) para linhas de celular.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 37% Formaldehyde | Fisher Scientific | BP531-500 | |
| Chloroform/Isoamyl alcohol | Acros Organics | AC32715-5000 | |
| Complete Mini Protease Inhibitors | Roche Group | 1836153 | |
| Cosmic Calf Serum | Hyclone | SH30087.04N | |
| DMEM | Hyclone | SH30243 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP118-500 | |
| Ethanol | Pharmco Products, Inc. | zp1110EP | |
| Glycine | Roche Group | 100149 | |
| Glycogen | Roche Group | 901393 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3784 | |
| IFN-gamma | R&D Systems | 285-IF-100 | |
| IgG | Jackson ImmunoResearch | 109-005-003 | |
| KCl | MP Biomedicals | ||
| LiCl | Sigma-Aldrich | L4408 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Sodium Acetate | Fisher Scientific | BP333-500 | |
| Deoxycholic Acid Sodium Salt | Fisher Scientific | BP349-100 | |
| NaCl | Fisher Scientific | 7647-14-5 | |
| NP40 | US Biological | N3500 | |
| Anti-Histone H3, CT, pan | EMD Millipore | 07-690 | |
| Phenol/chloroform/isoamyl | Fisher Scientific | 108-95-2 | |
| Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | 7647-14-5 | |
| PMSF | EMD Millipore | 50-230-0316 | |
| Proteinase K | 5 PRIME | 2500140 | |
| RNAse A | 5 PRIME | 2500130 | |
| Salmon Sperm DNA/Protein A Agarose | EMD Millipore | 16-157 | |
| Salmon Sperm DNA/Protein G Agaorse | EMD Millipore | 16-201 | |
| SDS | Fisher Scientific | BP166-500 | |
| Tris-Cl | Sigma-Aldrich | T5941 | |
| Triton X-100 | Acros Organics | 327372500 | |
| Anti-K36me3 | Abcam | ab9050 | |
| Anti-STAT1 | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-345X | |
| Anti-RNA Polymerase II | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-899 |
References
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