Summary
Este protocolo describe cómo inmunoprecipitación de cromatina (CHIP) se utiliza para estudiar las alteraciones dinámicas de la plantilla de la cromatina que regulan la transcripción inducida por una vía de transducción de señal.
Abstract
En respuesta a una variedad de ligandos extracelulares, el STAT (transductor de señal y activador de la transcripción) factores de transcripción son rápidamente contratados en su estado latente en el citoplasma a los receptores de superficie celular en el que se activan por fosforilación en un único residuo de tirosina 1. A continuación, dímeros y trasladar al núcleo para conducir la transcripción de genes diana, lo que afecta el crecimiento, la diferenciación, la homeostasis y la respuesta inmune. No es de extrañar, dada su amplia participación en los procesos celulares normales, la desregulación de la función STAT contribuye a la enfermedad humana, en particular con el cáncer y enfermedades autoinmunes 2 3.
Está bien establecido que la transcripción está regulada por la alteración de la plantilla de 4,5 cromatina. Estas alteraciones incluyen las actividades de la ATP-dependientes de los complejos, así como covalentes modificaciones de las histonas y la metilación del ADN 6. Debido a la activación de STAT de la expresión génica es a la vez rápido y transitorio, se requiere de mecanismos específicos para la modulación de la plantilla de la cromatina en los loci de genes dependientes de STAT. Para definir estos mecanismos, que caracterizan a la modificaciones de las histonas y la actividad enzimática que los generan en los loci de genes que responden a STAT de señalización. Este protocolo describe inmunoprecipitación de cromatina, un método que es valioso para el estudio de STAT de señalización de la cromatina en la expresión de genes activados.
Protocol
PLANIFICACIÓN
El día antes de un experimento de chip está previsto, las células deben ser cultivadas de manera que un número suficiente esté disponible. Supongamos que cada chip de ensayo requerirá ~ 1-1,5 x 10 7 células. Siempre el plan de hacer las dos cosas los controles negativos (IgG) y positivo (anticuerpos histona pan) y los experimentos duplicados.
Sugerencia - Para obtener las células 2FTGH, cada chip de ensayo requiere alrededor de un 15 cm placa de cultivo de tejidos en la confluencia del 80%.
PARTE 1: Preparar la cromatina y REALIZAR chip
- Eliminar los medios de cultivo e inducir las células de los tiempos requeridos con 20 ml de 10% de suero de ternera cósmica (CCS) / MEDM con IFN-gamma a 5 ng / mL. Vuelva a colocar los medios de comunicación en las placas no inducido con 20 ml de 10% de CCS / DMEM así.
- En una campana de extracción, añadir 540 l de formaldehído 37% a 20 ml de los medios de comunicación (1% concentración final) en el plato de 15 cm.
Consejo - placa de inclinación y añadir el formaldehído para el grupo de medios - entonces la placa de roca para repartirla uniformemente. - Permitir la reticulación de proceder durante 10 minutos a temperatura ambiente.
- Añadir a la glicina 0,125 M de concentración final para dejar de reticulación.
- Vacío aspirar los medios de comunicación y lavar las células una vez con 10 ml de fosfato de hielo frío (PBS).
- Muestras de células con un rascador de células en PBS ~ 7 ml y se combinan las células (de 6 placas) que fueron tratados de manera idéntica en 50 ml tubo cónico en el hielo.
- Centrífuga (Beckman Coutler Allegra 12-R centrífuga) a 1800 rpm a 4 ° C durante 5 minutos y aspire el PBS.
Consejo - Snap congelar el sedimento celular si parar aquí y almacenar a -80 ° C. - Resuspender el botón celular en tampón de 4 ml Inflamación (25 mM HEPES pH 7,8, 1,5 mM de MgCl2, 10 mM KCl, 0,1% de NP40. Añadir 1 mM DTT, los inhibidores de la proteasa completa y enfriar en hielo antes de su uso) y la transferencia a un 15 mL cónica del tubo.
Consejo - El volumen del tampón inflamación es apropiado para una agrupación de 6 placas (~ 6.9 x 10 7 células). Tampón más o menos podría cambiar la eficiencia douncing. - Incubar la suspensión de células en hielo durante 10 minutos.
- La transferencia de la suspensión a un pre-enfriado douncer 15 ml (Wheaton) y Dounce 20 golpes con su correspondiente mano A.
- Transferencia dounced células a un tubo cónico de 15 ml en hielo.
- Centrifugar a 2500 rpm durante 5 minutos a 4 ° C y descartar el sobrenadante.
- Resuspender el pellet nuclear (~ 200 l de 6 platos) en 3 ml (15 volúmenes de pellets) de tampón de sonicación (50 mM HEPES pH 7,9, 140 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Triton X-100, desoxicolato de sodio al 0,1%, 0,1% SDS. Añadir inhibidores de la proteasa completa y enfriar en hielo antes de su uso).
Consejo - El volumen del tampón de sonicación es apropiado para una agrupación de 6 placas (~ 9.6 x 10 7 células). Tampón más o menos podría cambiar la eficiencia de ultrasonidos. - Sonicar suspensión de núcleos de hielo durante 10 ciclos (20 segundos on/40 segundos / ajuste de amplitud de 8) con un Sonicator Misonix 3000 equipado con la micropunta. Esto generalmente resulta en un promedio de fragmentos de cromatina 200-1000 bps en tamaño.
Consejo - Porque sonicadores variará, la eficiencia de ultrasonidos debe ser determinada empíricamente. Para ello, tomar alícuotas de 20 l antes de ultrasonidos y después de cada ciclo de tratamiento con ultrasonidos. El calor de estas muestras a 65 ° C durante 4 horas. Añadir buffer de ADN de carga y ejecuta un estándar de 1% de agarosa / TBE gel para visualizar fragmentos de ADN.) - Transferencia de material sonicado a un tubo de centrífuga y centrifugar SS34 durante 20 minutos a 4 ° C a 13000 rpm en un rotor SS34 (Sorvall RC6 Además centrífuga) para precipitar lo que es normalmente una pequeña cantidad de restos celulares.
- Transferir cuidadosamente el sobrenadante a un tubo cónico de 15 ml en hielo.
- Pre-claro añadiendo 360 l de esperma de salmón ADN / proteína A o G agarosa suspensión y balanceo a 4 ° C durante al menos 30 minutos.
Sugerencia - Este paso se reduce el ruido en el ensayo que surge de la no-eventos específicos de carácter vinculante. - Centrifugar a 1000 rpm a 4 ° C durante 5 minutos para que sedimenten las perlas de agarosa.
- Transferencia de pre-aprobados sobrenadante a otro tubo cónico de 15 ml en hielo.
- Medir la A260 unidades de la cromatina pre-aprobados y ajustar el volumen con el tampón de sonicación cuatro (4) unidades de A260 (0,2 mg / mL asumiendo una unidad A260 = 0,050 mg / ml)
Sugerencia - Para medir la A260 unidades, diluir 10 l de pre-aprobados de la cromatina en 190 l DDW, blanco del espectrofotómetro con 10 l de tampón de sonicación DDW l 190. - Ahorre un 75 l de la cromatina (a 4 unidades de A260) como la muestra de entrada y almacenar a 20 ° C hasta que esté listo para invertir enlaces cruzados.
Sugerencia - Este paso es crucial para el análisis de datos. No se olviden de tomar la alícuota de entrada. - Alícuota de la cromatina dispuesta a 1.7 mL tubos de microcentrífuga de ice como alícuotas de 1 ml.
Sugerencia - Si se detiene aquí, complemento congelar la cromatina preparados en hielo seco y almacenar a -80 ° C. NB: la cromatina almacenados pueden degradar, producir resultados menos que óptimos, así que evite en lo posible. - Añadir los anticuerpos chip de calidad a las muestras de inducido y no inducido establece por duplicado. Añadir IgG (2 mg) y de anticuerpos pan Histona H3 (15 l) como controles positivos y negativos de inducido y no inducido conjuntos de muestras.
Sugerencia - La cantidad de anticuerpo a utilizar debe ser determinada empíricamente, o consulte la hoja del proveedor de productos para cantidades sugeridas. Típicamente 1-2 mg de un anticuerpo chip-grado funciona bien. El volumen apropiado debe ser determinada empíricamente para los anticuerpos que se suministran como suero. - Todos los tubos de rock la noche a 4 ° C.
PARTE 2: Recopilación de inmunocomplejos
- Añadir 60 l de ADN de esperma de salmón / proteína A o proteína G agarosa suspensión de todos los tubos.
Sugerencia Utilice una proteína de anticuerpos policlonales de conejo y la proteína G de anticuerpos monoclonales de ratón. - Rock en 4 ° C durante al menos 60 minutos.
- Se precipitan los inmunocomplejos (perlas de agarosa) por microfuging suavemente a 2000 rpm a 4 ° C durante 3 minutos.
- Aspirar el sobrenadante.
- Lavado de los inmunocomplejos con 1 ml de cada uno de los tampones de lavado después de 10 minutos con la oscilación a 4 ° C. Microfuga durante 3 minutos a 2000 rpm a 4 ° C entre cada lavado y aspirado de sobrenadante. Mantener las muestras enfriadas en hielo. Añadir PMSF justo antes del uso.
- Lavar bajo contenido de sal - 0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-Cl, pH 8,0, 150 mM NaCl, 1 mM PMSF
- Lave Salinidad - 0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-Cl, pH 8,0, 500 mM NaCl, 1 mM PMSF
- LiCl Wash - 0,25 M LiCl, 1% NP-40, 1% de desoxicolato de sodio, 1 mM EDTA, 10 mM Tris-Cl, pH 8,0, 1 mM PMSF
- TE Wash - dos lavados con buffer TE -10 mM Tris-Cl, pH 8,0, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF
- Quitar el último lavado de buffer TE y de las cuentas, añadir 500 l Tampón de Elución (50 mM Tris-Cl, pH 8,0, 10 mM EDTA, 1% SDS).
Consejo - el tampón de elución debe estar recién preparadas. - Vortex para mezclar bolas de agarosa en tampón de elución y el calor durante 30 minutos a 65 ° C.
Consejo - cada tubo de vórtice por lo menos cada 10 minutos durante estos 30 minutos. - Microcentrífuga durante 30 segundos a 2000 rpm y transferir el eluyente a un tubo de microcentrífuga nuevo.
Consejo - Durante la elución, descongelar las muestras de entrada y añadir 500 l Tampón de Elución a cada uno. Incluir estas muestras en todos los pasos en el futuro. - Añadir 5 M NaCl hasta una concentración final de 200 mM a todas las muestras y agitar.
- Se incuba a 65 ° C durante la noche (o por lo menos 4 horas).
PARTE 3: ChIP'd purificar y entrada de ADN
- Microfuga todas las muestras durante 30 segundos para recoger la condensación en las tapas.
- Añadir 1μL de RNasa A (10 U / l) a cada tubo y se incuban a temperatura ambiente durante 15 minutos.
- Añadir 10 l de EDTA 0,5 M, 40 ml 0,5 M Tris-Cl pH 6,5, 2 l de proteinasa K (10 mg / ml) y se incuba a 45 ° C durante 60 minutos. Consejo Prepare una mezcla maestra de estos reactivos y añadir 52 l de cada tubo.
- Fenol / cloroformo / isoamílico extracto de alcohol y cloroformo / alcohol isoamílico extraer las muestras.
- Añadir 2 glucógeno l (25 mg / l) y 0,1 volúmenes de acetato de sodio 3M pH 5,2 y mezclar.
- Añadir 2.5 volúmenes de etanol al 100% y agitar.
- Se incuba a 20 ° C durante la noche.
PARTE 4: ChIP'd purificar y continuo aporte de ADN
- Muestras de microcentrífuga durante un mínimo de 20 minutos a 13000 rpm a 4 ° C para precipitar el ADN / pellets de glucógeno.
- Lavar con sedimentos de ADN / glucógeno con 1 ml de etanol al 70%.
- Seque al aire los pellets o se secan rápidamente en el ADN de centrífuga de vacío Savant velocidad.
Sugerencia - No más seco del ADN. - Resuspender el ADN / pellets de glucógeno en 200 l de buffer TE.
- ADN (1 l) está listo para la cuantificación mediante PCR en tiempo real. Tienda resto de ADN a 20 ° C.
Consejo - El uso de más de 1 l de ADN puede inhibir las reacciones de PCR en tiempo real, por lo que ampliar con precaución.
Parte 5: RESULTADOS DEL REPRESENTANTE:
Muestras de chips de ADN y de entrada se han cuantificado con el Real-Time PCR 7,8 (Applied Biosystems 7500 Rápido PCR en tiempo real del sistema) con iniciadores específicos para el locus del gen de interés. Cebadores que la secuencia genómica conocida objetivo de ser enriquecido en o falta en la modificaciones de las histonas que se analizaron se pueden utilizar como controles positivos y negativos. Los datos se presentan como porcentaje de la entrada. El procedimiento de chip debe ser totalmente repeated con tres repeticiones biológica para asegurar los cambios reportados en modificaciones de las histonas son estadísticamente significativas.
Hay varios aspectos importantes a considerar cuando se utiliza PCR en tiempo real para cuantificar el ADN, incluyendo el primer diseño, eficiencia de la PCR, y la forma apropiada de calcular el porcentaje de procedimientos de entrada y la normalización. Cuando el perfil de ocupación de modificación de las histonas a través de un gen, la eficiencia de la PCR debe ser consistente entre todos los pares de cebadores. El fabricante de PCR en tiempo real del sistema puede proporcionar la información necesaria y la capacitación.
La figura 1 muestra los resultados representativos de la cromatina immunoprecipitated STAT1 en la activación del gen IRF1 9, provocada por el IFN-γ.
Figura 1. Ocupación de STAT1, la RNA polimerasa II y H3K36me3 es dinámica durante STAT1 la activación del gen IRF1. (A, B, C) con chip α-H3K36me3, STAT1 α y α-Pol II de la cromatina de las células recogidas 2FTGH inducidos con IFN-γ durante 30 minutos (cuadrados rojos), 1,5 horas (círculos azules), 5 horas ( triángulos verdes) o inducidas (diamante negro). IgG es el control negativo (gris cruces). (D) Pan H3 es el control positivo y muestra la ocupación de las histonas en el lugar en el inducido (círculos azules) y las condiciones no inducidas (diamante negro). La inmersión alrededor de -5 pb se debe a la disminución de nucleosomas que se encuentra en los sitios de inicio de la transcripción.
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Discussion
El protocolo indica chip se ha utilizado con éxito en el laboratorio de ensayo de más de veinte diferentes modificaciones de las histonas. Además, se han caracterizado los cambios en la ocupación de los factores de transcripción, histonas modificación de enzimas, proteínas que reconocen modificaciones de las histonas y el ARN polimerasa II maquinaria de transcripción, en varios de IFN-γ inducida por los genes. También hemos utilizado el procedimiento para caracterizar los cambios en las modificaciones de las histonas durante la diferenciación de una célula madre del cáncer 10.
La calidad de los datos del chip en última instancia depende de la eficacia de los anticuerpos utilizados y hay una considerable variabilidad entre los anticuerpos. La falta de un chip de modificación, por lo tanto, no puede interpretarse en el sentido de que dicha modificación no está presente. Además, los cambios en una determinada modificación observada en un experimento de chip puede simplemente reflejar un cambio en el reconocimiento del epítopo por el anticuerpo adicional causado por modificaciones de las histonas en los residuos cercanos. Por lo tanto, los resultados de chip debe ser validado con los enfoques que se relacionan con los cambios observados en una modificación de las histonas a un resultado biológico. Cuando se hace esto, chip es una forma poderosa para el estudio de la cromatina basada en mecanismos que contribuyen a la regulación de la expresión génica.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Este trabajo es apoyado por la Universidad de Virginia, la Universidad de Virginia y el Centro de Cáncer F. Thomas y Kate Miller Jeffress Memorial Trust. Damos las gracias al James E. Darnell Lab (Rockefeller University) Robert Ross Lab (Fordham University) para las líneas celulares.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 37% Formaldehyde | Fisher Scientific | BP531-500 | |
| Chloroform/Isoamyl alcohol | Acros Organics | AC32715-5000 | |
| Complete Mini Protease Inhibitors | Roche Group | 1836153 | |
| Cosmic Calf Serum | Hyclone | SH30087.04N | |
| DMEM | Hyclone | SH30243 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP118-500 | |
| Ethanol | Pharmco Products, Inc. | zp1110EP | |
| Glycine | Roche Group | 100149 | |
| Glycogen | Roche Group | 901393 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3784 | |
| IFN-gamma | R&D Systems | 285-IF-100 | |
| IgG | Jackson ImmunoResearch | 109-005-003 | |
| KCl | MP Biomedicals | ||
| LiCl | Sigma-Aldrich | L4408 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Sodium Acetate | Fisher Scientific | BP333-500 | |
| Deoxycholic Acid Sodium Salt | Fisher Scientific | BP349-100 | |
| NaCl | Fisher Scientific | 7647-14-5 | |
| NP40 | US Biological | N3500 | |
| Anti-Histone H3, CT, pan | EMD Millipore | 07-690 | |
| Phenol/chloroform/isoamyl | Fisher Scientific | 108-95-2 | |
| Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | 7647-14-5 | |
| PMSF | EMD Millipore | 50-230-0316 | |
| Proteinase K | 5 PRIME | 2500140 | |
| RNAse A | 5 PRIME | 2500130 | |
| Salmon Sperm DNA/Protein A Agarose | EMD Millipore | 16-157 | |
| Salmon Sperm DNA/Protein G Agaorse | EMD Millipore | 16-201 | |
| SDS | Fisher Scientific | BP166-500 | |
| Tris-Cl | Sigma-Aldrich | T5941 | |
| Triton X-100 | Acros Organics | 327372500 | |
| Anti-K36me3 | Abcam | ab9050 | |
| Anti-STAT1 | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-345X | |
| Anti-RNA Polymerase II | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-899 |
References
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- Bromberg, J., Darnell, J. E. Jr The role of STATs in transcriptional control and their impact on cellular function. Oncogene. 19, 2468-2473 (2000).
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