Dechorionation الجنين الميداكا وزرع الخلايا لتوليد الوهم

Summary

وتشارك أكثر بسبب المشيماء الثابت والأجنة لينة ، والتلاعب في الأجنة في الميداكا من الزرد. هذا الفيديو يظهر خطوة بخطوة إجراءات لكيفية التعامل مع الأجنة الميداكا ، بما في ذلك dechorionation ، agarose المتصاعد في التصوير وزرع الخلايا لانتاج الوهم. هذه الإجراءات ضرورية لاستخدام الميداكا والزرد في مختبر للاستفادة الكاملة من ميزات التكامل بينهما للتشريح وظائف الجينوم الوراثي للالفقاريات.

Abstract

الميداكا صغيرة أسماك المياه العذبة وضع البيض على حد سواء التي تتيح التحليلات الجينية والجنينية ، وهي واحدة من الكائنات الثلاثة النموذج في الفقاريات والتي نفذت على نطاق الجينوم النمط الظاهري يحركها شاشات متحولة إلى ^1. اختلاف في تداخل الجينات الوظيفية ذات الصلة بين الميداكا الزرد ويسمح تحديد الظواهر الجديدة التي يتم التحقق من هويته في نوع واحد ² ، وبالتالي الميداكا الزرد ومكملة للتشريح الجيني للجينوم الفقريات وظائف. التلاعب الميداكا الأجنة ، مثل dechorionation والأجنة المتصاعدة للتصوير وزرع الخلايا ، والإجراءات الأساسية للعمل على حد سواء الميداكا والزرد في المختبر. زرع الخلايا يفحص الحكم الذاتي خلية من الطفرات الميداكا. يتم إنشاؤها بواسطة زرع خلايا الوهم المسمى من أجنة المانحة في الأجنة المتلقي غير المسماة. يمكن زرع الخلايا المانحة إلى مناطق محددة من أجنة المستفيدة على أساس خرائط مصير ³ بحيث يمكن أن تكون متكاملة من استنساخ الخلايا التي تم زرعها في الأنسجة من خلال الاهتمام بالتنمية. وتشارك أكثر بسبب المشيماء الثابت والأجنة لينة ، والتلاعب في الأجنة في الميداكا من الزرد. في هذا الفيديو ، وتبين لنا إجراءات تفصيلية لمعالجة الأجنة الميداكا.

Protocol

1. تنمية أجنة

1. عندما وضعت فيها ، وتتجمع خيوط البيض بسبب المرفق على المشيماء. السماح الأجنة تتطور بشكل طبيعي ، فمن الضروري للبيض منفصلة. تشابك الخيوط وقطع المرفق بواسطة عقد خيوط مرفق مع اثنين من الملقط.
2. بعد unclustering ، يتم فصل البيض من البراز والطحالب ، ونقل الأجنة الطازجة والمتوسطة في مناطق ذات كثافة أقصاها 40 بيضة في طبق بتري 6cm.
3. أجنة الميداكا تطوير أبطأ قليلا من الزرد حتى 27 درجة مئوية. توقيت الفقس يختلف بين النوعين ؛ الأجنة الميداكا يفقس من المشيماء في 7 أيام وتبدأ على الفور في السباحة وتناول الطعام ، في حين أن الأجنة الزرد يفقس في 2 يوما ولكن البدء في السباحة وتناول الطعام في 5-6 أيام. يقام تطوير الميداكا وفقا ^ل4 التدريج في Iwamatsu.
4. ويمكن وضع الأجنة الميداكا تعديلها بسهولة لخطط تجريبية من خلال تحديد درجة الحرارة المناسبة. يمكن إيقاف تطور الأجنة الميداكا عند درجة 4 في التطور المبكر. بعد المرحلة 24 عندما يبدأ الضرب في القلب ، يمكن أن تباطأ التطوير باستخدام درجة حرارة تقل عن 18 درجة مئوية.
5. توقيت ظهور أجهزة / الأنسجة يختلف قليلا في الميداكا مقارنة مع الزرد ، أي في somitogenesis الميداكا يحدث بعد ظهور نمو المخ في حين somitegenesis الزرد تسبق نمو المخ.

2. إزالة المشيماء

والمشيماء من الميداكا يتكون من طبقتين طبقة واقية مع الداخلية الصلبة والناعمة على سطح الخارجي. وهكذا ، فإن العلاج البروتيني على مرحلتين ويعمل انزيم pronase الفقس هو ضروري لإزالة هذا المشيماء.

يجب أن تبقى dechorionated مرة واحدة والأجنة في BSS 1X. وشبه عقيمة الشروط على تعزيز ثقافة ناجحة للأجنة dechorionated ، وخصوصا عندما يطلب من فترات أطول من الملاحظة. وتشمل هذه الحلول العقيمة به (مثل تعقيم 1X BSS بالمضادات الحيوية) ، وتعقيم الأدوات الايثانول مع 70 ٪ تليها الشطف مع BSS 1X.

كما dechorionated الميداكا الأجنة أكثر نعومة وأكثر هشاشة من الأجنة الزرد dechorionated ، يجب اتخاذ المزيد من الحيطة لضمان عدم الاتصال أو فقاعات الهواء في ماصة ، لأن هذا سوف يسبب انهيار فوري. لضمان الحد الأدنى من الضرر إلى الأجنة ، يجب استخدام واسع الفم ماصة للحرارة الزجاج المصقول مع مضخة ماصة للنقل الأجنة ويجب الاستفادة منها حلقة الشعر لتوجيه الأجنة للمراقبة. وينبغي استخدام غير ملتصقة أطباق بتري لمنع الأجنة من الالتصاق على الأسطح.

1. وينبغي قبل أن يتم التحقق dechorionation أنه تم فصل البيض بما فيه الكفاية وتنظيف.
2. لأن كلا pronase والانزيمات هي proteinases الفقس ، ينبغي أن تظل على الجليد والتقليل من التعرض للأجنة لهذه الأنزيمات.
3. نقل البيض إلى الصنفرة (P2000 حجم حصى ، ماء) توضع في غطاء طبق بيتري 9cm. إزالة الزائدة المتوسطة الحجم ولكن ضمان كاف يبقى لمنع جفاف للأجنة.
4. لفة بلطف الأجنة لحوالي 45-60 ثانية لإزالة بعض الشعرات السطح الخارجي ودرجة خفيفة من سطح المشيماء (الشكل 1). نقل الأجنة العودة الى طبق بيتري الأصلي وفحص.
   
   عند الأجنة المتداول على الصنفرة استخدام السبابة ، وتطبيق الحد الأدنى من الضغط وحفظ الاصبع موازية لسطح الرمل ورقة. لا لفة أكثر من الأجنة 5-7 في آن واحد. وهذه الاحتياطات تقلل من خطر سحق الأجنة تحت بعضها البعض.
   
   
5. استبدال المتوسطة البيض في صحن مع pronase 20mg/ml والأجنة لاحتضان 40-60 دقيقة حتى 27 درجة مئوية.
   
   وتغطي بشكل كاف من الأجنة pronase ضمان وجود غطاء على طبق. يجب أن تبقى غير مستخدمة pronase على الجليد خلال هذه الخطوة لتقليل الذاتي الهضم ويمكن إعادة استخدامها حتى يتم فقدان النشاط (حوالي 1-2 أسابيع).
   
   
6. استرداد pronase لإعادة الاستخدام وغسل الأجنة 5X في وسط جنين لإزالة آثار pronase حيث سيؤدي ذلك إلى تعطيل انزيم الفقس التي يمكن ان تضاف.
7. إزالة المتوسطة الجنين والأجنة مع تغطية انزيم الفقس ، وضمان الجلوس الأجنة باعتبارها المونولاير في الطبق.
   
   إذا كان البيض يجلسون على رأس واحد آخر في طبق ، سيتم سحق هؤلاء في أسفل كما المشيماء يذوب. تبقي غير المستخدمة انزيم الفقس على الجليد.
   
   
8. احتضان الأجنة عند 27 درجة مئوية ، وبعد 15 دقيقة الاختيار دوريا التقدم الفقس باستخدام stereomicroscope.
   
   وسيتبين أن عددا من الثقوب حفرة شبيهة القمر تبدأ في الظهور في الطبقة الداخلية للالمشيماء ، الذي سرعان ما يذوب بعد هذا يترك طبقة الخارجي لينة من المشيماء إزالتها بسهولة manuallي. قد كامل عملية الفقس يأخذ 15-60 دقيقة.
   
   
9. حالما تخرج الأجنة من المشيماء ، ونقل الأجنة إلى طبق بتري تحتوي 1X BSS.
   
   ضمان عدم نقل انزيم الفقس إلى BSS 1X عن طريق لمس غيض من ماصة على سطح BSS السماح للأجنة للفة برفق.
   
   
10. حالما يتم نقل كل الأجنة من انزيم الفقس ، وجعل عملية نقل النهائي لآخر طبق جديدة من BSS 1X.
    
    هذا يضمن عدم تعرض الأجنة إلى أي بقايا انزيم الفقس ، لأن هذا سيضر الأجنة عرضة للخطر. مرة واحدة في هذا الطبق النهائي يمكن لأي الأجنة حيازة تزال الطبقة الخارجية من المشيماء تتحرر يدويا باستخدام ملقط معقم الصغرى تحت stereomicroscope.
    
    إذا الأجنة تحتاج إلى تطوير dechorionation التالية ، يجب إضافة البنسلين / الستربتوميسين لBSS لمنع نمو البكتيريا.
    
    

الشكل 1. مقارنة الأجنة وتوالت خلال بسطه dechorionation. نلاحظ كيف أن الأجنة توالت في لوحة باء نقص الشعر ينظر اليه على الأجنة في ألف لوحة بسطه

3. dechorionated الأجنة تصاعد

Agarose التضمين هو مفيد لفترات أطول من التصوير (مثل الوقت الفاصل بين التصوير) لأجنة حية فضلا عن ملاحظات تفصيلية الأجنة ثابتة. وأثناء تكون المعيدة organogenesis المبكر (المرحلة 14 الى المرحلة 28) والأجنة الميداكا يحمل موجات من الحركات الايقاعية مقلص عبر محيط بالأدمة ، طبقة النسيج التي تغطي كلا من الجنين النامي وصفار ^5. تعامل مع أجنة 3.5mM 1 - heptanol لوقف تحركات مقلص ^6.

لوقف حركة الأجنة بعد المرحلة 28 (64hpf) والأجنة والخدر وذلك بإضافة قطرات من mesilate Tricaine (TMS) قبل التضمين. يضاف أيضا إلى TMS agarose (إضافة سوى كمية ضئيلة ، هذه الجرعة يجب أن يكون الأمثل ، ما يقرب من تخفيف 1:25).

1. ذوبان كمية صغيرة من 3 ٪ انخفاض في درجة الحرارة التبلور agarose (1X في BSS) عن طريق التسخين إلى 37 درجة مئوية ودرجة الحرارة في هذه المحافظة.
2. الخطوات التالية تحتاج إلى أن تنفذ على وجه السرعة لضمان أن لا agarose ترسيخ قبل orientating الجنين. باستخدام ماصة زجاجية واسعة الفم نقل agarose المنصهر ما يكفي لملء غطاء من الاكتئاب أنبوب إيبندورف.
3. نقل جنين واحد dechorionated إلى التقليل من الاكتئاب قبعة تحمل اكثر من BSS مع الجنين. على الفور امتصاص agarose والجنين من الاكتئاب سقف ونقل إلى ثقافة بيتري غرفة الطبق.
   
   يتم استخدام طبق بتري 3.5cm مع نافذة زجاجية في القاع. التصوير باستخدام مجهر مقلوب والأجنة هي الموجه وجهها إلى أسفل الجسم وضعت على مقربة من زجاج الغطاء. التصوير باستخدام المجهر تستقيم ، يتم تصغير سمك agarose.
   
   
4. نقل طبق بيتري 3.5cm في طبق بتري قطرها 14cm تحتوي على الجليد والمياه (المياه تملأ لعمق مجموع تقريبا 1 / 3 من صحن كبير). في حين عقد غرفة أسفل بشدة على الجزء السفلي من صحن بيتري 14cm ، استخدم حلقة الشعر لتوجيه بلطف الجنين كما هو مطلوب في agarose المنصهرة والاستمرار على الجنين حتى يتصلب agarose برفق عن طريق رفع وخفض أصغر طبق إلى موقعها الأصلي في الماء المثلج.

4. زرع الخلايا في الأجنة الميداكا

الهدف من هذا الإجراء هو لتحديد ما إذا كانت الجينات في المصالح الأفعال خلية مستقلة (داخل الخلية) أو غير مستقل ، الخلية (بين الخلايا).

ويمكن تسمية الخلايا المانحة مع صبغة التتبع مثل رودامين - ديكستران قبل الزرع (كما هو موضح في "Microinjection الأجنة الميداكا" البروتوكول المرافق له إن الرب) أو سلالة معدلة وراثيا مع التعبير GFP يمكن استخدامها ، مما يسمح للزرع التقييم. مزيج من كل من تقنيات وضع العلامات غالبا ما تكون مفيدة للتغلب على صناعة السيارات في مضان التي يمكن أن يواجهها. الوقت الفاصل عن الدراسات التالية لزراعة الأعضاء ، GFP التعبير مفيد بشكل خاص.

يتبع استخدام ماصة الزجاج واسع الفم مع مضخة ماصة طوال هذا الإجراء ، وتعقيم جميع الأدوات (بما في ذلك شرائح) مسبقا مع EtOH 70 ٪ بحلول شامل الشطف مع BSS 1X العقيمة. وعادة ما توضع الأجنة المتلقي إلى حوالي 12 مرحلة كما يسمح هذا التمييز من القطبين بطني وظهري عند إجراء عمليات الزرع.

1. تبدأ dechorionating الأجنة 1.5 ساعة قبل الزرع والإعداد جهاز الحقن خلال حضانات الانزيم.
2. مكان شريحة المجهر تجويف داخل صحن قطره بيتري 9cm. إضافة كمية صغيرة من methylcellulose 3 ٪ إلى وسط الشريحة تجويف استخدام غيض ماصة معقمة وانتشار رقيقة.
3. methylcellulose الجافة لحوالي 1-2 دقائق.
4. إضافة 350μl من BSS 1X العقيمة لملء الاكتئاب الشريحة.
5. نقل جنين واحد المانحة والمتلقية الأجنة ما يصل إلى أربعة إلى الشريحة باستخدام ماصة الزجاج.
6. توجيه باستخدام أجنة حلقة الشعر حتى الأريمة الجنين تواجه صعودا.
   
   يمكن أن تكون الأجنة اتكأ ضد بعضها البعض لزيادة الاستقرار.
   
   
7. إدراج بلطف الإبرة الدقيقة في الأريمة المانحة وامتصاص الخلايا ببطء 10-20.
8. بلطف إدراج إبرة في المساحة المطلوبة من المتلقي الأريمة الجنين وطرد الخلايا ببطء. يجب توخي الحذر الشديد عند إدراج الخلايا في الأريمة المتلقي حتى لا يعطل خلايا الكيس المحي الحدود لأن هذا سوف يسفر عن وفاة الجنين.
9. من أجل تعقيم 1X BSS في طبق بتري.
   
   صب بعناية BSS في الطبق أقرب إلى جانب الطبق ممكن حتى لا تعطل الأجنة. لم تصب BSS مباشرة على الأجنة وإضافة BSS كافية بحيث يتم غمر الشريحة والأجنة.
   
   
10. إضافة 100μl من الستربتوميسين / البنسلين إلى الطبق والغطاء. نقل بعناية الطبق إلى 27 درجة مئوية حاضنة للسماح التطور الطبيعي.
11. يمكن أن تكون الأجنة وحظ دوريا على النحو المرغوب فيه. عند استخدام الزرع لتنفيذ كسب من بين وظيفة و / أو تجارب الانقاذ النمط الظاهري ، قد لاحظ بعض التغييرات الشكلية يكون نتيجة لآثار الزرع. وبالتالي زرع متعددة ضرورية. بعد 2-3 أيام ، وينبغي أن تكون موجودة على melanophores كيس المح والرأس والعينين والجذع. إذا كان موجودا على الأجنة ثم زرع ناجحة خرافي وعلى الأرجح تم إنتاج (الشكل 3).

إذا لزم الأمر المانحة الوراثي ، جنين (ق) عن طريق نقل إلى أنبوب PCR (ق) التي تحتوي على 25μl ك. 20mg/ml احتضان بروتيناز عند درجة حرارة 55 مئوية لمدة 4 ساعات تليها 10 دقائق في 94 درجة مئوية ، والاضطلاع PCR.

5. ممثل النتائج

الشكل 2. مثال لوضع الجنين agarose جزءا لا يتجزأ. ويرد الأمامي إلى اليمين والرأي الظهرية. ويمكن رؤية الخلايا البطانية على جانبي الجسم والجنين وصفت به GFP مدفوعا المروج FLI : لوحة ب.

الشكل 3. صور بعد زرع الأجنة. صورة ويظهر الجنين المانحة والمتلقية على الفور بعد الزرع. يظهر الجنين المانحة على الحق مع الأريمة الحمراء تماما (السهم). يظهر الجنين المتلقي على اليسار ويتم التعرف بسهولة من قبل كتلة صغيرة من الخلايا التي تم زرعها أحمر مرئية في الأريمة (رأس السهم). B يظهر صورة الأجنة المتلقي شهرين تقريبا 7 ساعات ما بعد الزرع (المحتضنة في 27 درجة مئوية). لاحظ الخلايا المزروعة هاجروا من موقع الزرع وتنتشر الآن في جميع أنحاء الأريمة (الأسهم). صورة C يظهر الجنين المتلقي في st.29 (74hpf تقريبا). لاحظ تصبغ في العين ووجود melanophores في المنطقة الجذع والدماغ (السهام). ويمكن رؤية هذه الخلايا التي تحمل علامات رودامين أن تستعمر العديد من الهياكل الجنينية مما يدل على الإنتاج الناجح لخرافي.

Discussion

نحن في هذا الفيديو لشرح كيفية dechorionate وتنفيذ transplanataion الخلية على الأجنة الميداكا. هذا هو أسلوب قوية لإنتاج أجنة خيالية لدراسة الجينات / وظيفة البروتين خلال التنمية ، فضلا عن توضيح الحكم الذاتي من الجين / بروتين في السؤال. الميداكا تشكل نموذجا مفيدا الفقاريات النظام لهذا الأسلوب نظرا لخرائط مصير راسخة والقروض التي تقدمها لهم بشكل جيد للشفافية في مجال التصوير في الوقت الحقيقي الجسم الحي. ويمكن الجمع بين زرع مع microinjection (كما هو موضح في "Microinjection الأجنة الميداكا" البروتوكول المرافق له إن الرب) بحيث يمكن للسلوك الخلايا المزروعة ملاحظتها بسهولة.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Embryo medium	Reagent	Made in-house	N/A	200ml 50X stock solution, 1ml 1%methyleneblue in H2O/10 liter RO water (50X stock solution: NaCl 14.7g, KCl 0.6g, CaCl2 2H2O 2.4g, MgSO4 7H2O 4.0g/1 litre RO water.)
Micro-dissecting forceps	Tools	55 INOX A.DUMONT&FILS	N/A	Very sharp fine tips for removal of chorion.
Fine waterproof sandpaper - p2000 grit size	Tools	Hermes Abrasives Ltd.	N/A	Very fine grit size for rolling/cleaning embryos with chorions.
3% methylcellulose	Reagent	Sigma	M 0512	High viscosity for holding embryos in place during transplantation.
1X BSS	Reagent	Made in-house	N/A	20XBSS: 130g NaCl, 8g KCl, 4g MgSO4.7H2O, 4g CaCl2.2H2O, and 10mg Phenol Red in 1L MilliQ water and autoclave; 500mM Hepes in MilliQ water autoclaved. Add 25ml 20XBSS and 15ml 500ml Hepes pH7.0, fill up to 500ml and filter sterilize before use.
Penicillin-streptomycin	Reagent	Gibco	15140-122	Added to BSS when incubating dechorionated embryos.
Pronase	Reagent	Calbiochem	53702	For dechorionation.
Hatching enzyme	Reagent	Made in-house	N/A	For dechorionation.
Tricaine mesilate (TMS)	Reagent	Sigma	A-5040	400mg tricaine in 97.9ml distilled water and 2.1ml 1M Tris, pH adjusted to 7; 4.2ml of this solution in 100ml clean tank water.
3% ultra-low gelling temp. agarose	Reagent	Sigma	A-2576	Type IX-A. Used during embedding of embryos for observation.
Petri dish culture chamber	Tool	Iwaki, Asahi Techno Glass Corp.	11-004-008	Iwaki glass base dish 35mm with 12mm window. Used during embedding of embryos for observation.
Micromanipulator	Equipment	Narishige	N/A	Model MN151. For removal and insertion of cells during transplantation.
Borosilicate glass capillaries	Tool	Harvard Apparatus	GC100-10T	For making transplantation needles.
Flaming/Brown micropipette puller	Equipment	Sutter Instrument Co.	Model P-97	For making transplantation needles.