Summary
Dit protocol beschrijft hoe chromatine immunoprecipitatie (ChIP) wordt gebruikt om de dynamische wijzigingen studie naar de chromatine sjabloon die transcriptie veroorzaakt door een signaal transductie route te reguleren.
Abstract
In antwoord op een verscheidenheid van extracellulaire liganden, het STAT (signaal transducer en activator van transcriptie) transcriptiefactoren snel gerekruteerd uit hun latente toestand in het cytoplasma naar receptoren op het celoppervlak, waar ze worden door fosforylatie geactiveerd op een tyrosine residu 1. Vervolgens dimeriseren en verplaatsen naar de kern om de transcriptie van doelwitgenen rijden, gevolgen hebben voor groei, differentiatie, homeostase en de immuunrespons. Niet verrassend, gezien hun brede betrokkenheid bij normale cel processen, ontregeling van de STAT functie draagt bij aan menselijke ziekten, met name om vormen van kanker en auto-immuunziekten 2 3.
Het is bekend dat transcriptie wordt gereguleerd door veranderingen in het chromatine template 4,5. Deze veranderingen omvatten de activiteiten van de ATP-afhankelijke complexen, evenals covalente histon-modificaties en DNA-methylatie 6. Vanwege STAT activatie van gen-expressie is zowel snel als van voorbijgaande aard, het vereist specifieke mechanismen voor het moduleren van de chromatine template op STAT-afhankelijke genloci. Te definiëren deze mechanismen, we karakteriseren de histon modificaties en de enzymatische activiteiten die ze genereren op genloci die reageren op STAT-signalering. Dit protocol beschrijft chromatine immunoprecipitatie, een methode die is waardevol voor de studie van STAT signalering naar chromatine in actief genexpressie.
Protocol
PLANNING
De dag voor een ChIP experiment is gepland, moeten cellen worden gekweekt, zodat een voldoende aantal beschikbaar is. Ga ervan uit dat elke chip test zal ~ 1-1,5 x 10 7 cellen vereisen. Altijd van plan om zowel de negatieve (IgG) en positieve (pan histone antilichaam) controles en dubbele experimenten te doen.
Tip - Voor 2FTGH cellen, elke chip test duurt ongeveer een 15 cm weefselkweek schotel bij 80% confluentie.
DEEL 1: bereid chromatine en uit te voeren ChIP
- Verwijder de cultuur media en induceren cellen voor de keren dat nodig is met 20 ml van 10% kosmische kalf serum (CCS) / DMEM met IFN-gamma op 5 ng / ml. Vervang de media op de niet-geïnduceerde borden met 20 ml van 10% CCS / DMEM ook.
- In een zuurkast, voeg 540 ul 37% formaldehyde en 20 ml van de media (1% eindconcentratie) in de 15 cm schotel.
Tip - Tilt plaat en voeg de formaldehyde aan de mediagroep - dan rots plaat gelijkmatig te verspreiden. - Laat verknoping om door te gaan gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
- Voeg toe aan 0,125 M glycine uiteindelijke concentratie verknoping te stoppen.
- Vacuüm zuigen van de media en een keer wassen cellen met 10 ml ijskoude fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS).
- Verzamel cellen met een cel schraper in ~ 7 ml PBS en combineer cellen (vanaf 6 platen) die identiek behandeld werden in 50 ml conische buis op ijs.
- Centrifuge (Beckman Coutler Allegra 12-R Centrifugeer) bij 1800 tpm bij 4 ° C gedurende 5 minuten en zuig het PBS.
Tip - Snap bevriezing van de celpellet indien stoppen hier en bewaar bij -80 ° C. - Resuspendeer de cel pellet in 4 mL Zwelling buffer (25 mM HEPES pH 7,8, 1,5 mM MgCl2, 10 mM KCl, 0,1% NP40. Voeg 1 mM DTT, Complete proteaseremmers en chillen op het ijs voor gebruik) en over te dragen aan een 15 mL conische buis.
Tip - Deze zwelling buffer volume is geschikt voor een 6 plaat pooling (~ 6-9 x 10 7 cellen). Meer of minder buffer kan veranderen de douncing efficiency. - Incubeer de celsuspensie op ijs gedurende 10 minuten.
- Overdracht vering om een pre-gekoelde 15 ml douncer (Wheaton) en dounce 20 slagen met stamper A.
- Overdracht dounced cellen terug naar een 15 ml conische buis op ijs.
- Centrifugeer bij 2500 rpm gedurende 5 minuten bij 4 ° C en gooi het supernatant.
- Resuspendeer de nucleaire pellet (~ 200 pi van 6 platen) in 3 ml (15 pellet volumes) van Ultrasoonbehandeling buffer (50 mM HEPES pH 7,9, 140 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Triton X-100, 0,1% natriumdeoxycholaat, 0,1% SDS. Add Compleet protease-inhibitoren en chillen op het ijs vlak voor gebruik).
Tip - Deze sonicatie buffer volume is geschikt voor een 6 plaat pooling (~ 6-9 x 10 7 cellen). Meer of minder buffer kan veranderen de ultrasoonapparaat efficiency. - Ultrasone trillingen kernen schorsing op ijs gedurende 10 cycli (20 seconden on/40 seconde uit / amplitude instelling van 8) met behulp van een Misonix ultrasoonapparaat 3000 uitgerust met de microtip. Dit resulteert meestal in chromatine fragmenten van gemiddeld 200-1000 basispunten in grootte.
Tip - Omdat sonicators zal variëren, de sonicatie efficiëntie moet empirisch worden bepaald. Om dit te doen, neem fracties van 20 il voor sonificatie en na elke sonicatie cyclus. Warmte deze monsters bij 65 ° C gedurende 4 uur. Voeg DNA laadbuffer en uitvoeren van een standaard 1% agarose / TBE gel om DNA-fragmenten visualiseren.) - Overdracht gesoniceerde materiaal naar een SS34 centrifugebuis en centrifugeer gedurende 20 minuten bij 4 ° C bij 13000 rpm in een SS34 rotor (Sorvall RC6 Plus Centrifugeer) om pellet wat is meestal een kleine hoeveelheid van de cel puin.
- Breng voorzichtig de supernatant om een 15 ml conische buis op ijs.
- Pre-clear door het toevoegen van 360 pi zalmsperma DNA / Proteïne A of G agarose parels drijfmest en rocken bij 4 ° C gedurende ten minste 30 minuten.
Tip - Deze stap vermindert de ruis in de test die voortvloeit uit niet-specifieke binding gebeurtenissen. - Centrifugeer bij 1000 tpm bij 4 ° C gedurende 5 minuten om pellet de agarose parels.
- Transfer pre-goedgekeurde supernatant naar de andere 15 ml conische buis op ijs.
- Meet de A260-eenheden van de pre-gewist chromatine en regel het volume met Ultrasoonbehandeling Buffer naar vier (4) A260-eenheden (0,2 mg / ml uitgaande van een A260-eenheid = 0,050 mg / ml)
Tip - Om de A260-eenheden te meten, verdunnen 10 pi van pre-goedgekeurde chromatine in 190 pL DDW; blanco spectrofotometer met 10 pi sonicatie buffer in 190 uL DDW. - Bespaar 75 pi van het chromatine (op 4 A260-eenheden) als de Input Sample en bewaar bij 20 ° C tot gebruik verknopingen te keren.
Tip - Deze stap is cruciaal voor data-analyse. Vergeet niet, aan de ingang aliquot te nemen. - Aliquot de chromatine bereid om 1,7 ml microfugebuizen buizen op ice als 1 ml monsters.
Tip - Als het stoppen van hier, bevriezen de voorbereide chromatine op droog ijs en op te slaan snap bij -80 ° C. NB: opgeslagen chromatine kan degraderen, die minder dan een optimaal resultaat, dus vermijd indien mogelijk. - Voeg de ChIP-grade antilichamen tegen de geïnduceerde en niet-geïnduceerde samples sets tweevoud in. Voeg IgG (2 ug) en pan histon H3 antilichaam (15 pi) als de negatieve en positieve controles geïnduceerde en niet-geïnduceerde samples sets.
Tip - De hoeveelheid antilichamen gebruiken, moet empirisch worden bepaald of raadpleeg de leverancier product sheet voor aanbevolen hoeveelheden. Typisch 1-2 ug van een ChIP-grade antistof werkt goed. Het juiste volume dient empirisch te worden vastgesteld voor de antilichamen die worden geleverd als serum. - 'S nachts rots alle buizen bij 4 ° C.
DEEL 2: Verzamel immunocomplexen
- Voeg 60 ul van zalmsperma DNA / proteïne A of proteïne G agarose parels drijfmest op alle buizen.
Tip Gebruik Proteïne A voor konijnen polyklonale antilichamen en Proteïne G voor de muis monoklonale antilichamen. - Rots bij 4 ° C gedurende ten minste 60 minuten.
- Pellet de immunocomplexen (agarose parels) door microfuging voorzichtig bij 2000 tpm bij 4 ° C gedurende 3 minuten.
- Zuig het supernatant.
- Was de immunocomplexen met 1 ml van elk van de volgende Wash Buffers voor 10 minuten met rocken bij 4 ° C. Microfuge gedurende 3 minuten bij 2000 rpm bij 4 ° C tussen elke wasbeurt en zuig supernatant. Houden monsters gekoeld op ijs. Voeg PMSF vlak voor gebruik.
- Low Salt Wash - 0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-Cl, pH 8,0, 150 mM NaCl, 1 mM PMSF
- Hoge Salt Wash - 0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-Cl, pH 8,0, 500 mM NaCl, 1 mM PMSF
- LiCl Wash - 0,25 M LiCl, 1% NP-40, 1% natriumdeoxycholaat, 1 mM EDTA, 10 mM Tris-Cl, pH 8,0, 1 mM PMSF
- TE Wash - twee wassen met TE-buffer -10 mM Tris-Cl, pH 8,0, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF
- Verwijder de laatste TE-buffer te wassen en naar de kralen, voeg 500 ul elutiebuffer (50 mM Tris-Cl, pH 8,0, 10 mM EDTA, 1% SDS).
Tip - de elutiebuffer moet vers worden bereid. - Vortex op agarose parels mengen in elutiebuffer en verwarm gedurende 30 minuten bij 65 ° C.
Tip - vortex elke buis ten minste om de 10 minuten tijdens deze 30 minuten. - Microfuge gedurende 30 seconden bij 2000 rpm en breng het eluens naar een nieuw microfugebuis.
Tip - Tijdens de elutie, dooi uw input samples en 500 ui elutiebuffer aan ieder toe te voegen. Inclusief deze monsters in alle stappen voor de toekomst. - Voeg 5 M NaCl tot een uiteindelijke concentratie van 200 mm tot alle monsters en vortex.
- Incubeer bij 65 ° C gedurende de nacht (of ten minste 4 uur).
DEEL 3: zuiveren ChIP'd EN INPUT DNA
- Microfuge alle monsters gedurende 30 seconden om condensatie te verzamelen over deksels.
- Voeg 1μL van RNAse A (10 U / pl) aan elke buis en incuberen bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten.
- Voeg 10 pi 0,5 M EDTA, 40 pi 0,5 M Tris-Cl pH 6,5, 2 pl proteïnase K (10 mg / ml) en incubeer bij 45 ° C gedurende 60 minuten. Tip Maak een master mix van deze reagentia en voeg 52 ul aan elke buis.
- Fenol / chloroform / isoamylalcohol extract en dan chloroform / isoamylalcohol extract van de monsters.
- Voeg 2 pl glycogeen (25 ug / pi) en 0,1 volumes van 3M Na acetaat pH 5,2 en vortex.
- Voeg 2,5 volumes 100% ethanol en vortex.
- Incubeer bij 20 ° C gedurende de nacht.
DEEL 4: zuiveren ChIP'd EN INPUT DNA VERVOLG
- Microfuge monsters voor een minimum van 20 minuten bij 13000 rpm bij 4 ° C voor het neerslaan van de DNA / glycogeen pellets.
- Was met DNA / glycogeen pellets met 1 ml van 70% ethanol.
- De lucht drogen van de pellets of drogen snel in het DNA Savant snelheid vacuüm centrifuge.
Tip - niet te droog het DNA. - Resuspendeer DNA / glycogeen pellets in 200 pi TE-buffer.
- DNA (een pi) is klaar voor de kwantificering via real-time PCR. Bewaar de resterende DNA bij 20 ° C.
Tip - Het gebruik van meer dan 1 pi van het DNA kan de real-time PCR-reacties te remmen, zodat op schaal met de nodige voorzichtigheid.
Deel 5: representatieve resultaten:
ChIP en Input DNA-monsters worden gekwantificeerd met de Real-Time PCR 7,8 (Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System) met behulp van primers die specifiek zijn voor het gen locus van belang. Primers die richt zich op bekende genomische sequentie te worden verrijkt of ontbreekt in de histon-modificaties die getest kan worden gebruikt als positieve en negatieve controles ook. Gegevens worden gepresenteerd als percentage van de input. De ChIP procedure moet volledig worden repeated met drie biologische repliceert om ervoor te zorgen gemelde veranderingen in de histon modificaties zijn statistisch significant.
Er zijn een aantal belangrijke kwesties om te overwegen bij het gebruik van real-time PCR op DNA, met inbegrip primer design, PCR-efficiëntie, en de juiste manier is om het percentage van de input en normalisatie procedures te berekenen kwantificeren. Bij het profileren van histon-eiwitten bezetting in een gen, moet de PCR-efficiëntie consistent zijn onder alle primer paren. De real-time PCR-systeem fabrikant kan de nodige informatie en opleiding.
Figuur 1 toont representatieve resultaten van chromatine immunogeprecipiteerd tijdens STAT1 activering van het IRF1 gen 9, veroorzaakt door IFN-γ.
Figuur 1. Bezettingsgraad van STAT1, RNA polymerase II en H3K36me3 is dynamisch tijdens STAT1 activering van het IRF1 gen. (A, B, C) chip met α-H3K36me3, α-STAT1 en α-Pol II van chromatine verzameld van 2FTGH cellen geïnduceerd met IFN-γ gedurende 30 minuten (rode vierkanten), 1,5 uur (blauwe cirkels), 5 uur ( groene driehoeken) of niet-geïnduceerde (zwarte diamanten). IgG is de negatieve controle (grijs kruisjes). (D) Pan H3 is de positieve controle en toont de histon bezettingsgraad over de locus in de geïnduceerde (blauwe cirkels) en geïnduceerde voorwaarden (zwarte diamanten). De dip ongeveer -5 bp is te wijten aan het nucleosoom uitputting die wordt gevonden op de transcriptie start sites.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De geschetste ChIP protocol is met succes gebruikt in het lab voor het testen van meer dan twintig verschillende histon-modificaties. Daarnaast hebben we gekarakteriseerd veranderingen in de bezetting van transcriptiefactoren, histon-modificerende enzymen, eiwitten die histon modificaties en het RNA polymerase II de transcriptie machinerie te herkennen, op een aantal IFN-γ geïnduceerde genen. We hebben ook gebruik gemaakt van de procedure om veranderingen in histon modificaties karakteriseren tijdens de differentiatie van een kankerstamcel 10.
De kwaliteit van de gegevens ChIP hangt uiteindelijk af op de effectiviteit van de gebruikte antilichamen en er is aanzienlijke variatie tussen antilichamen. Het onvermogen om een wijziging ChIP kan dus niet worden uitgelegd dat genoemde wijziging is niet aanwezig is. Verder kunnen veranderingen in een bepaalde verandering waargenomen in een experiment ChIP gewoon wijzen op een verandering in de erkenning van de epitoop van het antilichaam wordt veroorzaakt door extra histon-modificaties in het nabijgelegen residuen. Daarom moet ChIP resultaten worden gevalideerd met benaderingen die de waargenomen veranderingen in een histon-eiwitten zullen betrekking hebben op een biologisch uitkomst. Wanneer dit gedaan is, chip is een krachtige manier om chromatine-gebaseerde mechanismen die bijdragen aan de regulatie van genexpressie te bestuderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit werk wordt ondersteund door de Universiteit van Virginia, de Universiteit van Virginia Cancer Center en The Thomas F. en Kate Miller Jeffress Memorial Trust. Wij danken de James E. Darnell Lab (Rockefeller University) de Robert Ross Lab (Fordham University) voor cellijnen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 37% Formaldehyde | Fisher Scientific | BP531-500 | |
| Chloroform/Isoamyl alcohol | Acros Organics | AC32715-5000 | |
| Complete Mini Protease Inhibitors | Roche Group | 1836153 | |
| Cosmic Calf Serum | Hyclone | SH30087.04N | |
| DMEM | Hyclone | SH30243 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP118-500 | |
| Ethanol | Pharmco Products, Inc. | zp1110EP | |
| Glycine | Roche Group | 100149 | |
| Glycogen | Roche Group | 901393 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3784 | |
| IFN-gamma | R&D Systems | 285-IF-100 | |
| IgG | Jackson ImmunoResearch | 109-005-003 | |
| KCl | MP Biomedicals | ||
| LiCl | Sigma-Aldrich | L4408 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Sodium Acetate | Fisher Scientific | BP333-500 | |
| Deoxycholic Acid Sodium Salt | Fisher Scientific | BP349-100 | |
| NaCl | Fisher Scientific | 7647-14-5 | |
| NP40 | US Biological | N3500 | |
| Anti-Histone H3, CT, pan | EMD Millipore | 07-690 | |
| Phenol/chloroform/isoamyl | Fisher Scientific | 108-95-2 | |
| Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | 7647-14-5 | |
| PMSF | EMD Millipore | 50-230-0316 | |
| Proteinase K | 5 PRIME | 2500140 | |
| RNAse A | 5 PRIME | 2500130 | |
| Salmon Sperm DNA/Protein A Agarose | EMD Millipore | 16-157 | |
| Salmon Sperm DNA/Protein G Agaorse | EMD Millipore | 16-201 | |
| SDS | Fisher Scientific | BP166-500 | |
| Tris-Cl | Sigma-Aldrich | T5941 | |
| Triton X-100 | Acros Organics | 327372500 | |
| Anti-K36me3 | Abcam | ab9050 | |
| Anti-STAT1 | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-345X | |
| Anti-RNA Polymerase II | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-899 |
References
- Levy, D., Darnell, J. E. Signalling: Stats: transcriptional control and biological impact. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 3, 651-662 (2002).
- Bromberg, J., Darnell, J. E. Jr The role of STATs in transcriptional control and their impact on cellular function. Oncogene. 19, 2468-2473 (2000).
- Hu, X., Ivashkiv, L. B. Cross-regulation of signaling pathways by interferon-gamma: implications for immune responses and autoimmune diseases. Immunity. 31, 539-550 (2009).
- Campos, E. I., Reinberg, D. Histones: annotating chromatin. Annu Rev Genet. 43, 559-599 (2009).
- Kouzarides, T. Chromatin Modifications and Their Function. Cell. 128, 693-705 (2007).
- Jenuwein, T., Allis, C. D. Translating the histone code. Science. 293, 1074-1080 (2001).
- Wittwer, C. T., Herrmann, M. G., Moss, A. A., Rasmussen, R. P. Continuous fluorescence monitoring of rapid cycle DNA amplification. Biotechniques. 22 (130-131), 134-138 (1997).
- Higuchi, R., Dollinger, G., Walsh, P. S., Griffith, R. Simultaneous amplification and detection of specific DNA sequences. Biotechnology (N Y). 10, 413-417 (1992).
- Kroger, A., Koster, M., Schroeder, K., Hauser, H., Mueller, P. P. Activities of IRF-1. J Interferon Cytokine Res. 22, 5-14 (2002).
- Ross, R. A., Spengler, B. A. Human neuroblastoma stem cells. Seminars in cancer biology. 17, 241-247 (2007).
