Summary
Bu protokol, kromatin immunoprecipitation (ChIP) bir sinyal iletim yolu ile indüklenen transkripsiyonu düzenleyen kromatin şablon dinamik değişiklikleri incelemek için nasıl kullanıldığını açıklar.
Abstract
STAT (sinyal dönüştürücü ve transkripsiyon aktivatörü) ekstrasellüler ligandların çeşitli yanıt olarak, transkripsiyon faktörleri hızla onlar tek bir tirozin kalıntısı 1 fosforilasyon ile aktive olan hücre yüzey reseptörleri sitoplazmada gizli devlet işe alınırlar. Daha sonra hedef genlerin transkripsiyon sürücü, büyüme, farklılaşma, homeostazı ve immün yanıtı etkileyen çekirdeği dimerize ve yerini değiştirmek. Beklendiği gibi, normal hücre süreçlerini yaygın tutulum verilen, İST fonksiyonu disregülasyonu özellikle 2 ve otoimmün hastalıklar 3 kanserleri, insan hastalığına katkıda bulunur.
Bu transkripsiyon 4,5 kromatin şablonunda değişiklik tarafından düzenlenir kurulmuştur. Bu değişiklikler, ATP-bağımlı komplekslerinin yanı sıra kovalent histon modifikasyonları ve DNA metilasyon 6 faaliyetleri içerir . STAT aktivasyon gen ekspresyonu hem hızlı ve hem de geçici olduğundan, İST-bağımlı gen lokuslar modüle kromatin şablon için özel mekanizmalar gerektirir. Bu mekanizmalar tanımlamak için, histon modifikasyonları ve enzimatik faaliyetleri STAT sinyalizasyon cevap gen lokuslar onları oluşturmak karakterize eder. Bu protokol kromatin immunoprecipitation, İST aktif gen ekspresyonu kromatin sinyalizasyon çalışması için değerli bir yöntem açıklanmıştır.
Protocol
PLANLAMA
ChIP deney planlanan gün önce, hücrelerin yeterli sayıda kullanılabilir, böylece kültüre olmalıdır. Her ChIP saflık ~ 1-1.5 x 10 7 hücre gerektirdiğini varsayalım. Her zaman negatif (IgG) ve pozitif (pan histon antikor) denetimleri ve yinelenen deneyler yapmak için plan.
İpucu - 2FTGH hücreler için, her ChIP tahlil% 80 confluency yaklaşık 15 cm doku kültürü çanak gerektirir.
BÖLÜM 1: Kromatin HAZIRLANMALI VE UYGULAMAYA ChIP
- Kültür ortamı çıkarın ve 20 ml% 10 kozmik buzağı serumu (CCS) / 5 ng / ml IFN-gamma içeren DMEM gerekli kez hücrelerinin neden. CCS / DMEM yanı sıra% 10 20 ml uninduced plakaları medya değiştirin.
- Davlumbaz, 15 cm çanak medya 20 ml (% 1 final konsantrasyon) 540 mcL% 37 formaldehit ekleyin.
İpucu - Tilt plaka ve sonra ortam havuzu formaldehit - kaya levhası eşit bir şekilde yayılması için. - Crosslinking oda sıcaklığında 10 dakika boyunca devam etmek için izin ver.
- Crosslinking durdurmak için 0.125 M final konsantrasyon glisin ekleyin.
- Medya aspire Vakum ve 10 ml buz gibi fosfat ile hücreler bir kez yıkayın tamponlu salin (PBS).
- ~ 7 mL PBS içinde hücre kazıyıcı ile hücreleri toplamak ve buz üzerinde 50 ml konik tüp içinde aynı tedavi edildi (6 plakalardan) hücreleri birleştirmek.
- 4 1800 devirde santrifüj (Beckman Coutler Allegra 12-R Santrifüj) ° C ve 5 dakika PBS aspirat.
İpucu - Snap donma hücre pelletini buraya durdurma ve -80 saklamak ° C. - 4 mL Şişme Buffer (25 mM HEPES pH 7.8, 1.5 mM MgCl 2, 10 mM KCl,% 0.1 NP40 1 mM DTT, Komple proteaz inhibitörleri ve kullanmadan önce buz üzerinde soğuk ekle) hücre pelletini tekrar ve 15 transfer ml konik tüp.
İpucu - Bu şişme tampon hacmi 6 plaka havuzu (~ 6-9 x 10 7 hücre) için uygun. Daha fazla veya daha az tampon douncing verimliliği değişebilir. - 10 dakika boyunca buz üzerinde hücre süspansiyonu inkübe edin.
- Önceden soğutulmuş 15 mL douncer (Wheaton) süspansiyon transferi ve havaneli A. ile 20 vuruş Dounce
- Transfer buz üzerinde 15 ml konik tüp geri hücreleri dounced.
- 2500 rpm'de 5 dakika Santrifüj 4 ° C ve süpernatantı atmak.
- Sonikasyon Tampon 3 mL nükleer pelet (6 plakaları ~ 200 mcL) (15 pelet hacimleri) (50 mM HEPES pH 7.9, 140 mM NaCl, 1 mM EDTA,% 1 Triton X-100,% 0.1 Sodyum deoksikolatın, yeniden süspanse % 0.1 SDS) kullanımdan hemen önce buz üzerinde komple proteaz inhibitörleri ve soğuk ekleyin.
İpucu - Bu sonication tampon hacmi 6 plaka havuzu (~ 6-9 x 10 7 hücreleri) için uygun. Daha fazla veya daha az tampon sonication verimliliğini değişebilir. - Mikrotip ile donatılmış bir Misonix sonikatör 3000 ile 10 döngü (20 saniye (8) ayarı on/40 saniye açık / kapalı genlik) buz çekirdekleri süspansiyon sonikasyon. Bu genellikle boyutu 200-1000 bps ortalama kromatin parçaları sonuçlanır.
İpucu - sonicators değişir Çünkü, sonication etkinliği deneysel olarak tespit edilmelidir. Bunu yapmak için, her sonication döngüsü sonication önce ve sonra 20 mcL hacimde. Bu örneklerin, 4 saat boyunca 65 ° C'de ısıtın. DNA yükleme tamponu ekleyin ve DNA parçalarının görselleştirmek için bir standart% 1 agaroz / TBE jel çalıştırın.) - Transferi 4, 20 dakika boyunca bir SS34 santrifüj tüpü ve santrifüj malzeme sonicated ° genellikle küçük bir miktar hücre enkaz ne bir SS34 rotor 13000 rpm (Sorvall RC6 Plus, Santrifüj) pelet C.
- Süpernatantı buz üzerinde dikkatlice 15 ml konik tüp transferi.
- 360 mcL Somon Sperm DNA / Protein A veya G agaroz boncuk bulamaç ekleyerek ve en az 30 dakika süreyle 4 ° C'de sallanan Öncesi temizleyin.
İpucu - Bu adım, non-spesifik bağlayıcı olaylar ortaya çıkar tayininde gürültü azalır . - 4 ° C'de 1000 rpm'de 5 dakika pelet agaroz boncuk santrifüjleyin.
- Buz üzerinde başka bir 15 ml konik tüp supernatant önceden temizlenmiş aktarın.
- Önceden temizlenmiş kromatin A260 birimleri ölçün ve dört (4) A260 birimleri 1 A260 birim = 0,050 mg / ml (0.2 mg / ml varsayarak) Sonikasyon Tampon ile ses seviyesini ayarlamak
190 mcL DDW 10 mcL sonication tamponu ile boş spektrofotometre - İpucu A260 birimleri ölçmek için, 190 mcL DDW önceden temizlenmiş kromatin 10 mcL sulandırmak. - Kromatin 75 mcL (4 A260 birimleri) kaydedin Giriş Örnek ve mağaza gibi 20 ° C çapraz bağları tersine çevirmek için hazır olana kadar.
İpucu - Bu adım, veri analizi için çok önemli. Giriş kısım almak için ihmal etmeyin. - I kısım 1.7 ml mikrofuge'de tüpler için hazırlanan kromatince, 1 ml alikotları olarak.
İpucu - burada durma, -80, kuru buz ve mağaza hazırlanan kromatin dondurmak ek bileşenini ° C Not: Eğer mümkünse depolanmış kromatin optimum sonuçlar daha az üreten düşürebilir, bu yüzden önlemek. - Kaynaklı ve uninduced örnekleri ChIP dereceli antikorlar çift ayarlar. Negatif ve pozitif kontrol olarak tetiklenen ve uninduced örnekleri setleri IgG (2 mg) ve pan Histon H3 antikor (15 mcL) ekleyin.
İpucu - antikor miktarı deneysel olarak belirlenen veya önerilen miktarlar için tedarikçinin ürün sayfasına bakınız olmalıdır. Genellikle 1-2 mg ChIP dereceli antikor iyi çalışır. Uygun hacmi, serum olarak verilir antikorları için ampirik olarak tespit edilmelidir. - Rock tüm tüpler gecede 4 ° C
BÖLÜM 2: immün TOPLA
- Tüm tüpler Somon Sperm DNA / Protein veya protein G agaroz boncuk bulamaç 60 mcL ekleyin.
İpucu Kullanım Protein fare monoklonal antikorlar için tavşan poliklonal antikorlar ve Protein G. - 4 ° C'de en az 60 dakika süreyle Rock.
- 2000 rpm'de 4 hafifçe microfuging Pelet immün (agaroz boncuk) ° C, 3 dakika.
- Süpernatant aspire.
- 1 ml, 10 dakika için aşağıdaki Yıkama Tamponlar her ile 4 ° C'de sallanan immün yıkayın 2000 rpm'de 3 dakika mikrofuge'de 4 ° C, her yıkama ve aspirat süpernatant arasında. Buz üzerinde soğutulmuş örnekleri tutun. Kullanımdan hemen önce PMSF ekleyin.
- Düşük Tuz Yıkama -% 0.1 SDS,% 1 Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-Cl, pH 8.0, 150 mM NaCl, 1 mM PMSF
- Yüksek Tuz Yıkama -% 0.1 SDS,% 1 Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-Cl, pH 8.0, 500 mM NaCl, 1 mM PMSF
- LiCl Yıkama - 0.25 M LiCl,% 1 NP-40,% 1 Sodyum deoksikolatın, 1 mM EDTA, 10 mM Tris-Cl, pH 8.0, 1 mM PMSF
- TE Yıkama - TE Tampon -10 mM Tris-Cl, pH 8.0, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF İKİ yıkar
- Son TE Tampon yıkama çıkarın ve boncuklar, 500 mcL Elüsyon Buffer (50 mM Tris-Cl, pH 8.0, 10 mM EDTA,% 1 SDS) ekleyin.
İpucu - Elüsyon Tampon taze hazırlanmış olmalıdır. - 65 az 30 dakika süreyle Elüsyon Tampon ve ısı agaroz boncuk karıştırmak için Vortex ° C
İpucu - Bu 30 dakika boyunca her tüp, en azından her 10 dakikada bir girdap . - 2000 devirde 30 saniye mikrofuge'de ve yeni bir mikrofuge'de boru Eluent transfer.
İpucu - yürütülmesi sırasında, giriş örnekleri Çözülme ve her biri için 500 mcL Elüsyon Tampon ekleyin. Ileriye dönük tüm adımları bu örnekler içerir. - Tüm örnekler ve vorteks 200 mM nihai konsantrasyonu 5 M NaCl ekleyin.
- 65 ° C'de gece (ya da en az 4 saat).
BÖLÜM 3: ISLAH ChIP'd VE GİRİŞ DNA
- Kapakları üzerinde yoğunlaşma toplamak için 30 saniye için tüm örnekler mikrofuge'de.
- 15 dakika oda sıcaklığında inkübe her tüp ve 1μL RNAse A (10 U / ml) ekleyin.
- 10 mcL 0,5 M EDTA, 40 mcL 0.5 M Tris-Cl, pH 6.5, 2 mcL Proteinaz K (10 mg / ml) ekleyin ve 45 ° C'de 60 dakika inkübe edin. İpucu Bu reaktiflerin bir ana karışımı hazırlayın ve her bir tüpe 52 mcL ekleyin.
- Fenol / kloroform / izoamil alkol özü ve kloroform / izoamil alkol sonra numunelerin ayıklayın.
- 2 mcL glikojen (25 mg / ml) ve 3M Na asetat, pH 5.2 ve vorteks 0.1 hacimleri ekleyin.
- 2.5 hacim% 100 etanol ve vorteks ekleyin.
- 20 ° C'de bir gece inkübe edin.
BÖLÜM 4: ISLAH ChIP'd VE GİRİŞ DNA DEVAM
- 4 13000 rpm'de 20 dakika en az mikrofuge'de örnekleri ° C DNA / glikojen pelet çöktürmek için.
- 1 ml% 70 Etanol ile DNA / glikojen pelet ile yıkayın.
- Hava DNA Savant hız vakum santrifüj veya hızlı kuru pelet kurulayın.
İpucu - DNA üzerinde kuru değil. - 200 mcL TE Tampon DNA / glikojen pelet tekrar
- Real-time PCR ile DNA (1 mcL) ölçümü için hazır. 20 Mağaza kalan DNA ° C
İpucu - 1 mcL fazla DNA kullanarak gerçek zamanlı PCR reaksiyonları inhibe edebilir, bu yüzden dikkatli büyütmek.
Bölüm 5: TEMSİLCİSİ SONUÇLAR:
ChIP ve Giriş DNA örnekleri ilgi gen lokusu için spesifik primerler kullanılarak Real-Time PCR 7,8 (Uygulamalı Biyosistem 7500 Hızlı Real-Time PCR Sistemi) ile sayısal. Hedef genom dizisi bilinen zenginleştirilmiş veya test olan histon modifikasyonları eksik o Astarlar, pozitif ve negatif kontrollerin yanı sıra kullanılabilir. Veri Giriş yüzdesi olarak sunulmaktadır. ChIP prosedürü tamamen olmalıdır rüç epeated biyolojik histon modifikasyonları bildirilen değişiklikler istatistiksel olarak anlamlı sağlamak için çoğaltır.
DNA, astar tasarım, PCR verimlilik ve giriş ve normalizasyon işlemleri yüzde hesaplamak için uygun bir yol da dahil olmak üzere ölçmek için gerçek zamanlı PCR kullanarak birçok önemli sorunlar vardır. Histon değişiklik bir gen üzerinde doluluk profil, PCR verimliliği tüm primer çiftleri arasında tutarlı olmalıdır. Gerçek zamanlı PCR sistemi üreticisi, gerekli bilgi ve eğitim sağlayabilir.
Şekil 1 kromatin temsilcisi sonuçlar IFN-γ tarafından tetiklenen IRF1 gen 9 STAT1 etkinleştirme sırasında immunoprecipitated gösterir.
Şekil 1. STAT1, RNA Polimeraz II ve H3K36me3 doluluk IRF1 gen STAT1 etkinleştirme sırasında dinamiktir. (A, B, C), α-H3K36me3, α-STAT1 ve kromatin α-Pol II 2FTGH hücreleri toplanan ChIP, IFN-γ (kırmızı kareler) 30 dakika, 1.5 saat (mavi daireler), 5 saat ( ile indüklenen yeşil üçgenler) veya uninduced (siyah elmas). IgG negatif kontrol (gri çarpılar) (D) Pan H3 pozitif kontrol ve bağlı (mavi daireler) lokus üzerinde histon doluluk ve uninduced koşulları (siyah elmas) gösterir. -5 Bp etrafında dalış transkripsiyon başlangıç siteleri bulunan nucleosome tükenmesi nedeniyle.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ana hatlarıyla ChIP protokol laboratuarda tahlil yirmiden fazla farklı histon modifikasyonları başarıyla kullanılmaktadır. Buna ek olarak, transkripsiyon faktörleri doluluk değişiklikler karakterize, histon değiştirerek birkaç IFN-γ kaynaklı genlerin, histon modifikasyonları ve RNA Polimeraz II transkripsiyon makine kabul enzimler, proteinler. Ayrıca, kanser kök hücre 10 farklılaşması sırasında histon modifikasyonları değişiklikleri karakterize etmek için prosedürü kullandık .
ChIP veri kalitesi sonuçta kullanılan antikor etkinliği bağlıdır ve antikorlar arasında önemli farklılıklar bulunmaktadır. Bu nedenle, bir değişiklik ChIP yetmezliği, bu değişiklik mevcut olmadığını söyledi anlamına yorumlanır olamaz. Ayrıca, belirli bir değişiklik ChIP deneyde gözlenen değişiklikler, sadece yakındaki artıkları ek histon modifikasyonları neden antikor epitop tanınması bir değişiklik yansıtıyor olabilir. Bu nedenle, ChIP sonuçları histon bir değişiklik gözlenen değişiklikler biyolojik bir sonuca ilgili yaklaşımları ile onaylanmalıdır. Bu yapıldığında, ChIP gen ifadesinin düzenlenmesinde katkıda bulunan kromatin tabanlı mekanizmalar çalışmak için güçlü bir yoludur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu çalışma, Virginia Üniversitesi, Virginia Üniversitesi Kanser Merkezi ve Thomas F. ve Kate Miller Jeffress Memorial Trust tarafından desteklenmektedir. James E. Darnell Lab (Rockefeller Üniversitesi) Robert Ross Lab (Fordham Üniversitesi), hücre hatları için teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 37% Formaldehyde | Fisher Scientific | BP531-500 | |
| Chloroform/Isoamyl alcohol | Acros Organics | AC32715-5000 | |
| Complete Mini Protease Inhibitors | Roche Group | 1836153 | |
| Cosmic Calf Serum | Hyclone | SH30087.04N | |
| DMEM | Hyclone | SH30243 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP118-500 | |
| Ethanol | Pharmco Products, Inc. | zp1110EP | |
| Glycine | Roche Group | 100149 | |
| Glycogen | Roche Group | 901393 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3784 | |
| IFN-gamma | R&D Systems | 285-IF-100 | |
| IgG | Jackson ImmunoResearch | 109-005-003 | |
| KCl | MP Biomedicals | ||
| LiCl | Sigma-Aldrich | L4408 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Sodium Acetate | Fisher Scientific | BP333-500 | |
| Deoxycholic Acid Sodium Salt | Fisher Scientific | BP349-100 | |
| NaCl | Fisher Scientific | 7647-14-5 | |
| NP40 | US Biological | N3500 | |
| Anti-Histone H3, CT, pan | EMD Millipore | 07-690 | |
| Phenol/chloroform/isoamyl | Fisher Scientific | 108-95-2 | |
| Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | 7647-14-5 | |
| PMSF | EMD Millipore | 50-230-0316 | |
| Proteinase K | 5 PRIME | 2500140 | |
| RNAse A | 5 PRIME | 2500130 | |
| Salmon Sperm DNA/Protein A Agarose | EMD Millipore | 16-157 | |
| Salmon Sperm DNA/Protein G Agaorse | EMD Millipore | 16-201 | |
| SDS | Fisher Scientific | BP166-500 | |
| Tris-Cl | Sigma-Aldrich | T5941 | |
| Triton X-100 | Acros Organics | 327372500 | |
| Anti-K36me3 | Abcam | ab9050 | |
| Anti-STAT1 | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-345X | |
| Anti-RNA Polymerase II | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-899 |
References
- Levy, D., Darnell, J. E. Signalling: Stats: transcriptional control and biological impact. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 3, 651-662 (2002).
- Bromberg, J., Darnell, J. E. Jr The role of STATs in transcriptional control and their impact on cellular function. Oncogene. 19, 2468-2473 (2000).
- Hu, X., Ivashkiv, L. B. Cross-regulation of signaling pathways by interferon-gamma: implications for immune responses and autoimmune diseases. Immunity. 31, 539-550 (2009).
- Campos, E. I., Reinberg, D. Histones: annotating chromatin. Annu Rev Genet. 43, 559-599 (2009).
- Kouzarides, T. Chromatin Modifications and Their Function. Cell. 128, 693-705 (2007).
- Jenuwein, T., Allis, C. D. Translating the histone code. Science. 293, 1074-1080 (2001).
- Wittwer, C. T., Herrmann, M. G., Moss, A. A., Rasmussen, R. P. Continuous fluorescence monitoring of rapid cycle DNA amplification. Biotechniques. 22 (130-131), 134-138 (1997).
- Higuchi, R., Dollinger, G., Walsh, P. S., Griffith, R. Simultaneous amplification and detection of specific DNA sequences. Biotechnology (N Y). 10, 413-417 (1992).
- Kroger, A., Koster, M., Schroeder, K., Hauser, H., Mueller, P. P. Activities of IRF-1. J Interferon Cytokine Res. 22, 5-14 (2002).
- Ross, R. A., Spengler, B. A. Human neuroblastoma stem cells. Seminars in cancer biology. 17, 241-247 (2007).
