Summary
이 프로토콜은 염색질 immunoprecipitation (칩)가 신호 전달 경로에 의해 유도 전사 조절 염색질 템플릿 동적 변경을 연구하는 데 사용됩니다 방법을 설명합니다.
Abstract
세포외 리간드의 다양한 대응, STAT (전사의 신호 변환기 및 활성)이 전사 요소 빠르게들은 하나의 티로신 잔기 1 인산화에 의해 활성화됩니다 세포 표면 수용체에 세포질에서 숨겨진 상태에서 모집하고 있습니다. 그들은 다음 성장, 분화, 항상성 및 면역 반응에 영향을 미치는 대상 유전자의 전사를 드라이브에 핵을 dimerize 및 이동시키다. 되지 놀랍게도, 정상적인 세포 프로세스에서 광범위한 참여에 따라, STAT 기능의 dysregulation 특히 암 2 면역 질환 3, 인간의 질병에 기여하고 있습니다.
그것은 잘 녹음이 4,5 염색질 템플릿 변경에 의해 규제되어 설정됩니다. 이러한 변경은 ATP에 의존 단지뿐만 아니라 공유 결합 히스톤 수정 및 DNA의 methylation 6 활동을 포함합니다. 유전자 표현의 STAT 활성화가 신속하고 과도 모두이기 때문에, 그것은 STAT - 의존 유전자 loci modulating에서 염색질 템플릿에 대한 구체적인 메커니즘이 필요합니다. 이러한 메커니즘을 정의하려면, 우리는 히스톤 수정 및 STAT 신호에 응답 유전자 loci에서 그들을 생성하는 효소 활동을 특징. 이 프로토콜은 염색질 immunoprecipitation, STAT가 활성 유전자 발현의 염색질에 신호의 연구에 대한 가치있는 방법을 설명합니다.
Protocol
계획
칩 실험이 계획되어 하루 전에, 세포가 충분한 숫자가 제공되도록 교양하여야한다. 각 칩 분석이 ~ 1-1.5 X 10 7 세포가 필요합니다 있다고 가정합니다. 항상 부정적인 (IgG)와 긍정적인 (팬 히스톤 항체) 컨트롤과 중복 실험을 모두 할 계획입니다.
팁 - 2FTGH 전지, 각 칩 분석이 80 % confluency 15 약 cm 조직 문화 요리가 필요합니다.
1 부 : 염색질 준비와 칩을 수행
- 문화 미디어를 제거와 10 %의 우주 송아지 혈청 (CCS) / 5 NG / ML에서 IFN - 감마를 포함한 DMEM 20 ML로 필요한 시간에 대한 세포를 유도. CCS / DMEM뿐만 아니라 10 % 20 ML과 uninduced 접시에있는 미디어를 교체합니다.
- 퓸 배출 후드에서는 15cm의 접시 미디어 20 ML (1 % 최종 농도)을 540 μL 37 % 포름 알데히드를 추가합니다.
팁 - 틸트 판과 미디어 수영장에 포름 알데히드를 추가 - 다음 바위 플레이트는 균일하게 그것을 확산합니다. - 실온에서 10 분 진행 crosslinking을 허용합니다.
- crosslinking를 중지 0.125 M 최종 농도 글리신을 추가합니다.
- 미디어를 대기음 진공 10 ML 얼음 추위 인산염과 함께 한 세포 세차 호수 (PBS)를 버퍼.
- ~ 7 ML PBS에 세포 스크레이퍼와 세포를 수집하고 얼음 50 ML 원뿔 관에 동일하게 취급했다 세포를 (6 판에서) 결합.
- 4 1,800 rpm으로 원심 분리기 (베크맨 Coutler 알레 그라 12 - R 원심 분리기) · 5 분 C와 PBS를 대기음.
팁 - 스냅 동결 세포 펠릿 경우 여기를 중지하고 -80 ° C.에 저장 - 4 ML 부풀어 올랐고 버퍼 (25 MM의 HEPES 산도 7.8, 1.5 MM MgCl 2, 10 MM KCl, 0.1 % NP40. 1 ㎜의 DTT, 완전한 프로 테아제 억제제 및 사용하기 전에 얼음에 진정을 추가)의 세포 펠렛을 Resuspend과 15 전송 ML 원뿔 관.
팁 -이 붓기 버퍼 볼륨 6 접시 풀링 (~ 6-9 X 10 7 세포)에 적합합니다. 더 많거나 적은 버퍼 douncing 효율성을 변경할 수 있습니다. - 10 분 얼음에 세포 현탁액을 품어.
- 미리 차게 15 ML douncer (위턴)에 정지를 전송하고 유봉 A. 20 스트로크를 다운스
- 전송 얼음에 15 ML 원뿔 관에 다시 세포를 dounced.
- 4 5 분 2,500 rpm으로 원심 분리기는 ° C와 뜨는 폐기하십시오.
- Sonication 버퍼 3 ML의 핵 펠릿 (6 접시에서 ~ 200 μL) (15 펠릿 볼륨) (50 MM의 HEPES의 산도 7.9, 140 MM NaCl, 1 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 1 % 트리톤 X - 100, 0.1 %의 나트륨 deoxycholate, Resuspend 0.1 % SDS). 사용하기 직전 얼음 완료 테아제 억제제와 진정을 추가합니다.
팁 -이 sonication 버퍼 볼륨 6 접시 풀링 (~ 6-9 X 10 7 세포)에 적합합니다. 더 많거나 적은 버퍼 sonication 효율을 변경할 수 있습니다. - microtip 장착된 Misonix의 Sonicator 3000을 사용하여 10 사이클 (20초 8 설정 on/40 초 ON / OFF 진폭)에 얼음 핵 서스펜션을 Sonicate. 크기 200-1000 BPS 평균 염색질 조각이 일반적으로 발생합니다.
팁 - sonicators이 달라집니다 때문에 sonication 효율이 경험적으로 결정되어야합니다. 이렇게하려면, sonication 전에 각 sonication 사이클 이후 20 μL의 aliquots 가져가라. 4 시간 동안 65 ° C에서이 샘플을 가열. DNA 로딩 버퍼를 추가하고 DNA 조각을 시각화하기위한 기준 1퍼센트 아가로 오스 / TBE 젤을 실행합니다.) - 전송 4 20 분 SS34 원심 분리기 튜브와 원심 분리기에 자료를 sonicated ° 일반적으로 세포 파편의 소량 무엇 SS34 로터의 13,000 RPM (Sorvall RC6 플러스 원심 분리기)에서 펠렛을 C.
- 조심스럽게 얼음 15 ML 원뿔 관에 뜨는을 전송하기만하면됩니다.
- 360 μL 연어 정자 DNA / 단백질 A 또는 G 아가로 오스 비즈 슬러리를 추가하고 적어도 30 분 동안 4 ° C에서 락을에서 미리 취소합니다.
팁 -이 단계가 아닌 특정 바인딩 이벤트에서 발생 분석에서 소음을 감소시킵니다. - 펠렛 아가로 오스 비즈 5 분 동안 4 ° C에서 1,000 rpm으로 원심 분리기.
- 얼음 다른 15 ML 원뿔 관에 뜨는 사전 허가 전송합니다.
- 미리 지워 염색질의 A260 단위를 측정하고 4 A260 단위 (0.2 MG / ML 1 A260 단위 = 0.050 MG / ML 가정)에 Sonication 버퍼로 음량을 조절
190 μL DDW 10 μL sonication 버퍼와 빈 분광 광도계, - 팁 A260 단위를 측정하려면, 190 μL DDW의 사전 허가 염색질 10 μL를 희석. - 20 입력 샘플 및 저장소로 염색질의 75 μL (4 A260 단위에서) 저장 ° C crosslinks을 뒤집을 준비까지.
팁 -이 단계는 데이터 분석을 위해 매우 중요합니다. 입력 나누어지는을 위해 게을리하지 마십시오. - I에서 1.7 ML의 microfuge 튜브로 나누어지는가 준비 염색질CE 1 ML의 aliquots로.
팁 - 여기 중지하는 경우, -80에 드라이 아이스와 저장소에 준비된 염색질을 동결 스냅 ° C. NB가 : 가능하면 저장된 염색질은 덜 최적의 결과를보다 생산 저하시킬 수 있으므로 피하십시오. - 유도와 uninduced 샘플에 칩 등급 항체를 추가하면 중복으로 설정합니다. 유도 및 uninduced 샘플 세트로 부정과 긍정적인 컨트롤로 IgG (2 μg)과 히스톤 H3 이동 항체 (15 μL)를 추가합니다.
팁 - 사용하는 항체의 금액은 경험적으로 결정 또는 제안 금액에 대한 공급 업체의 제품 시트를 참조해야합니다. 칩 학년 항체의 일반적으로 1-2 μg 잘 작동합니다. 적절한 볼륨이 혈청으로 제공하는 항체에 대한 경험적으로 결정되어야합니다. - 4 박 모두 튜브를 록 ° C.
2 부 : IMMUNOCOMPLEXES를 수집
- 모든 튜브에 연어 정자 DNA / 단백질 A 또는 단백질 G 아가로 오스 비즈 슬러리의 60 μL를 추가합니다.
팁 사용 단백질 마우스 단클론 항체에 대한 토끼 polyclonal 항체 및 단백질 G위한. - 적어도 60 분 4 ° C에서 록.
- 4 2,000 rpm으로 부드럽게 microfuging하여 펠렛은 immunocomplexes (아가로 오스 비즈) · 3 분 C.
- 뜨는을 대기음.
- 4 ° C. 로킹 10 분 동안 다음 씻어 버퍼의 각 1 ML로 immunocomplexes 와시 4 2,000 rpm으로 3 분 Microfuge · 각 씻고 뜨는을 대기음 사이에 C. 얼음에 냉장 샘플 보관하십시오. 사용하기 직전 PMSF를 추가합니다.
- 낮은 소금 워시 - 0.1 % SDS, 1 % 트리톤 X - 100, 2 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 20 MM 트리스 - CL, 산도 8.0, 150 MM NaCl, 1 MM PMSF
- 고 염분 워시 - 0.1 % SDS, 1 % 트리톤 X - 100, 2 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 20 MM 트리스 - CL, 산도 8.0, 500 MM NaCl, 1 MM PMSF
- LiCl 워시 - 0.25 M LiCl, 1 % NP - 40, 1 %의 나트륨 deoxycholate, 1 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 10 MM 트리스 - CL, 산도 8.0, 1 ㎜ PMSF
- TE 워시 - TE 버퍼 -10 MM 트리스 - CL, 산도 8.0, 1 ㎜ EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 1 MM PMSF 두 씻는다
- 최종 TE 버퍼 세척을 제거하고 구슬을 500 μL 용출 버퍼 (50 MM 트리스 - CL, 산도 8.0, 10 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 1 % SDS)을 추가합니다.
팁 - 용출 버퍼가 신선하게 준비한다. - 65 30 분 용출 버퍼와 더위에 아가로 오스 비즈를 섞어 소용돌이 ° C.
팁 -이 삼십분 동안 각각의 튜브는 최소한 10 분 간격 와동. - 2,000 rpm으로 30 초 동안 Microfuge 새로운 microfuge 튜브에 eluent를 전송합니다.
팁 - 용출하는 동안 귀하의 입력 샘플을 해동하고 각 500 μL 용출 버퍼를 추가합니다. 앞으로 모든 단계에서 이러한 샘플을 포함합니다. - 모든 샘플 및 와동 200 mm의 최종 농도 5 M NaCl을 추가합니다.
- 65 품어 ° C 숙박 (또는 적어도 4 시간).
3 부 : 정화 ChIP'd 및 입력 DNA
- 뚜껑에 결로를 수집하는 30 초 동안 모든 샘플을 Microfuge.
- 15 분 동안 상온에서 각각의 튜브와 부화 RNAse의 1μL (10 U / μL) 추가합니다.
- 10 μL 0.5 M EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 40 μL 0.5 M 트리스 - CL 산도 6.5, 2 μL Proteinase K (10 MG / ML) 추가 45에서 60 분 ° C 품어. 팁이 시약의 마스터 믹스를 준비하고 각 튜브 52 μL를 추가합니다.
- 페놀 / 클로로포름 / isoamyl 알콜 추출하고 클로로포름 / isoamyl 알콜 농도는 샘플을 추출합니다.
- 2 μL 글리코겐 (25 μg / μL)와 3M 나 아세테이트 산도 5.2과 0.1의 소용돌이 볼륨을 추가합니다.
- 100 % 에탄올과 와동 2.5 볼륨을 추가합니다.
- ° C 하루 20 알을 품다.
4 부 : 정화 ChIP'd 및 입력 DNA 계속해서
- 4 13,000 rpm으로 20 분 최소 Microfuge 샘플 ° C DNA / 글리코겐 알약을 촉진합니다.
- 70 % 에탄올 1 ML과 DNA / 글리코겐 알약과 함께 씻으십시오.
- 에어 DNA 사반트 속도 진공 원심 분리기에 알약이나 신속하게 건조 건조.
팁 - 이상의 DNA를 건조하지 마십시오. - 200 μL TE 버퍼의 DNA / 글리코겐 알약을 Resuspend.
- DNA (1 μL)은 실시간 PCR을 통해 부량 준비가되었습니다. 20 스토어 남아있는 DNA ° C.
팁 - DNA 이상의 1 μL를 사용하여이 실시간 PCR 반응을 억제 수 있으므로주의와 규모.
제 5 부 : 대리인 결과 :
칩 및 입력 DNA 샘플은 관심의 유전자 로커스 특정 primers를 사용하여 리얼 타임 PCR 7,8 (Biosystems 7500 빠른 리얼 타임 PCR 시스템을 적용)과 계량 수 있습니다. 알려진 대상 게놈 시퀀스의 강화 또는 assayed되는 히스톤 수정이 부족하는 것을 Primers는 긍정적이고 부정적인 통제뿐만 아니라 사용할 수 있습니다. 데이터 입력의 비율로 제공됩니다. 칩 절차는 전적으로해야 R세 epeated 생물 학적는 히스톤 수정에 보고된 통계적으로 의미있는 변화된다 보장하기 위해 복제합니다.
뇌관 디자인, PCR 효율, 그리고 입력과 정상화 절차의 %를 계산하는 적절한 방법을 포함하여 DNA를 수치 실시간 PCR를 사용할 때 고려해야 할 몇 가지 중요한 문제가 있습니다. 유전자에 걸쳐 히스톤 수정 인을 프로 파일링 때, PCR 효율은 모든 프라이머 쌍 간의 일치해야합니다. 실시간 PCR 시스템 제조 업체가 필요한 정보와 교육을 제공할 수 있습니다.
그림 1은 염색질의 대표적인 결과는 IFN - γ에 의해 트리거, IRF1 유전자 9 STAT1 활성화하는 동안 immunoprecipitated 보여줍니다.
그림 1. STAT1, RNA 중합 효소 II와 H3K36me3의 인 IRF1 유전자의 STAT1 활성화하는 동안 동적입니다. (A, B, C) α - H3K36me3, α - STAT1과 2FTGH 세포에서 수집한 염색질의 α - 폴 II와 칩 IFN - γ를위한 30 분 (빨간색 사각형), 1.5 시간 (파란색 원), 5 시간 (로 유도 녹색 삼각형) 또는 uninduced (블랙 다이아몬드). IgG는 대조군 (회색 십자가)입니다. (D) 팬 H3는 긍정적인 제어이며, 유도 (파란색 원)에 로커스 전체 히스톤 인과 uninduced 조건 (블랙 다이아몬드)를 보여줍니다. -5 BP 주변 딥는 전사 시작 사이트에서 발견 nucleosome 고갈로 인한 것입니다.
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Discussion
명시된 칩 프로토콜은 분석보다보다 20 가지 히스톤 수정을 위해 실험실에서 성공적으로 사용되었습니다. 또한, 우리는 전사 요소의 숙박 변화를 특징으로 가지고 히스톤 - 수정 IFN - γ 여러 유발 유전자에서 히스톤 수정 및 RNA 효소 II의 전사 기계를 인식 효소, 단백질. 우리는 또한 암 줄기 세포 10 분화 동안 히스톤 수정의 변화를 특징으로 프로 시저를 사용합니다.
칩 데이터의 품질은 궁극적으로 사용되는 항체의 효과에 의존하고 항체 사이에 상당한 변화가 있습니다. 수정을 칩에 실패, 따라서, 그 변경이 존재하지 않습니다라고 의미로 해석될 수 없습니다. 또한, 칩 실험에서 관찰된 특정 수정 변경은 단순히 가까운 잔류물에 추가 히스톤 수정에 의한 항체에 의해 에피토프의 인식에 변화가 반영될 수 있습니다. 따라서, 칩 결과는 생물 학적 결과에 히스톤 수정에서 관찰된 변화와 관련됩니다 접근과 검증해야합니다. 이것이 완료되면, 칩은 유전자 발현의 조절에 기여 염색질 기반 메커니즘을 연구하기위한 강력한 방법입니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 작품은 버지니아 대학, 버지니아 암 센터의 대학과 토마스 F.와 케이트 밀러 제프리스 기념 트러스트에 의해 지원됩니다. 우리는 세포 라인에 대한 제임스 E. 다넬 랩 (록펠러 대학교) 로버트 로스 연구실 (포드햄 대학) 감사합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 37% Formaldehyde | Fisher Scientific | BP531-500 | |
| Chloroform/Isoamyl alcohol | Acros Organics | AC32715-5000 | |
| Complete Mini Protease Inhibitors | Roche Group | 1836153 | |
| Cosmic Calf Serum | Hyclone | SH30087.04N | |
| DMEM | Hyclone | SH30243 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP118-500 | |
| Ethanol | Pharmco Products, Inc. | zp1110EP | |
| Glycine | Roche Group | 100149 | |
| Glycogen | Roche Group | 901393 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3784 | |
| IFN-gamma | R&D Systems | 285-IF-100 | |
| IgG | Jackson ImmunoResearch | 109-005-003 | |
| KCl | MP Biomedicals | ||
| LiCl | Sigma-Aldrich | L4408 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Sodium Acetate | Fisher Scientific | BP333-500 | |
| Deoxycholic Acid Sodium Salt | Fisher Scientific | BP349-100 | |
| NaCl | Fisher Scientific | 7647-14-5 | |
| NP40 | US Biological | N3500 | |
| Anti-Histone H3, CT, pan | EMD Millipore | 07-690 | |
| Phenol/chloroform/isoamyl | Fisher Scientific | 108-95-2 | |
| Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | 7647-14-5 | |
| PMSF | EMD Millipore | 50-230-0316 | |
| Proteinase K | 5 PRIME | 2500140 | |
| RNAse A | 5 PRIME | 2500130 | |
| Salmon Sperm DNA/Protein A Agarose | EMD Millipore | 16-157 | |
| Salmon Sperm DNA/Protein G Agaorse | EMD Millipore | 16-201 | |
| SDS | Fisher Scientific | BP166-500 | |
| Tris-Cl | Sigma-Aldrich | T5941 | |
| Triton X-100 | Acros Organics | 327372500 | |
| Anti-K36me3 | Abcam | ab9050 | |
| Anti-STAT1 | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-345X | |
| Anti-RNA Polymerase II | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-899 |
References
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