Hoe te Cultuur, Record en het stimuleren van neuronale netwerken op de Micro-elektrode arrays (MEA's)

Summary

Dit protocol biedt de nodige informatie voor het opzetten, zorg voor, opname van en elektrisch stimuleren van culturen op MMO's.

Abstract

Voor de laatste eeuw hebben veel neurowetenschappers over de hele wereld hun leven gewijd aan het begrijpen hoe neuronale netwerken werken en waarom ze stoppen met werken in verschillende ziekten. Studies hebben opgenomen neuropathologisch observatie, fluorescentie microscopie met genetische etikettering, en de intracellulaire opname in zowel los neuronen en slice preparaten. Dit protocol gaat in een andere technologie, wat inhoudt dat steeds meer los neuronale culturen op micro-elektrode arrays (ook wel multi-elektrode arrays, MMO's).

Er zijn meerdere voordelen aan het gebruik van dit systeem ten opzichte van andere technologieën. Gedissocieerd neuronale culturen op MMO's zorgen voor een vereenvoudigd model waarin het netwerk activiteit met elektrische stimulatie sequenties worden gemanipuleerd via meerdere van de array elektroden. Omdat het netwerk klein is, is de invloed van stimulatie beperkt tot de waarneembare gebieden, die niet het geval is in intacte preparaten. De cellen groeien in een monolaag het aanbrengen van wijzigingen in de morfologie eenvoudig om toezicht te houden met verschillende beeldvormende technieken. Ten slotte kunnen culturen op MMO's overleven voor meer dan een jaar in vitro waarin geen duidelijke tijd beperkingen die inherent zijn met andere kweektechnieken verwijderd ^1.

Ons laboratorium en anderen over de hele wereld maken gebruik van deze technologie om belangrijke vragen te stellen over het neuronale netwerken. Het doel van dit protocol is om de nodige informatie te verstrekken voor het opzetten, zorg voor, opname van en elektrisch stimuleren van culturen op MMO's. In vitro netwerken bieden een middel voor het stellen van fysiologisch relevante vragen op het netwerk en cellulair niveau leidt tot een beter begrip van hersenfunctie en dysfunctie.

Protocol

A. Inleiding

Er zijn miljarden neuronen in de menselijke hersenen. Elk van deze neuronen kunnen honderden tot duizenden verbindingen vaak tijden met veel verschillende cellen. Deze verbindingen haven van de signalen die ons in staat stellen om te wandelen, een piano te spelen, fietsen, lachen, huilen, en te onthouden. Voor de laatste eeuw hebben veel neurowetenschappers over de hele wereld hun leven gewijd aan het begrijpen hoe neuronale netwerken werken en waarom ze stoppen met werken in verschillende ziekten.

Er zijn veel tools men kan gebruiken bij het nemen van deze schijnbaar onoverkomelijke taak. Eerste studies waren gericht op neuropathologische observatie van hoe de neurale circuits worden georganiseerd in de hersenen van mensen en andere dieren. De komst van fluorescentie microscopie en genetische kenmerken de reikwijdte van deze structurele studies waarin wordt gezocht cellulaire samenstelling tot aan de eiwitten en DNA-niveau.

Maar deze experimenten niet ingegaan op de dynamische functie van de hersenen, alleen de statische regeling. Voor het begrip van lopende neurale activiteit, populaire technieken over het algemeen gericht op het onderzoeken van elektrofysiologische activiteit met intracellulaire opname. Enkele neuronen van gescheiden culturen een nuttige reductionistisch model, maar deze techniek is beperkt door de korte tijdsintervallen voor het opnemen van enkelvoudige cellen. Dit model geeft ook weinig informatie over andere cellen in het netwerk. Brain plakjes van knaagdieren zorgen voor meer van een realistisch model waar de corticale architectuur wordt gehandhaafd. Maar een dergelijke schijfjes, zelfs wanneer gekweekt, hebben een beperkte levensduur en kan technisch gezien een uitdaging in leven te houden met behoud van cytoarchitecture ^2.

Een andere technologie gaat steeds los neuronale culturen op micro-elektrode arrays (ook wel multi-elektrode arrays, MMO's). Neuronen zijn uitgeplaat op MMO's die micro-elektroden zijn ingebed in de bodem van de schotel. In de loop van drie weken, deze culturen vormen netwerken van neuronen, compleet met axonen, dendrieten en honderden, zo niet duizenden van synaptische verbindingen. Er zijn meerdere voordelen aan het gebruik van dit systeem ten opzichte van andere technologieën. Gedissocieerd neuronale culturen op MMO's zorgen voor een vereenvoudigd model om mee te werken (in de orde van een corticale kolom in plaats van een intacte hersenen). De cellen groeien in een monolaag het aanbrengen van wijzigingen in de morfologie eenvoudig om toezicht te houden met verschillende beeldvormende technieken. Netwerk activiteit kan worden gemanipuleerd met elektrische stimulatie sequenties door meerdere van de array elektroden. Omdat het netwerk klein is, is de invloed van stimulatie beperkt tot de waarneembare gebieden, die niet het geval is in intacte preparaten. Tot slot, culturen op MMO's kan overleven voor meer dan een jaar in vitro waarin geen duidelijke tijd beperkingen die inherent zijn met andere kweektechnieken verwijdert. ¹ Daarom, culturen op MMO's vormen een ideaal model voor het bestuderen van neuronale connectiviteit.

Ons laboratorium en anderen over de hele wereld maken gebruik van deze technologie om belangrijke vragen te stellen over het neuronale netwerken. Huidige neuronale processen worden bestudeerd met dit model zijn netwerk dynamiek, ontwikkeling, leren en geheugen, synaptische plasticiteit, excitotoxiciteit, ischemie en neurodegeneratie. ^3-10 Bevindingen uit deze studies kunnen belangrijke implicaties hebben voor het scheppen van betere behandelingen voor ziekten van de mens, zoals aangeboren misvormingen, epilepsie , beroerte en de ziekte van Alzheimer. Het doel van dit protocol is om de nodige informatie te verstrekken voor het opzetten, zorg voor, opname van en het stimuleren van culturen op MMO's. Het uiteindelijke doel is om een ​​middel te bieden voor onderzoekers om fysiologisch relevante vragen te stellen op cellulair en netwerk niveaus die wellicht kunnen leiden tot een beter begrip van de hersenen functioneren en disfunctioneren en uiteindelijk ook de behandeling van ziekten die onze neuronen en hoe ze communiceren beïnvloeden.

Het volgende protocol vertegenwoordigt meer dan 10 jaar ervaring van ons lab in kweken, opname van en het stimuleren van neuronale netwerken op micro-elektrode arrays. Elke stap is zo geoptimaliseerd om leiden tot de ontwikkeling van lange overleven gezonde neuronale netwerken. Referenties zijn verstrekt wanneer zij beschikbaar, terwijl sommige optimale instellingen hebben we vastgesteld empirisch. Voorafgaand aan de inleiding van de protocol, het verkrijgen van apparatuur en benodigdheden en bereid oplossingen, zoals vermeld in het hoofdstuk 'Materialen'. Het gedeelte over 'Brain Dissection' zal kort worden besproken, maar niet aangetoond in de bijbehorende video als andere Journal of Gevisualiseerde Experiment artikelen behandelen dit onderwerp ^11.

B. Brain Dissection

1. Hele hersenen zijn uit embryonale dag 18 (E18) ratten. Timed-zwangere vrouwelijke ratten worden verdoofd met geïnhaleerde isofluraan en onthoofd. Embryo's worden verwijderd en ontleed volgens de National Research Council Guide voor de verzorging en het gebruik van proefdieren met behulp van een protocol is goedgekeurd door de Emory University IACUC.
2. Terwijl met behulp van aseptische technieken, zijn de embryonale hersenen verwijderd en geplaatst in Balanced Zouten oplossing koud Hank's (HBSS) in een 100 mm steriele petrischaal. De rest van de dissectie protocol gebeurt onder een microscoop in het ontleden van een laminaire stroming kap te minimaliseren risico op contaminatie.
3. De rat hersenen worden overgedragen een voor een naar een tweede steriele petrischaal met HBSS voor dissectie. Terwijl ondergedompeld in HBSS, zijn de hersenstam, de thalamus en het cerebellum weggesneden en de hemisferen zijn gehalveerd.
4. De olfactorische knobbel wordt gebruikt als een handvat voor het beveiligen van het halfrond, terwijl zachtjes het verwijderen van de hersenvliezen.
5. De cortex is vervolgens geschild uit de buurt van de onderliggende hippocampus en het striatum en opgeslagen in een steriele 15 ml conische buis in de slaapstand oplossing op ijs. ¹² Aangezien er meestal meerdere embryo's, wordt deze procedure herhaald, afhankelijk van het gewenste aantal MEA te plated en de gewenste cel dichtheid. Cortex worden gecombineerd voor de cel dissociatie-proces, zoals hieronder besproken. Cortex kan worden opgeslagen bij 4 ° C in de slaapstand oplossing voor tot 24 uur voorafgaand aan dissociatie met slechts een minimaal verlies van de levensvatbaarheid van de cel. Als alternatief voor gebruik weefsel ontleed in huis, kan ontleed hersenweefsel wordt de aankoop van Brain Bits ( www.brainbitsllc.com ).

C. MEA voorbereiding en corticale dissociatie

1. De MEA worden verkregen uit ALA Scientific ( www.alascience.com ), een leverancier voor de fabrikant, Multi-Channel Systems. Er zijn verschillende configuraties van de MMO's met variaties in elektrode oriëntatie en afstand, aanwezigheid of afwezigheid van een interne aardklem elektrode, aan-of afwezigheid van een glas ring, en de grootte van het glas ring. Voor onze basic experimenten gebruiken we de standaard micro-electrode array met 60 elektroden in een 8 bij 8 rooster regeling met een klein glas ring. De titanium nitride elektrode diameter is 30 micrometer en de afstand tussen de elektrode centers is 200 micrometer. Een van de elektroden is groter en functioneert als de grond of interne referentie-elektrode. Bij het hanteren van MMO's, is het van vitaal belang dat er geen massieve objecten (bijv. pipetpunten, papieren zakdoekjes, of rubber politieagenten) ooit de binnenkant van de schotel raken, omdat dit kan schade aan de elektroden. Meer gedetailleerde informatie over MMO's en de behandeling kan worden gevonden in de MEA handleiding ( www.multichannelsystems.com / products-MEA / micro-elektrode-arrays.html ).
2. Op de avond voorafgaand aan de cel voorbereiding, zijn de MMO's gespoeld met gedeïoniseerd water en vervolgens toegestaan ​​om in 70% ethanol weken gedurende 15 minuten. De gerechten worden dan geplaatst in een laminaire stroming kap met het UV-licht 's nachts. Voor de behandeling van doeleinden, wordt elk MEA geplaatst in een standaard 100 mm steriele polystyreen petrischaal met dadels en de etikettering op de petrischaal. Van de nota, andere technieken, waaronder sterilisatie autoclaaf en gebruik te maken van water bij 90 ° C worden genoemd in de MEA gebruikers handleiding. We hebben echter ontdekt dat empirisch autoclaaf lijkt te verminderen het aantal keren dat een MEA kan worden gebruikt. Als u het hergebruik van MMO's die op dit moment culturen, dan is het organisch materiaal moet worden verwijderd. 300 tot 400 pi van 0,25% trypsine in PBS is geïncubeerd op het MEA bij 35-37 ° C gedurende 20 minuten. De MEA is gespoeld met gedeïoniseerd water en vervolgens geïnspecteerd met een lichtmicroscoop. Als cellulaire kwestie nog steeds, dan is de trypsine stap wordt herhaald totdat schoon. Als de schotel schoon is, ga dan met de sterilisatie stap zoals hierboven. In het algemeen kan MMO's worden hergebruikt meerdere keren met de juiste zorg.
3. Ook op de avond voorafgaand aan de beplating zijn de MEA deksels voorbereid en geautoclaveerd. De deksels zijn op maat gemaakt, maar kan ook worden gekocht bij ALA-Scientific. Ze zijn gemaakt van polytetrafluorethyleen Teflon en hebben een duidelijke membraan (gefluoreerd ethyleen-propyleen Teflon) uitgerekt langs de bovenkant. Het membraan laat de diffusie van gassen, maar beperkt de verspreiding van water waardoor vrijwel het elimineren van de noodzaak voor een vochtige atmosfeer en het voorkomen van de schadelijke effecten van de verdamping en hyperosmolariteit ^1.
4. Zodra de dissectie bovenstaande is voltooid, MEA voorbereiding wordt voortgezet door het plaatsen van 100 ul polyethyleenimine (PEI) oplossing in het midden van elke MEA. ¹³ In onze handen, PEI oplossing biedt minder clustering van de cellen in de MEA dan het gebruik van polylysine. De schotel is toegestaan ​​om op kamertemperatuur te zitten in de laminaire stroming kap voor 30 minuten met deksel lichtjes rusten op de MMO's om verdamping te voorkomen. Als een herinnering, moeten alle werkzaamheden met de open MEA-of hersenweefsel plaatsvinden in een standaard celkweek laminaire flow kap aan mini-Mize het risico van besmetting.
5. De MEA is dan gespoeld drie keer met 1-2 ml steriele gedeïoniseerd water. De ideale laminar flow hood set-up zal een afzuiger apparatuur voor het verwijderen van vloeistof uit gerechten. Een steriele 200μl pipetpunt kan worden bevestigd aan de aspirator slang. Raak het oppervlak van de MEA, terwijl aspireren, want dit kan beschadiging van de elektroden. Na de laatste spoeling wordt de MEA drogen gedurende minstens 30 minuten in de laminaire stroming kap.
6. Tijdens deze droogtijd, is de neuronale dissociatie proces gestart door het plaatsen van de cortex in 2 ml van papaïne oplossing in een 15 ml steriele conische plastic flacon. ¹ 50 ui van DNAse wordt toegevoegd aan het mengsel. De flacon is geplaatst in een waterbad van 35-37 ° C en gedurende ongeveer 20 minuten. Tik voorzichtig de oplossing om de 5 minuten voor het mengen en voorzichtig om voorkomen dat er bubbels. De cortex moet beginnen te nemen op een vage verschijning als de spijsvertering verloopt.
7. De papaïne oplossing wordt vervolgens zorgvuldig verwijderd door pipetteren het verlaten van de cortex in de 15 ml conische flacon. 2 ml van cel medium wordt toegevoegd aan de cortex, toegestaan ​​om incubeer gedurende 2-3 minuten en vervolgens voorzichtig verwijderd. Dit is uit te spoelen eventueel resterende papaïne, die ook zullen worden geremd door het serum in het medium. Een andere 2ml van cel medium wordt toegevoegd aan de cortex en dit monster wordt vervolgens vortex op hoge snelheid gedurende 5-10 seconden. Er moet een troebele oplossing in de bodem van de 15ml conische flacon en geen resterende stukken worden de hersenen. Als alternatief, tritureren met 1 ml medium door drie keer met een P-1000 de hand-held pipet kan worden gebruikt voor dissociëren het weefsel. ¹ Voor een goede tritureren, elke pipet slag moet een seconde nemen.
8. De oplossing is dan toegestaan ​​om voorzichtig passeren een steriele 40μm zeef cel via de zwaartekracht. Voeg langzaam de cel oplossing een druppel op een moment in de zeef met een P-1000. Een 35 mm steriele petrischaal wordt gebruikt voor het verzamelen van de gespannen cel oplossing.
9. De celsuspensie wordt vervolgens weer overgebracht naar een 15 ml conische flacon en cel medium wordt toegevoegd aan een eindvolume van 4,0 ml. ¹⁴
10. 500 ul van een 5% w / v BSA-oplossing is dan voorzichtig gelaagd in de bodem van de flacon van 15 ml conische met een P-1000. ¹⁴ Hierdoor wordt de cel-bevattende oplossing naar boven in de flacon verdringen.
11. De cel oplossing met BSA gelaagde in de bodem wordt dan gecentrifugeerd gedurende 6 minuten op 200 xg aan kleine puin en potentieel toxische intracellulaire inhoud te verwijderen. ¹⁴
12. Tijdens de cel centrifugatie stap worden de MMO's visueel beoordeeld te zorgen dat ze helemaal droog zijn. 20 ui van laminine oplossing zijn dan voorzichtig geplaatst in het midden van de MEA ervoor te zorgen dat alle van de elektroden worden gedekt. ​​Vermijd ^een introductie van luchtbellen in deze oplossing, omdat die kan leiden tot onvoldoende voorbereiding van het elektrode-oppervlak. Als de MEA is niet helemaal droog is, dan is de daling van laminine zal verspreid over de schotel potentieel waardoor het moeilijker voldoende om de cellen over de elektroden te lokaliseren wanneer plating. Deze stap is zeer delicaat en heeft de potentie om te MEA oppervlak te beschadigen leiden met een onvaste hand of vervallen in de aandacht.
13. De Teflon deksels zijn geplaatst op de MEA op dit punt om verdamping van de laminine te voorkomen. Plaatsing van het deksel is ook delicaat. Een deksel mag alleen worden geplaatst of verwijderd wanneer de MEA is op een volledig vlakke ondergrond. Anders kan extra krachten uitgeoefend door een oneffen oppervlak barst de glazen bodem van de array waardoor deze onbruikbaar wordt. Het gerecht wordt dan geplaatst in de incubator gedurende 20 minuten.
14. Terwijl de laminine is binding aan de schotel, is de 15 ml conische flacon met de cellen uit de centrifuge en overgebracht naar de laminaire stroming kap. Een pellet moet zichtbaar zijn in de bodem van de flacon. Het supernatant wordt zorgvuldig verwijderd met een steriele plastic 5ml serologische pipet. Bewaar het supernatant in het geval het centrifugeren proces was onvolledig. De pellet wordt vervolgens voorzichtig ofwel opnieuw gesuspendeerd door trituratie met een P-1000 of een snelle vortex in 300-500 pi celmedium, afhankelijk van de verwachte opbrengst. 10 ul van celsuspensie wordt verwijderd en geplaatst op een hemacytometer naar cel de concentratie te bepalen. Als de opbrengst laag is, onderzoek de bovenstaande onder de microscoop om te bepalen of het centrifugeren stap was onvolledig. Herhaal het centrifugeren kan nodig zijn. Indien het rendement hoog is, dan is een verdunning kan het nodig zijn om meer nauwkeurige telling. Cel-plating dichtheid kan variëren van 5.000 tot 300.000 cellen per MEA. Bereken een verdunning, zodat het gewenste aantal cellen voor plating is in een eindvolume van 15-20 ul. We gebruiken meestal een uiteindelijke concentratie van 1000 tot 3000 cellen per il. Een paar van de cortex zal typisch opbrengst tussen 10 en 15 miljoen cellen. Dit aantal kan iets lager zijn als fijnwrijving wordt gebruikt.
15. Tegen die tijd, thij laminine incubatie op de MEA moet compleet zijn. De Teflon deksel wordt verwijderd uit de MEA en de meeste van de laminine daling is vacuüm afgezogen of weg gepipetteerd. Dan 15 tot 20 ul van de gewenste celsuspensie wordt onmiddellijk gepipetteerd op de resterende vochtige gebied van laminine. Wees voorzichtig om te voorkomen dat er luchtbellen in dit kleine volume van de celsuspensie als luchtbellen kunnen cellen voorkomen dat gelijkmatig over alle van de elektroden. Het deksel is zacht vervangen en de MEA wordt zorgvuldig terug geplaatst in de incubator gedurende 30 minuten. Het gerecht wordt dan geïnspecteerd onder de lichtmicroscoop om ervoor te zorgen dat de cellen hebben gehouden en alle van de elektroden. Als alle elektroden worden niet gedekt, dan meer cellen kunnen worden toegevoegd en de MEA is terug in de incubator met deksel op, zodat deze nieuwe cellen te hechten. Wanneer een buis van de cel suspensie wordt gebruikt meer dan een paar minuten na zitten ongestoord, moet u voorzichtig draai hem aan de vaste cellen te mengen. Als voldoende elektrode dekking wordt bereikt, dan is de schotel langzaam overspoeld met 1 ml warm (35-37 ° C) cel medium. De Teflon deksel is vervangen en de schotel is terug geplaatst in de incubator. De laminaire stroming kap kan snel drogen van de kleine volumes en laminine celsuspensie volumes eenmaal op de MEA, zodat zorg om hen verzegeld met de Teflon deksels. De ideale incubator omgeving voor de verzegelde MMO's is 5% CO _2, 9% O ₂ en 65% vochtigheid bij 35-37 ° C. Lage zuurstof spanning is van belang voor de lange termijn culturen, het verminderen van oxidatieve schade. ¹² Onderhoud 65% luchtvochtigheid vermindert de verdamping door het Teflon membraan (in vergelijking met geen vocht controle) en laat MEA elektronica worden gebruikt in de incubator, zonder schade door condensatie van het water (zoals met een normale incubator bevochtigd tot verzadiging).

D. Veranderen celmedium en de zorg voor gedissocieerde culturen op MMO's

1. Op de dag na cel plating, inspecteer de MEA onder de lichtmicroscoop. Als de kleur van het medium is nog steeds perzik te rood van kleur en er is een beperkte hoeveelheid van cellulaire puin en celdood, dan is het eerste medium verandering kan worden uitgesteld voor een andere dag. Echter, als het medium begint te verschijnen meer oranje of geel van kleur en / of er is een grote hoeveelheid van cellulaire puin en celdood, verander dan het medium. Alle medium veranderingen moeten plaatsvinden in een standaard celkweek laminaire flow kap.
2. Het eerste medium verandering bestaat uit het verwijderen van de MEA deksel, opzuigen weg van alles van het medium in de schaal, het vervangen van de hoeveelheid verwijderd met verse celmedium, en plaats het deksel. Vervang het volledige bedrag van de cel medium op het eerste medium te veranderen om alle resterende cellulair vuil te verwijderen uit de plating proces. Latere wijzigingen moeten medium slechts enkele aspiratie ongeveer de helft van het medium, gevolgd door het vervangen van de hoeveelheid verwijderd met vers medium. Dit maakt een aantal van de groeifactoren die zijn uitgescheiden in de cel medium te blijven met de cellen het onderhouden van een meer optimale groeiende omgeving. Als de onderkant van het deksel is besmet tijdens het medium veranderingsproces of als het deksel tekenen van schade of loszittende, dan gebruik maken van een nieuw geautoclaveerd deksel. Cel medium kan worden opgeslagen in de incubator in een steriele container met een custom aangepaste deksel (dat heeft een Teflon (gefluoreerd ethyleen-propyleen) membraan om voor gasvormige interchange). Celmedium kunnen ook worden opgeslagen bij 4 ° C, maar warm en dit in de incubator evenwicht voorafgaand aan de veranderende medium.
3. Verwijder en vervang ongeveer de helft van het medium in een schotel ongeveer twee keer per week. Sommige mobiele preparaten kunnen leiden tot snellere kleurveranderingen in het medium waardoor er een behoefte aan meer frequente veranderingen. Als medium wordt opgemerkt te worden geel, verander dan het volledige bedrag van medium. Snelle overgang naar geel kan ook het teken van de verontreiniging, zodat inspecteren de schotel onder de lichtmicroscoop voor visuele tekenen van infectie.
4. Afhankelijk van de experimenten voorwaarden en steriele techniek kunnen culturen die zorgvuldig zijn verzorgd overleven voor meer dan een jaar ^1.

E. Opnemen van MMO's

1. Elke MEA heeft 59 registrerende elektroden en een interne massa-elektrode. Er zijn verschillende commerciële recording systemen beschikbaar zijn, evenals op maat gemaakte versies. Verkopers zijn Multi-Channel Systems, Tucker Davis Technologies, Axion Biosystems, Alpha Med Wetenschappelijk MED64, Plexon, Ayanda Biosystems en BioLogic. Ons laboratorium gebruikt momenteel een commerciële inrichting van Multi-Channel Systems, een speciaal ontworpen Windows-gebaseerd systeem met de naam NeuroRighter ^15, en een speciaal ontworpen Linux-gebaseerd systeem, genaamd MeaBench ^16. Elk van deze systemen is in staat om op te nemen van de MEA (Multi-Channel Systems) met behulp van een Multi-Channel Systems voorversterker. Een commerciële opstelling van Tucker Davis Technologies is ook in gebruik. Dit protocol zal aantonen opname van MMO's met NeuroRighter. NeuroRighter software is open-source en is gratis te downloaden, samen met de hardware ontwerpen op NeuroRighter Google groepen. ( http://sites.google.com/site/neurorighter/ )
2. Culturen op te nemen MEA 2-3 weken om een constante staat van activiteit te bereiken. ^17,18 Deze activiteit omvat spontane actiepotentialen en cultuur-brede barsten (een spervuur ​​van actie potentialen die synaptisch verspreidt over een cultuur). De aard van het experiment zal echter bepalen het ideale aantal dagen in vitro voor de opname.
3. Neuronale activiteit is afhankelijk van de ideale weersomstandigheden na, zoals temperatuur en pH. ¹ Als gevolg hiervan, onze opname vindt plaats in de incubator zoals hierboven beschreven. Als korte experimenten (<30 minuten) worden ontworpen, is er ook een commercieel verkrijgbare verwarming module die aan het MCS voorversterker worden aangesloten voor het behoud van de ideale MEA temperatuur.
4. Opname te starten, is een MEA (nog in de petrischaal) voorzichtig overgebracht van de opslag incubator om de opname te incubator. Houd de bodem van de schaal parallel aan de grond. Vermijd snelle bewegingen met de MEA of stoten van de MEA als deze kan de cultuur los van het substraat. De MEA is vervolgens verwijderd uit de petrischaal en geplaatst in de opname voorversterker. Overeen met de interne massa-elektrode in de gerechten die we op dit moment tonen met de grond elektrode op de voorversterker (kanaal CR15 voor de MCS voorversterker). Veeg de contacten rond de perimeter van de MEA met behulp van een tissue of wattenstaafje bevochtigd met 70% ethanol om vingerafdrukken of ander vuil dat een goede verbinding zouden kunnen hinderen. Na ervoor te zorgen dat de MEA correct is geplaatst, is de voorversterker deksel vervolgens zakken en vergrendeld op zijn plaats. De contacten op de voorversterker deksel moet goed rusten op de elektrode contact pads op de MEA. Inspecteer visueel contact uitlijning en aan te passen met een wattenstaafje indien nodig. Plaats de voorversterker op het Peltier apparaat in de incubator. Deze bestaat uit twee koperen platen met een Peltier thermo-warmtepomp ingeklemd tussen hen. We lopen dit op ongeveer 5V, om een ​​deel van de warmte geproduceerd door de voorversterker circuit te verwijderen. Dit voorkomt condensvorming aan de binnenkant van de Teflon membraan deksel. Eventuele condensatie zou wijzen op schade toebrengen aan de cultuur door toename van de osmolariteit van het medium in contact met de cellen, als gevolg van verdamping. Door ervoor te zorgen dat de voorversterker en het medium zijn een graad of twee lager dan de incubator luchttemperatuur, worden veranderingen in de osmolariteit geminimaliseerd.
5. Schakel de voeding van NeuroRighter en open de software op het werkstation. Pas NeuroRighter instellingen om in vitro met de juiste software / hardware-configuraties ook op zijn plaats. Selecteer het aantal elektroden in de software. Om de hoeveelheid achtergrondgeluid te verminderen, kan een digitale band-pass filter worden ingeschakeld. Selecteer een data-bestand met het record te schakelen als de gegevens moeten worden opgeslagen voor latere analyse. Activeer de start knop een keer alle juiste instellingen worden gekozen.
6. Het scherm moet blijken lopen sporen van activiteit en achtergrondgeluiden. Af en toe actiepotentialen en schotel grote uitbarstingen van activiteit zichtbaar moeten zijn. De sectie hieronder over het oplossen van problemen opname van MMO's zullen we verschillende veel voorkomende problemen als de verwachte activiteit niet gevisualiseerd.
7. Het scherm kan worden veranderd in spike detectie-modus ('Spk WFMS' tab), waar actiepotentialen statisch worden weergegeven zoals ze voorkomen in 3 ms tijdvensters. Voor een bepaald kanaal, moeten de reële extracellulaire actiepotentialen duren ongeveer 1ms en moet herhaaldelijk brand in de dezelfde richting (positief of negatief). Af en toe, kunnen twee of meer neuronen zichtbaar zijn op dezelfde elektrode met verschillende polariteit. Spikes met een korte tijdsverloop en variabele polariteit waarschijnlijk artefact. Figuur 1 toont een raster plot van spike gegevens.
8. Het scherm kan worden aangepast aan de lokale veld potentialen (LFP's) voor een blik op het lokaliseren van de oorsprong van barsten activiteit. Dit type instelling kan meer handig zijn als u in vivo sinds monolaagculturen zwakke LFP's. Van de nota, sommige voorversterkers (waaronder een die we gebruiken van Multi-Channel Systems) hebben high-pass filters bij 10 Hz, die zal verminderen lagere frequentie LFP ritmes.

F. Het stimuleren van neuronale netwerken op MMO's

1. Dezelfde 59 registrerende elektroden op een MEA kan ook worden gebruikt voor het stimuleren van de cultuur. De aard van het experiment zal bepalen de mate van stimulatie. NeuroRighter biedt flexibiliteit voor de stimulatie experimenteel design, omdat het open source code. ¹⁵
2. De uitdaging met het stimuleren van een cultuur is dat de stimulus een artefact dat kan duren enkele milliseconden creëert. Dit artefact kan groot genoeg zijn om spike detectie en obscure stimulans reacties veroorzaken. NeuroRighter maakt gebruik van de Salpa algoritme voor het minimaliseren van en in sommige gevallen in wezen het elimineren van de stimulus artefact. ¹⁹
3. Het stimuleren van de neuronale netwerk op de MEA, trein de Salpa algoritme onder de 'Opname-instellingen' tab om de stimulatie artefact te beperken. Activeer Salpa in de 'Online tabblad Instellingen. Selecteer een bestand en klik op de knop Start, zoals eerder om de opname te starten. Klik vervolgens op de 'Stim' tabblad. Er zijn veel keuzes voor het opzetten van stimulatie op deze pagina.
4. Een eenvoudig experiment is om een ​​elektrode te stimuleren en het reactievermogen van de schotel te kijken met behulp van de 'Open loop' sectie. Selecteer de snelheid, spanning, fase breedte en het kanaalnummer. Druk op de Start-knop in de open lus sectie. Reacties op dit stimulatie kan worden gevisualiseerd op de belangrijkste 'Spikes' tab en de 'Spk WFMS' tab en geanalyseerd in de databestanden.
5. In real time, kan uitbarstingen worden gevisualiseerd in een tijd-locked manier om een ​​een hertz stimulans van 0.5V over meerdere elektroden. Figuur 2 toont een raster plot van een post-stimulus respons. Voorafgaande observaties hebben aangetoond dat er twee verschillende types van stimulus opgewekte activiteit:. Direct opgeroepen actiepotentialen (DAP) en synaptisch opgewekte actiepotentialen (SAP's) ²⁰
6. Neuronen in cultuur zijn spontane uitbarstingen van activiteit. Voor sommige experimenten, kan dit type op barsten interfereren met een poging om het netwerk te Dynamics Control. Interessant, kan gedistribueerd stimulatie bij 1-2 Hz per elektrode begint te onderdrukken barsten neuronale activiteit in een netwerk op een MEA. ²¹

G. Trouble-shooting opname van MMO's

1. Geen actie potentialen of barsten aanwezig zijn in het MEA wanneer de software is ingeschakeld:
   1. Is de cultuur van oud genoeg? Actiepotentialen zichtbaar moet zijn tegen het einde van de eerste week in vitro. Barsten komt ongeveer twee tot drie weken in vitro.
   2. Is de hardware stroom krijgt? Het systeem maakt gebruik van twee NeuroRighter 6V lood-zuur batterijen aan de macht van de hardware. De stroomschakelaar moet in de aan positie en in rekening gebrachte batterijen.
   3. Is de cultuur levend? Op sommige momenten kan dit lastig zijn om vast te stellen in het bijzonder in dicht of oudere cultuur, omdat van gliale cel begroeiing. Echter, men kan zoeken naar een gezonde verschijnen neuronen (glanzende, elliptisch gevormde cellichamen onder fase contrast microscopie) en intact (niet gefragmenteerd) cel-processen. Er kan ook een probleem met de cultuur als er sprake is van zichtbare verontreiniging of snel vernederende medium (steeds zuur na slechts 1 tot 2 dagen tussen de medium verandert).
   4. Wat is de elektrode impedantie? Over meerdere gebruikt, kan de micro-elektroden of de isolatie van een MEA degraderen. NeuroRighter heeft de mogelijkheid om de elektrode impedantie te beoordelen. ¹⁵ Normaal impedantie metingen rond 1 kHz moet liggen tussen de 10.000 en 100.000 Ohm. Hogere impedanties suggereren gebroken leads of elektroden en lezingen minder dan 10.000 Ohm suggereert lekkende isolatie.
   5. Is de voorversterker aangesloten op de hardware raad van bestuur? De voorversterker moet een output-kabel die verbonden is met de hardware raad van bestuur. De voorversterker heeft ook 4 kleine stimulator planken die ook verbinding maken met de belangrijkste hardware raad van bestuur en zijn belangrijk voor de stimulatie alleen.
   6. Zijn de NeuroRighter software-instellingen zijn gewijzigd? Hardware-configuratie-instellingen in de software moet correct zijn voor het opnemen van het werk. Het installeren van nieuwe versies en meerdere gebruikers het wijzigen van instellingen kunnen dit veroorzaken.
   7. Is het MEA bij 35-37 ° C? Koelere temperaturen kan leiden tot een vermindering van de spontane activiteit in de corticale netwerken. Dit is meestal niet een probleem, omdat de opname vindt plaats binnen de klimaat-gecontroleerde incubator, maar een moet het mogelijk maken voor de temperatuur evenwicht als de MEA heeft buiten de incubator al meer dan een paar seconden.
   8. Is het medium is veranderd in de afgelopen paar uur? We hebben gezien de culturen vaak stoppen vuren gedurende enkele uren na de voeding. Daarom is het beste om experimenten uit te voeren voor de voeding.
2. Elektrode met veel achtergrondgeluid het verzadigen van de opname-venster:
   1. Is de voorversterker pin contact met de elektrode op de MEA voldoende? Dit probleem kan worden veroorzaakt door een niet goed uitgelijnd pin op de voorversterker deksel, een klein stukje van afval, een daling van medium, een gedegradeerd elektrode-oppervlak, of een overlappende duidelijk membraan van het deksel. Inspectie van het contact voor deze problemen is de eerste stap. Instellen van de pin met een wattenstaafje gedrenkt in 70% ethanol kan soms verbeteren het contact vooral als er een druppel medium dat nodig is schoonmaken weg. Het signaal kan nog erger verschijnen totdat de ethanol verdampt. </ Li>
   2. Heeft de elektrode lijken te zijn beschadigd? Visualisatie onder de lichtmicroscoop kan soms onthullen gebarsten of ontpitte elektrode isolatie leidt tot dit soort artefact.
   3. Zijn de contactvlakken versleten of beschadigd? Soms zijn er meerdere elektrode contacten op de MEA die moeilijk te optimaliseren. Dit komt vaker voor na meerdere MEA gebruikt en gemetalliseerde delen. Een gouden draad geïmpregneerd rubber spacer voert alleen in de richting van de 0,5 mm dikte en kunnen verbeteren voorversterker pin contact met de MEA. Dit materiaal is verkrijgbaar bij Fujipoly en kunnen worden leuk om de MEA en deksel past.
3. Gehele MEA toont veel achtergrondgeluid:
   1. Is de MEA in de juiste richting zodat de massa-elektrode op de MEA de grond pin contact op de voorversterker? Als de MEA is in de juiste richting vervolgens voor te zorgen dat er geen contact met de grond kwesties (2 ac boven) is ook belangrijk om te overwegen. Is kanaal CR15 geaard met een korte draad aan de voorversterker chassis? Met behulp van de jumper om het terrein via de interne 30 kOhm weerstanden kan resulteren in teveel lawaai.
   2. Is er interferentie van omliggende, startonderbreker, bronnen of andere onderdelen van de uitrusting? Een van de meest voorkomende vormen van inmenging is 60 Hz van verlichting en apparatuur. Het registratiesysteem moet goed geaard zijn. Afscherming blootgesteld kabels kunnen ook behulpzaam zijn bij het verminderen van storing op de achtergrond.

Representatieve resultaten

Figuur 1. Dit is een raster plot van 2 minuten van de spontane activiteit van een neuronale netwerk. Elke zwarte stip staat voor een actiepotentiaal. Twee uitbarstingen van activiteit worden aangeduid met de blauwe pijlen. De reactie over meerdere elektroden is een functie van het netwerk connectiviteit.

Figuur 2. Hier is een raster plot van 16 seconden van stimulus-opgeroepen activiteit. Rode sterren vertegenwoordigen stimuli. De rode pijlen geven vijf stimuli die met succes uitbarstingen van synaptische activiteit geïnduceerde over meerdere elektroden. Af en toe doet een stimulus niet toegeven een uitbarsting, hier op de blauwe pijl.

Discussion

Dit protocol geeft instructies over hoe de cultuur en onderhouden van neuronale netwerken op micro-elektrode arrays, alsook een introductie tot opname van en het stimuleren van neuronale netwerken. Enkele van de meest voorkomende problemen bij het opnemen van MMO's zijn ook besproken in de MEA gedeelte Problemen oplossen. Er zijn af en toe variaties in het protocol zoals besproken tijdens en vaak deze veranderingen worden gebruikt om specifieke voorwaarden vereist door bepaalde experimentele ontwerpen te optimaliseren.

Hoewel de opname en het stimuleren van het systeem hier wordt gepresenteerd is samengesteld uit onze op maat ontworpen NeuroRighter ¹⁵ met de MCS voorversterker, er zijn meerdere andere systemen die een interface kan voorzien van de neuronale netwerken. Het kiezen van een bepaalde installatie zal afhangen van de specifieke experimentele behoeften.

Simplistisch opname en stimulatie voorbeelden werden in dit protocol echter deze culturen op MMO's kunnen gebruikt worden om inzicht te geven in complexe vragen over de synaptische activiteit en neuronale netwerk connectiviteit. Zoals hierboven vermeld, de lopende werkzaamheden is gebruik te maken van deze technologie om processen zoals mobiele plasticiteit onderzoek, ontwikkeling, excitotoxiciteit en neurodegeneratie. ^6-10 Bijvoorbeeld, een recente publicatie van ons laboratorium toonde reproduceerbare doel leren in vitro met real-time closed-loop stimulatie in reactie op de huidige neuronale netwerk activiteit ^3.

Hoewel de MEA culturen zijn vaak pietluttige en delicaat, dankzij hun eenvoud en toegankelijkheid (in vergelijking met intacte dieren), bieden ze een krachtig model voor het bestuderen van de neuronale activiteit op het netwerk niveau.

Materials

Supplies Disposable bottle top filter (150ml, 0.2μm pore size; Nalgene #565-0020) Embryonic day 18 timed-pregnant female rat Micr–lectrode arrays (see description in protocol, B1) Micr–lectrode array lids (see description in protocol, B3) Nylon cell strainer (40μm, BD Falcon, #352340) Polypropylene conical vials (sterile, 15ml) Polystyrene Petri dishes (sterile, 35mm and 100x15mm) Pipet tips (sterile, 20μl, 200μl and 1000μl) Serological pipets (5ml) Equipment: Biological safety cabinet/laminar flow hood Cell counter Centrifuge Container of ice Dissecting scissors and forceps (sterilized) Dissecting microscope in a laminar flow hood Handheld electric pipetman Hemacytometer Isofluorane and gas chamber Light microscope Handheld pipetman (P-20 (20μl), P-200 (200μl), P-1000 (1000μl)) MEA recording system (see description in protocol, D1) Rodent Guillotine Tri-gas incubator (see description in protocol, B15) Vacuum flask with aspirator attached in the hood Vortex Water bath (35-37°C) Solutions and Reagents: BSA solution: Make 5% BSA (Sigma A-9418) in phosphate buffered saline pH 7.4 and filtered at 0.2μm. This solution can be prepared ahead of time and stored at 4°C for several months. Cell Medium: Combine 90 ml Dulbecco’s modified Eagle’s medium (Irvine Scientific 9024), 10 ml horse serum (Gibco 16050), 1ml sodium pyruvate (100mM, Gibco 11360), 250 μl GlutaMAX (Gibco 35050), and insulin (final concentration 2.5 μg/ml, Sigma I-5500) then pass through a 0.2 μm filter.22 Warm and equilibrate the cell medium in the incubator prior to use. Dissection solution for preparing papain solution:23 Dissection solution (100ml stock) Combine in order, filter 0.22 μm and store at 4°C. Component Volume ml Final Concentration (mM) Double-distilled water 91.175 1 M MgCl2 0.58 5.8 mM 1 M CaCl2 0.025 0.25 mM 0.5 M HEPES 0.32 1.6 mM 0.5% Phenol red 0.2 (0.001%) 0.1 N NaOH 0.2 0.2 mM 2 M Na2SO4 4.5 90 mM 1 M K2SO4 3.0 30 mM 0.1 M Kynurenic acid 1.0 1 mM 5 mM APV 1.0 0.05 mM This solution can be prepared ahead of time and stored at 4°C for several months. DNAse I: Invitrogen (#18047019). 50μl aliquots are flash frozen and stored at -80°C. An aliquot is thawed in the laminar flow hood prior to starting the cell dissociation process. Hank’s balanced salt solution: Sigma (#4891). A 1X solution is prepared in deionized water, sterile filtered at 0.2μm and stored at 4°C. Hibernate solution: Prepare on day of culturing. Combine 98 ml L-15 medium (Invitrogen 11415) with 2 ml B-27 supplement (50X, Invitrogen #17504) and filter at 0.2 μm. Laminin solution: Prepare on day of culturing. Dilute 20μl of laminin (1mg/ml, Sigma L-2020) in 980 μl cell medium for a final concentration of 0.02mg/ml. 20 μl aliquots of the laminin (1mg/ml) are stored at -80°C and thawed just prior to use. Thawing should occur on the bench top and not in the water bath as rapid thawing can sometimes lead to gelling of the laminin. Papain solution:23 Warm 10 ml of dissection solution (above) to 30-32°C. Add 200 units papain (Sigma P-4762) and 1.6 mg L-cysteine (Sigma C-7880). Adjust pH to 7.4 with about 14 μl of 0.1 N NaOH. Incubate for about 30 minutes until the solution clears, filter 0.2 μm, flash freeze with liquid nitrogen in 2 ml aliquots in 15 ml polypropylene sterile conical vials and store at -80°C. Thaw an aliquot at 35-37°C prior to starting protocol. Polyethyleneimine (PEI) solution:13 100 μl of PEI (50% w/v, Sigma P-3143) is diluted in 100 ml sodium borate buffer (0.1 M pH 8.4, Sigma B-9876) for a final concentration of 0.05% w/v. Sterile filter at 0.2 μm. This can be prepared in advance and stored at 4°C for months. Sterile de-ionized water: Autoclave and allow to cool to room temperature prior to use. Trypsin (0.25% with EDTA, Gibco 25200): 1ml aliquots are flash frozen and stored at -80°C. Aliquots are thawed in the 35-37°C water bath prior to use.