Comment la culture, d'enregistrement et stimuler les réseaux neuronaux sur les micro-électrodes Arrays (AME)

Summary

Ce protocole fournit les informations nécessaires à la mise en place, le soin, l'enregistrement à partir et à stimuler électriquement les cultures sur les AME.

Abstract

Pour le siècle dernier, les neuroscientifiques nombreuses régions du monde ont consacré leur vie à comprendre comment les réseaux de neurones fonctionnent et pourquoi ils arrêtent de travailler dans diverses maladies. Des études ont inclus l'observation neuropathologique, la microscopie fluorescente avec marquage génétique, et l'enregistrement intracellulaire dans les deux neurones dissociés et préparations tranche. Ce protocole traite d'une autre technologie, qui consiste à cultiver des cultures dissociées de neurones sur la micro-électrode tableaux (également appelé réseau d'électrodes multiples, AME).

Il ya de multiples avantages à utiliser ce système sur d'autres technologies. Dissocié cultures neuronales sur les AME fournissent un modèle simplifié dans lequel l'activité du réseau peut être manipulé avec des séquences de stimulation électrique par électrodes multiples du tableau. Parce que le réseau est faible, l'impact de la stimulation est limitée aux zones observables, ce qui n'est pas le cas dans les préparations intactes. Les cellules se développent dans une monocouche faire des changements dans la morphologie facile à suivre avec les diverses techniques d'imagerie. Enfin, les cultures sur les AME peuvent survivre pendant plus d'un an in vitro, ce qui supprime toute limite temporelle claire inhérents aux techniques de culture d'autres ^1.

Notre laboratoire et d'autres autour du globe utilisent cette technologie pour poser des questions importantes au sujet des réseaux neuronaux. Le but de ce protocole est de fournir les informations nécessaires à la mise en place, le soin, l'enregistrement à partir et à stimuler électriquement les cultures sur les AME. Dans les réseaux in vitro fournissent un moyen pour poser des questions pertinentes physiologiquement au niveau du réseau et des niveaux cellulaires conduisant à une meilleure compréhension des la fonction cérébrale et un dysfonctionnement.

Protocol

A. Introduction

Il ya des milliards de neurones dans le cerveau humain. Chacun de ces neurones peut avoir des centaines de milliers de connexions souvent des périodes avec de nombreuses cellules différentes. Ces connexions port de signaux qui nous permettent de marcher, de jouer du piano, faire du vélo, rire, pleurer, et souvenez-vous. Pour le siècle dernier, les neuroscientifiques nombreuses régions du monde ont consacré leur vie à comprendre comment les réseaux de neurones fonctionnent et pourquoi ils arrêtent de travailler dans diverses maladies.

Il existe de nombreux outils, on peut utiliser lors de la prise de cette tâche apparemment insurmontable. Les premières études ont porté sur l'observation neuropathologique de la façon dont les circuits neuronaux sont organisées dans le cerveau des humains et autres animaux. L'avènement de la microscopie par fluorescence et marquage génétique a élargi la portée de ces études structurales explorer composition cellulaire jusqu'au niveau des protéines et l'ADN.

Mais ces expériences n'ont pas abordé la fonction dynamique du cerveau, que l'arrangement statique. Pour comprendre l'activité neuronale en cours, les techniques populaires se concentrent généralement sur l'examen de l'activité électrophysiologique avec enregistrement intracellulaire. Neurones unique de cultures dissociées de fournir un modèle réductionniste utile, cependant cette technique est limitée par des intervalles de temps pour l'enregistrement à partir des cellules individuelles. Ce modèle fournit également des informations limitées sur d'autres cellules dans le réseau. Tranches de cerveau de rongeurs fournissent plus d'un modèle réaliste où l'architecture corticale est maintenue. Mais tranches, même quand elles sont cultivées, ont une durée de vie limitée et peuvent être techniquement difficiles à garder vivante tout en conservant cytoarchitecture ^2.

Une autre technologie consiste à cultiver des cultures dissociées de neurones sur la micro-électrode tableaux (également appelé réseau d'électrodes multiples, AME). Les neurones sont plaquées sur les AEM qui ont microélectrodes intégré dans le fond du plat. Au cours de trois semaines, ces cultures sous forme de réseaux de neurones avec des axones, des dendrites et des centaines sinon des milliers de connexions synaptiques. Il ya de multiples avantages à utiliser ce système sur d'autres technologies. Dissocié cultures neuronales sur les AME fournissent un modèle simplifié avec qui travailler (de l'ordre d'une seule colonne corticale du cerveau plutôt que d'une intacte). Les cellules se développent dans une monocouche faire des changements dans la morphologie facile à suivre avec les diverses techniques d'imagerie. L'activité du réseau peut être manipulé avec des séquences de stimulation électrique par électrodes multiples du tableau. Parce que le réseau est faible, l'impact de la stimulation est limitée aux zones observables, ce qui n'est pas le cas dans les préparations intactes. Enfin, les cultures sur les AME peuvent survivre pendant plus d'un an in vitro, ce qui supprime toute limite temporelle claire inhérents aux techniques de culture d'autres. ^{1 Par} conséquent, les cultures sur les AME représentent un modèle idéal pour étudier la connectivité neuronale.

Notre laboratoire et d'autres autour du globe utilisent cette technologie pour poser des questions importantes au sujet des réseaux neuronaux. Les procédés actuels de neurones à l'étude avec ce modèle comprennent la dynamique des réseaux, le développement, l'apprentissage et la mémoire, la plasticité synaptique, excitotoxicité, l'ischémie et de la neurodégénérescence. ^3-10 résultats de ces études pourraient avoir des implications importantes pour établir de meilleurs traitements pour les maladies humaines, comme des malformations congénitales, de l'épilepsie , d'AVC et la maladie d'Alzheimer. Le but de ce protocole est de fournir les informations nécessaires à la mise en place, le soin, l'enregistrement à partir des cultures et stimulant sur les AME. Le but ultime est de fournir un moyen pour les chercheurs de poser des questions pertinentes au plan physiologique aux niveaux cellulaire et de réseau qui peut-être conduire à une meilleure compréhension du fonctionnement du cerveau et de la dysfonction et, finalement, le traitement des maladies qui affectent nos neurones et comment ils communiquent.

Le protocole suivant représente plus de 10 ans d'expérience de notre laboratoire de culture, de l'enregistrement et la stimulation de réseaux de neurones sur la micro-électrode tableaux. Chaque étape a été optimisée de manière à conduire au développement de longs survivants sains réseaux neuronaux. Des références sont fournies lorsqu'elles sont disponibles alors que certains réglages optimaux, nous avons déterminé empiriquement. Avant de lancer le protocole, obtenir de l'équipement et les fournitures et préparer des solutions comme indiqué dans la section intitulée «Matériaux». La section sur la «dissection du cerveau» sera brièvement discuté, mais pas démontré dans la vidéo qui l'accompagne comme d'autres d'articles Journal Expérience visualisé couvrir ce sujet ^11.

Dissection du cerveau B.

1. Cerveaux entiers sont extraits à partir de rats jour 18 (E18) embryonnaire. Timed-rats femelles enceintes sont anesthésiés à l'isoflurane inhalées et décapité. Les embryons sont enlevés et disséqué en fonction de l'Guid Conseil national de recherchese pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire en utilisant un protocole approuvé par le IACUC l'Université Emory.
2. Tout en utilisant une technique aseptique, les cerveaux embryonnaires sont enlevés et placés dans un froid de Hank solution de sels équilibrée (HBSS) dans une boîte de Petri de 100 mm stérile. Le reste du protocole de dissection se produit sous un microscope à dissection dans une hotte à flux laminaire pour minimiser les risques de contamination.
3. Les cerveaux de rats sont transférés un à la fois à une boîte de Petri stérile avec HBSS secondes pour la dissection. Bien immergé dans HBSS, le tronc cérébral, le thalamus et le cervelet sont coupées et les hémisphères sont traversée.
4. Le tubercule olfactif est utilisé comme une poignée pour la sécurisation de l'hémisphère tout doucement enlever les méninges.
5. Le cortex est alors décollé de l'hippocampe et du striatum sous-jacente et stocké dans un tube conique stérile 15 ml en solution hibernent sur ​​la glace. ¹² Comme il ya généralement plusieurs embryons, cette procédure est ensuite répétée en fonction du nombre souhaité d'AME à plaquer et de la densité cellulaire désirée. Corticales sont combinés pour le processus de dissociation cellulaire tel que discuté ci-dessous. Corticales peuvent être conservés à 4 ° C dans une solution hiberner pendant jusqu'à 24 heures avant la dissociation avec seulement une perte minimale de la viabilité cellulaire. Comme alternative à l'utilisation de tissus disséqués en interne, les tissus du cerveau peut être disséqué acheter Bits Cerveau ( www.brainbitsllc.com ).

C. MEA préparation et la dissociation corticale

1. Les AME sont obtenus à partir de l'ALA scientifique ( www.alascience.com ), un fournisseur pour le fabricant, systèmes multi-canaux. Il existe plusieurs configurations différentes à l'AME avec des variations dans l'orientation et l'espacement des électrodes, la présence ou l'absence d'une électrode de masse interne, la présence ou l'absence d'un anneau de verre, et la taille de la bague de verrerie. Pour nos expériences de base que nous utilisons la norme micro-électrode tableau contenant 60 électrodes dans une 8 par 8 disposition de la grille avec un anneau petit verre. Le diamètre de l'électrode de nitrure de titane est de 30 um et la distance entre les centres d'électrode est de 200 um. L'une des électrodes est plus grand et fonctionne comme le sol ou l'électrode de référence interne. Lors de la manipulation des AME, il est extrêmement important qu'aucun objet solide (par exemple, des embouts de pipette, des mouchoirs en papier, ou des policiers en caoutchouc) jamais toucher l'intérieur du plat car cela peut endommager les électrodes. Des informations plus détaillées au sujet des AEM et de manutention peuvent être trouvés dans le manuel utilisateur MEA ( www.multichannelsystems.com / produits-mea / microélectrode-arrays.html ).
2. Le soir avant la préparation des cellules, l'AME sont rincés à l'eau désionisée puis laissé à tremper dans de l'éthanol à 70% pendant 15 minutes. Les plats sont ensuite placés dans une hotte à flux laminaire avec la lumière UV sur la nuit. À des fins de manipulation, chaque AME est placé dans un standard de 100 mm en polystyrène boîte de Petri stérile avec les dates et l'étiquetage placé sur la boîte de Pétri. Fait à noter, d'autres techniques de stérilisation à l'autoclave et notamment l'utilisation de l'eau à 90 ° C sont mentionnées dans le manuel utilisateurs MEA. Cependant, nous avons empiriquement constaté que l'autoclavage semble diminuer le nombre de fois qu'un AME peuvent être utilisés. Si vous réutilisez des AME qui ont actuellement des cultures, la matière organique doit être retiré. 300-400 ul de trypsine à 0,25% en PBS est incubée sur la MEA à 35-37 ° C pendant 20 minutes. Le MEA est rincée avec de l'eau déminéralisée et ensuite inspecté avec un microscope optique. Si la matière cellulaire demeure, alors l'étape de la trypsine est répété jusqu'à ce que propre. Si le plat est propre, puis passez à l'étape de stérilisation comme ci-dessus. En général, les AME peuvent être réutilisées plusieurs fois avec des soins appropriés.
3. Aussi, le soir avant le placage, les couvercles MEA sont préparés et stérilisés en autoclave. Les couvercles sont fabriqués sur mesure, mais peuvent également être achetés auprès de l'ALA-scientifique. Ils sont faits de polytétrafluoroéthylène Téflon et ont une membrane transparente (éthylène-propylène fluoré Téflon) s'étendait sur la partie supérieure. La membrane permet la diffusion des gaz, mais limite la diffusion de l'eau, ce qui élimine pratiquement le besoin d'une atmosphère humidifiée et prévenir les effets délétères de l'évaporation et l'hyperosmolarité ^1.
4. Une fois la dissection ci-dessus est complète, la préparation MEA est poursuivi en plaçant 100 pl de polyéthylèneimine (PEI) de solution dans le centre de chaque AME. ¹³ Dans nos mains, la solution de PEI fournit moins de clustering de cellules dans la MEA à l'aide de polylysine. Le plat est autorisé à s'asseoir à la température ambiante dans la hotte à flux laminaire pendant 30 minutes avec des couvercles légère reposant sur les AME afin de prévenir l'évaporation. Pour rappel, tous les travaux avec l'ouverture MEA ou de tissus cérébraux devraient prendre place dans une hotte de culture de cellules d'écoulement laminaire à la norme mini-minimiser le risque de contamination.
5. Le MEA est ensuite rincé 3 fois avec 1-2 ml de solution stérile de l'eau déminéralisée. Le flux laminaire idéale capuche installation comprendra un appareil aspirateur pour enlever le liquide de la vaisselle. Une pointe de la pipette stérile 200 pl peut être attaché à la tuyauterie d'aspiration. Ne touchez pas la surface de la MEA pendant l'aspiration, car cela peut endommager les électrodes. Après le rinçage final, la MEA est mis à sécher pendant au moins 30 minutes dans la hotte à flux laminaire.
6. Pendant cette période de séchage, le processus neuronaux dissociation est commencé en plaçant le cortex dans 2 ml de solution papaïne dans un flacon de 15 ml en plastique stérile conique. ¹ 50 ul de DNAse est ajoutée au mélange. Le flacon est placé dans un bain d'eau à 35-37 ° C et incubées pendant 20 minutes environ. Tapoter doucement la solution toutes les 5 minutes pour le mélange en veillant à éviter d'introduire des bulles. Le cortex devrait commencer à prendre une apparence floue comme le produit de digestion.
7. La solution la papaïne est ensuite soigneusement retiré par pipetage laissant le cortex dans le flacon de 15 ml conique. 2 ml de milieu cellulaire est ajouté à la corticales, on laisse incuber pendant 2-3 minutes puis retirer délicatement. C'est pour laver toute la papaïne résiduelles, qui sera également inhibée par le sérum dans le milieu. Un autre 2ml de milieu cellulaire est ajouté à la corticales et cet échantillon est ensuite vortexé à haute vitesse pendant 5-10 secondes. Il devrait y avoir une solution trouble dans le fond du flacon 15ml conique et pas des morceaux du cerveau restant. Alternativement, la trituration avec 1 ml de milieu par 3 fois en utilisant une main P-1000 pipette peut être utilisé pour dissocier les tissus. ¹ Pour la trituration appropriée, chaque coup de pipette devrait prendre une seconde.
8. La solution est alors autorisé à passer doucement à travers une passoire cellules 40μm stériles par gravité. Ajouter lentement la solution de cellules, une goutte à la fois dans la passoire avec un P-1000. Un 35 mm boîte de Petri stérile est utilisé pour collecter la solution de cellules tendues.
9. La suspension cellulaire est ensuite transférée à un flacon de 15 ml conique et moyennes cellule est ajoutée à un volume final de 4,0 ml. ¹⁴
10. 500 ul d'un 5% p / v solution de BSA est ensuite soigneusement couches dans le fond du flacon 15ml conique avec un P-1000. ¹⁴ Ce sera le déplacement vers le haut solution contenant les cellules dans le flacon.
11. La solution la cellule avec la BSA en couches dans le fond est ensuite centrifugé pendant 6 minutes à 200 xg pour éliminer les petits débris et potentiellement toxiques contenus intracellulaires. ¹⁴
12. Pendant l'étape de centrifugation des cellules, l'AME sont évalués visuellement pour s'assurer qu'ils sont complètement secs. 20 pi de solution de laminine sont ensuite soigneusement placés dans le centre de la MEA en sorte que toutes les électrodes sont couvertes. Éviter d'introduire ^une bulle d'air dans cette solution car cela peut conduire à une préparation inadéquate de la surface de l'électrode. Si l'AME n'est pas complètement sec, puis la chute de la laminine se répandront dans tout le plat rendant potentiellement plus difficile de bien localiser les cellules sur les électrodes lors de placage. Cette étape est très délicate et a le potentiel d'entraîner des dommages de surface MEA d'une main tremblante ou d'inattention.
13. Les couvercles en téflon sont placés sur la MEA à ce stade pour éviter l'évaporation de la laminine. Placement du couvercle est également délicate. Un couvercle ne doit être placé ou retiré lorsque le MEA est sur une surface complètement plate. Sinon, des forces supplémentaires exercées par une surface irrégulière peut casser le fond de verre de la matrice de le rendre inutilisable. Le plat est ensuite placée dans l'incubateur pendant 20 minutes.
14. Alors que la laminine est contraignante pour le plat, le flacon de 15 ml coniques contenant les cellules est retiré de la centrifugeuse et transféré à la hotte à flux laminaire. Une pastille doit être visible dans le fond du flacon. Le surnageant est soigneusement retiré avec une pipette stérile de 5 ml en plastique sérologique. Enregistrer le surnageant dans le cas où le processus de centrifugation a été incomplète. Le culot est ensuite resuspendu délicatement soit par trituration avec un P-1000 ou un vortex rapide dans 300 à 500 pi de milieu cellulaire en fonction du rendement attendu. 10 pl de suspension cellulaire est retiré et placé sur un hématimètre pour déterminer la concentration cellulaire. Si le rendement est faible, d'analyser le surnageant au microscope afin de déterminer si l'étape de centrifugation était incomplète. Centrifugation répétés peuvent être nécessaires. Si le rendement est élevé, alors une dilution peut être nécessaire pour le comptage plus précis. Densité de placage cellulaire peut varier de 5000 à 300.000 cellules par la MEA. Calculer une dilution de telle sorte que le nombre souhaité de cellules pour le placage est dans un volume final de ul 15-20. Nous utilisons généralement une concentration finale de 1000 à 3000 cellules par pl. Une paire de cortex sera généralement de rendement entre 10 et 15 millions de cellules. Ce nombre peut être légèrement inférieur si la trituration est utilisé.
15. Par ce temps, tIl laminine incubation sur l'AEM doit être complète. Le couvercle en téflon est retiré de la MEA et la plupart de la baisse de la laminine est vide aspiré ou pipette loin. Puis ul 15-20 de la suspension cellulaire désirée est immédiatement à la pipette sur la zone humide de la laminine résiduelle. Soyez prudent pour éviter d'introduire des bulles d'air dans ce petit volume de suspension cellulaire sous forme de bulles d'air peut empêcher les cellules de manière uniforme couvrant l'ensemble des électrodes. Le couvercle est doucement remplacé et le MEA est soigneusement replacées dans l'incubateur pendant 30 minutes. Le plat est ensuite inspecté au microscope optique afin de s'assurer que les cellules ont adhéré et couvrir toutes les électrodes. Si toutes les électrodes ne sont pas couverts, alors plus de cellules peuvent être ajoutés et le MEA est remis dans l'incubateur avec un couvercle pour permettre à ces nouvelles cellules à adhérer. Si un tube de suspension cellulaire est plus utilisé que quelques minutes après s'être assis tranquille, pensez à mélanger doucement en tournant elle à remettre en suspension les cellules réglée. Une fois la couverture d'électrode adéquate est obtenue, puis le plat est lentement inondé avec 1ml d'eau tiède (35-37 ° C) milieu cellulaire. Le couvercle en téflon est remplacé et le plat est replacé dans l'incubateur. La hotte à flux laminaire peut vite sécher les volumes et les volumes de la laminine petites cellules en suspension une fois sur l'AME afin de prendre soin de les garder scellés avec des couvercles en téflon. L'environnement idéal pour l'incubateur étanche AME est de 5% de CO _2, 9% d'O ₂ et 65% d'humidité à 35-37 ° C. Faible tension d'oxygène est important pour les cultures à long terme, de réduire les dommages oxydatifs. Maintenir l'humidité ¹² à 65% réduit l'évaporation à travers la membrane en Teflon (comparativement à aucun contrôle de l'humidité) et permet MEA électronique pour être utilisés dans l'incubateur sans dommage de la condensation de l'eau (comme avec un incubateur humidifié à la normale de saturation).

D. Modification milieu cellulaire et le soin des cultures dissociées sur les AME

1. Le jour après étalement cellulaire, inspecter l'AEM sous le microscope optique. Si la couleur du milieu est encore pêchers au rouge et il ya une quantité limitée de débris cellulaires et la mort cellulaire, alors le changement de premier milieu peut être retardée pour un autre jour. Toutefois, si le milieu est commencent à apparaître plus orange ou jaune et / ou il ya une grande quantité de débris cellulaires et la mort cellulaire, puis changer le milieu. Tous les changements de milieu devrait se produire dans une hotte de culture cellulaire débit standard laminaire.
2. Le changement de milieu première consiste à retirer le couvercle MEA, aspirant l'écart de toutes les moyennes dans le plat, remplaçant le montant retiré avec support de cellules fraîches, et de replacer le couvercle. Replacez le montant intégral du milieu cellulaire sur le changement de premier support d'enlever les débris restant cellulaires du processus galvanoplastie. Après changement de milieu ne doit aspirer l'écart d'environ la moitié de la moyenne suivie en remplaçant le montant retiré du milieu frais. Cela permet à certains des facteurs de croissance qui ont été sécrétés dans le milieu cellulaire pour rester avec les cellules de maintenir un environnement plus optimale en pleine croissance. Si le dessous du couvercle est contaminée pendant le processus de changement ou moyenne si le couvercle montre des signes de dommages ou ample, puis utiliser un nouveau couvercle autoclave. Milieu cellulaire peuvent être stockées dans l'incubateur dans un récipient stérile avec un couvercle personnalisée modifiés (qui a une Téflon (éthylène-propylène fluoré) à membrane pour permettre les échanges gazeux). Milieu cellulaire peut également être conservés à 4 ° C mais chaleureux et équilibrer cela dans l'incubateur avant de changer moyennes.
3. Retirer et remplacer environ la moitié de la moyenne dans un plat à environ deux fois par semaine. Certaines préparations cellulaires peut conduire à des changements de couleur plus rapide dans le médium entraînant un besoin pour des changements plus fréquents. Si le milieu est noté pour être jaune, puis changer la totalité du montant moyen. Une transition rapide au jaune peut aussi être le signe de contamination afin d'inspecter le plat sous le microscope à lumière pour les signes visuels de l'infection.
4. Selon les conditions d'expérimentation et une technique stérile, les cultures qui ont été soigneusement entretenu peut survivre pendant plus d'un an ^1.

Enregistrement à partir de E. AME

1. Chaque MEA a 59 électrodes d'enregistrement et une électrode de terre interne. Il existe plusieurs systèmes d'enregistrement commerciaux disponibles ainsi que des versions personnalisées faite. Les fournisseurs comprennent des systèmes multicanaux, Tucker Technologies Davis, Axion Biosystems, Alpha Med scientifique MED64, Plexon, Ayanda Biosystems et biologiques. Notre laboratoire utilise actuellement une installation commerciale de systèmes multi-canaux, une coutume conçue système Windows basées appelé NeuroRighter ^15, et une coutume conçue système Linux appelé ¹⁶ MeaBench. Chacun de ces systèmes est capable d'enregistrer à partir d'AME (systèmes multi-canaux) à l'aide d'un préamplificateur systèmes multi-canaux. Une installation commerciale de Tucker Technologies Davis est aussi en usage. Ce protocole fera la démonstration de l'enregistrement à partir d'AME NeuroRighter. Nelogiciels uroRighter est open-source et disponible en téléchargement gratuit avec la conception de matériel sur les groupes Google NeuroRighter. ( http://sites.google.com/site/neurorighter/ )
2. Cultures sur les AME prendre 2-3 semaines pour atteindre un état ​​stable de l'activité. ^17,18 Cette activité comprend les potentiels d'action spontanés et la culture à l'échelle éclatement (un barrage de potentiels d'action qui se propage à travers une culture synaptique). La nature de l'expérience ne sera cependant de déterminer le nombre idéal de jours in vitro avant l'enregistrement.
3. L'activité neuronale dépend des conditions environnementales idéales, dont la température et le pH. ¹ En conséquence, notre enregistrement a lieu dans l'incubateur comme décrit ci-dessus. Si les expériences de courte durée (<30 minutes) sont conçus, il ya aussi un module de chauffage disponibles dans le commerce qui peut être connecté au préamplificateur MCS pour maintenir la température idéale MEA.
4. Pour commencer l'enregistrement, un AME (toujours dans sa boîte de Pétri) est transférée en douceur de l'incubateur de stockage pour l'enregistrement de l'incubateur. Gardez le bas de la vaisselle en parallèle au sol. Évitez les mouvements rapides avec la MEA ou à des secousses de la MEA, car ils peuvent se détacher de la culture dans le substrat. Le MEA est ensuite retiré de la boîte de Pétri et placé dans le préamplificateur enregistrement. Match de l'électrode de terre interne dans les plats que nous démontrent actuellement avec l'électrode de masse sur le préamplificateur (canal CR15 pour le préamplificateur MCS). Essuyez les contacts autour du périmètre de la MEA en utilisant un mouchoir ou un coton-tige humidifié avec de l'éthanol à 70% pour éliminer les traces de doigts ou d'autres débris qui peuvent entraver une bonne connexion. Après s'être assuré que l'AEM est correctement installé, le couvercle préamplificateur est ensuite abaissé et verrouillé en place. Les contacts sur le couvercle préamplificateur doit reposer fermement sur les plots de contact d'électrode sur la MEA. Inspecter visuellement l'alignement de contact et d'ajuster avec un coton tige si nécessaire. Placer le préampli sur le dispositif Peltier dans l'incubateur. Il est composé de deux plaques de cuivre avec une pompe à chaleur thermoélectrique Peltier en sandwich entre eux. Nous courons à environ 5V cela, de supprimer certains de la chaleur produite par les circuits de préampli. Cela empêche la formation de condensation à l'intérieur du couvercle de membrane en Teflon. Toute condensation indiquerait nuire à la culture par l'augmentation de l'osmolarité du milieu en contact avec les cellules, due à l'évaporation. En assurant le préampli et le milieu qui sont un ou deux degrés en dessous de la température de l'incubateur de l'air, les changements dans l'osmolarité sont minimisés.
5. Allumez l'alimentation NeuroRighter et ouvrez le logiciel sur le poste de travail. Ajustez les paramètres d'NeuroRighter in vitro avec des configurations matériel / logiciel approprié également en place. Sélectionnez le nombre d'électrodes dans le logiciel. Afin de réduire la quantité de bruit de fond, un appareil photo numérique filtre passe-bande peut être activé. Sélectionnez un fichier de données avec le commutateur enregistrer sur, si les données doivent être sauvegardées pour une analyse ultérieure. Activez le bouton de démarrage une fois que tous les paramètres appropriés sont choisis.
6. L'écran devrait show running traces de l'activité et de bruit de fond. Potentiels d'action et des éclats occasionnels plat large de l'activité devrait être visible. La section ci-dessous sur l'enregistrement de dépannage à partir AME va discuter de plusieurs questions d'intérêt commun, si l'activité prévue n'est pas visualisée.
7. L'affichage de l'écran peut être changé en mode de détection pic (onglet 'Spk WfMS') où les potentiels d'action sont affichées statiquement tels qu'ils apparaissent dans des fenêtres temporelles 3ms. Pour un canal donné, réel potentiel d'action extracellulaire devrait durer environ 1 ms et devrait le feu à plusieurs reprises dans la même direction (positive ou négative). Parfois, deux ou plusieurs neurones peuvent être visibles sur la même électrode avec des polarités différentes. Pointes avec un cours de courte durée et la polarité variables sont des artefacts probable. La figure 1 montre un tracé de données raster pic.
8. L'affichage de l'écran peut être changé à des potentiels de champ local (LFPs) pour un look à la localisation de l'origine de l'éclatement d'activité. Ce type de réglage peut être plus utile lors de l'enregistrement in vivo puisque des cultures monocouches ont LFPs faible. Fait à noter, certains préamplificateurs (y compris celui que nous utilisons des systèmes multi-canaux) ont filtres passe-haut à 10 Hz qui va atténuer les basses fréquences rythmes LFP.

F. Stimuler les réseaux neuronaux sur les AME

1. Les 59 mêmes électrodes d'enregistrement sur une AEM peut également être utilisé pour stimuler la culture. La nature de l'expérience permettra de déterminer l'ampleur de la stimulation. NeuroRighter offre une flexibilité pour la conception de la stimulation expérimentale car il est le code source ouvert. ¹⁵
2. Le défi de stimuler une culture, c'est que le stimulus crée un artefact qui peut durer de quelques millisecondes. Cet artefact peut être suffisamment importante pour déclencher la détection pic et les réponses de relance obscures. NeuroRighteR utilise l'algorithme de minimisation SALPA et dans certains cas pour l'essentiel d'éliminer l'artefact de stimulation. ¹⁹
3. Afin de stimuler le réseau neuronal de la MEA, en train de l'algorithme SALPA sous l'onglet «Paramètres d'enregistrement" pour limiter l'artefact de stimulation. Activer SALPA dans l'onglet «Paramètres en ligne». Sélectionnez un nom de fichier et cliquez sur le bouton Démarrer comme précédemment pour commencer l'enregistrement. Cliquez ensuite sur le "Stim 'onglet. Il ya beaucoup de choix pour la mise en place de stimulation sur cette page.
4. Une expérience simple est de stimuler une électrode et de regarder la réactivité de l'antenne en utilisant la section «boucle ouverte». Sélectionnez le taux, la tension, la phase largeur et le nombre de canaux. Appuyez sur le bouton de démarrage dans la section en boucle ouverte. Les réponses à cette stimulation peut être visualisée sur l'onglet principal «pointes» et l'onglet 'Spk WfMS et analysés dans les fichiers de données.
5. En temps réel, éclats peuvent être visualisées dans des délais de verrouillage à un stimulus d'un hertz 0.5V travers plusieurs électrodes. La figure 2 montre un complot trame d'une réponse de post-stimulation. Observations antérieures ont démontré qu'il existe deux types de stimulus évoqué l'activité:. Potentiels d'action directement évoquée (DAPS) et les potentiels d'action synaptique évoquée (PAS) ²⁰
6. Neurones en culture ont des éclats d'activité spontanée. Pour certaines expériences, ce type d'éclatement peut interférer avec tenter de contrôler la dynamique du réseau. Fait intéressant, la stimulation distribuée à 1-2 Hz par électrode peut commencer à réprimer l'éclatement activité dans un réseau neuronal sur un AME. ²¹

G. Dépannage enregistrement à partir de AME

1. Pas de potentiels d'action ou présenter l'éclatement de la MEA lorsque le logiciel est activé:
   1. Est-ce la culture assez vieux? Les potentiels d'action devrait être visible vers la fin de la première semaine in vitro. Débordant survient environ deux à trois semaines in vitro.
   2. Le matériel est sous tension? Le système utilise deux NeuroRighter 6V batteries plomb-acide à la puissance du matériel. L'interrupteur d'alimentation doit être en position de marche et les batteries chargées.
   3. Est-ce la culture vivante? Parfois cela peut être difficile de déterminer en particulier dans la culture dense ou plus âgés en raison de la prolifération des cellules gliales. Cependant, on peut chercher saine neurones apparaissent (brillant, elliptique en forme de corps cellulaires en microscopie à contraste de phase) et intacte (non fragmenté) des processus cellulaires. Il peut également y avoir un problème avec la culture s'il ya des preuves de contamination visible ou dégradants rapidement moyennes (devenir acide après seulement 1 à 2 jours entre les changements de moyenne).
   4. Quelle est l'impédance d'électrode? Plus de multiples utilisations, le micro-électrodes ou de l'isolation d'un AEM peut se dégrader. NeuroRighter a la capacité d'évaluer l'impédance de l'électrode. ¹⁵ lectures impédance normale autour de 1kHz devrait se situer entre 10.000 et 100.000 Ohms. Supérieur impédances suggèrent conduit cassé ou électrodes et des lectures moins de 10 000 Ohms suggèrent d'isolation étanches.
   5. Est-ce le préamplificateur connecté à la carte du matériel? Le préamplificateur doit avoir un câble de sortie qui se connecte à la carte matérielle. Le préamplificateur a aussi 4 cartes stimulateur petits aussi se connecter à la carte principale et le matériel sont importants pour la stimulation seule.
   6. Demandez aux paramètres du logiciel NeuroRighter été changé? Paramètres de configuration du matériel dans le logiciel doit être correcte pour l'enregistrement de travailler. Installation des versions mises à jour et de multiples paramètres utilisateurs peuvent provoquer ce changement.
   7. Est de la MEA à 35-37 ° C? Les températures plus fraîches peuvent conduire à une réduction de l'activité spontanée dans des réseaux corticaux. Ce n'est généralement pas un problème puisque l'enregistrement a lieu au sein de l'incubateur à température contrôlée, cependant il faut permettre l'équilibrage de température, si l'AEM a été en dehors de l'incubateur pour plus de quelques secondes.
   8. A la moyenne été changé dans les dernières heures? Nous avons observé les cultures souvent cesser les tirs de plusieurs heures après le repas. Par conséquent, il est préférable de mener des expériences avant l'alimentation.
2. Électrode avec saturer le bruit de fond excessif de la fenêtre d'enregistrement:
   1. Est-ce le contact broches préamplificateur avec l'électrode sur la MEA suffisante? Ce problème peut être causé par une goupille mal alignées sur le couvercle préamplificateur, un petit morceau de poubelle, une goutte de milieu, une surface de l'électrode dégradée, ou une membrane qui se chevauchent clairement de la paupière. Inspecter le contact pour ces questions est la première étape. Réglage de la broche avec un coton tige imbibé d'éthanol à 70% peut parfois améliorer le contact surtout si il y avait une goutte de milieu qui avait besoin de nettoyage loin. Le signal peut paraître pire jusqu'à l'évaporation de l'éthanol. </ Li>
   2. Est-ce que l'électrode est endommagée? Visualisation en microscopie optique peut parfois révéler des fissures ou dénoyautées Isolation d'électrode menant à ce type d'artefact.
   3. Les plots de contact usés ou rayés? Parfois, il peut y avoir plusieurs contacts des électrodes sur la MEA qui sont difficiles à optimiser. Ceci est plus fréquent après la MEA utilise de multiples et les placages. Une entretoise en caoutchouc imprégné de fils d'or ne conduit que dans le sens de son épaisseur de 0,5 mm et peut améliorer le contact avec les broches préamplificateur MEA. Ce matériel est disponible à partir Fujipoly et peut être mignon pour s'adapter le MEA et le couvercle.
3. Tout le MEA montre le bruit de fond excessif:
   1. Est-ce la MEA dans le bon sens afin de permettre à l'électrode de masse sur la MEA à communiquer avec la broche de terre sur le préamplificateur? Si l'AME est dans l'orientation correcte, alors assurant qu'il n'ya pas des questions de contact au sol (2 ac-dessus) est également importante à considérer. Est-canal CR15 à la terre avec un fil court au châssis préampli? En utilisant le cavalier pour le sol à travers les résistances internes kOhm 30 mai conduire à un bruit excessif.
   2. Yat-il des interférences des lumières environnantes, les sources d'alimentation ou autres pièces d'équipement? Une des formes les plus fréquentes d'interférence est de 60 Hz de lumières et les équipements. Le système d'enregistrement doit être correctement mis à la terre. Blindage des câbles exposés peut également être utile pour réduire les interférences de fond.

Les résultats représentatifs

Figure 1. Ceci est un complot trame de 2 minutes d'activité spontanée d'un réseau neuronal. Chaque point noir représente un potentiel d'action. Deux rafales d'activité sont indiqués par des flèches bleues. La réponse sur plusieurs électrodes est une fonction de la connectivité réseau.

Figure 2. Voici une parcelle de trame de 16 secondes de relance évoqués activité. Les étoiles rouges représentent les stimuli. Les flèches rouges montrent cinq stimuli qui réussi à provoquer des éclats de l'activité synaptique dans plusieurs électrodes. Occasionnellement, un stimulus ne donne pas un éclat, ici, à la flèche bleue.

Discussion

Ce protocole indique des instructions sur la façon de la culture et maintenir des réseaux neuronaux sur des micro-électrodes sont aussi des tableaux comme une introduction à l'enregistrement et la stimulation des réseaux neuronaux. Quelques-uns des problèmes les plus courants lors de l'enregistrement d'AME ont également été discutés dans la section MEA dépannage. Il ya des variations occasionnelles dans le protocole tel que discuté tout au long et souvent ces changements sont utilisées pour optimiser les conditions spécifiques prévues par certains modèles expérimentaux.

Bien que le système d'enregistrement et stimulantes présentées ici se compose de notre personnalisées conçues NeuroRighter ¹⁵ avec le préampli MCS, il existe plusieurs autres systèmes qui peuvent fournir une interface avec les réseaux neuronaux. Choisir une configuration particulière dépendra des besoins spécifiques d'expérimentation.

L'enregistrement et des exemples simplistes de stimulation ont été fournis dans le présent protocole Cependant ces cultures sur les AME peuvent être utilisés pour fournir un aperçu des questions complexes sur l'activité synaptique et la connectivité réseau neuronal. Comme mentionné ci-dessus, le travail en cours est l'utilisation de cette technologie pour étudier les processus comme la plasticité cellulaire, le développement, l'excitotoxicité et la neurodégénérescence. ^6-10 Par exemple, une publication récente de notre laboratoire ont montré l'objectif reproductibles apprentissage dirigé in vitro, en temps réel la stimulation en boucle fermée en réponse à l'activité actuelle du réseau neuronal ^3.

Bien que les cultures sont souvent capricieux MEA et délicat, grâce à leur simplicité et leur accessibilité (par rapport aux animaux intacts), ils fournissent un puissant modèle pour étudier l'activité neuronale au niveau du réseau.

Materials

Supplies Disposable bottle top filter (150ml, 0.2μm pore size; Nalgene #565-0020) Embryonic day 18 timed-pregnant female rat Micr–lectrode arrays (see description in protocol, B1) Micr–lectrode array lids (see description in protocol, B3) Nylon cell strainer (40μm, BD Falcon, #352340) Polypropylene conical vials (sterile, 15ml) Polystyrene Petri dishes (sterile, 35mm and 100x15mm) Pipet tips (sterile, 20μl, 200μl and 1000μl) Serological pipets (5ml) Equipment: Biological safety cabinet/laminar flow hood Cell counter Centrifuge Container of ice Dissecting scissors and forceps (sterilized) Dissecting microscope in a laminar flow hood Handheld electric pipetman Hemacytometer Isofluorane and gas chamber Light microscope Handheld pipetman (P-20 (20μl), P-200 (200μl), P-1000 (1000μl)) MEA recording system (see description in protocol, D1) Rodent Guillotine Tri-gas incubator (see description in protocol, B15) Vacuum flask with aspirator attached in the hood Vortex Water bath (35-37°C) Solutions and Reagents: BSA solution: Make 5% BSA (Sigma A-9418) in phosphate buffered saline pH 7.4 and filtered at 0.2μm. This solution can be prepared ahead of time and stored at 4°C for several months. Cell Medium: Combine 90 ml Dulbecco’s modified Eagle’s medium (Irvine Scientific 9024), 10 ml horse serum (Gibco 16050), 1ml sodium pyruvate (100mM, Gibco 11360), 250 μl GlutaMAX (Gibco 35050), and insulin (final concentration 2.5 μg/ml, Sigma I-5500) then pass through a 0.2 μm filter.22 Warm and equilibrate the cell medium in the incubator prior to use. Dissection solution for preparing papain solution:23 Dissection solution (100ml stock) Combine in order, filter 0.22 μm and store at 4°C. Component Volume ml Final Concentration (mM) Double-distilled water 91.175 1 M MgCl2 0.58 5.8 mM 1 M CaCl2 0.025 0.25 mM 0.5 M HEPES 0.32 1.6 mM 0.5% Phenol red 0.2 (0.001%) 0.1 N NaOH 0.2 0.2 mM 2 M Na2SO4 4.5 90 mM 1 M K2SO4 3.0 30 mM 0.1 M Kynurenic acid 1.0 1 mM 5 mM APV 1.0 0.05 mM This solution can be prepared ahead of time and stored at 4°C for several months. DNAse I: Invitrogen (#18047019). 50μl aliquots are flash frozen and stored at -80°C. An aliquot is thawed in the laminar flow hood prior to starting the cell dissociation process. Hank’s balanced salt solution: Sigma (#4891). A 1X solution is prepared in deionized water, sterile filtered at 0.2μm and stored at 4°C. Hibernate solution: Prepare on day of culturing. Combine 98 ml L-15 medium (Invitrogen 11415) with 2 ml B-27 supplement (50X, Invitrogen #17504) and filter at 0.2 μm. Laminin solution: Prepare on day of culturing. Dilute 20μl of laminin (1mg/ml, Sigma L-2020) in 980 μl cell medium for a final concentration of 0.02mg/ml. 20 μl aliquots of the laminin (1mg/ml) are stored at -80°C and thawed just prior to use. Thawing should occur on the bench top and not in the water bath as rapid thawing can sometimes lead to gelling of the laminin. Papain solution:23 Warm 10 ml of dissection solution (above) to 30-32°C. Add 200 units papain (Sigma P-4762) and 1.6 mg L-cysteine (Sigma C-7880). Adjust pH to 7.4 with about 14 μl of 0.1 N NaOH. Incubate for about 30 minutes until the solution clears, filter 0.2 μm, flash freeze with liquid nitrogen in 2 ml aliquots in 15 ml polypropylene sterile conical vials and store at -80°C. Thaw an aliquot at 35-37°C prior to starting protocol. Polyethyleneimine (PEI) solution:13 100 μl of PEI (50% w/v, Sigma P-3143) is diluted in 100 ml sodium borate buffer (0.1 M pH 8.4, Sigma B-9876) for a final concentration of 0.05% w/v. Sterile filter at 0.2 μm. This can be prepared in advance and stored at 4°C for months. Sterile de-ionized water: Autoclave and allow to cool to room temperature prior to use. Trypsin (0.25% with EDTA, Gibco 25200): 1ml aliquots are flash frozen and stored at -80°C. Aliquots are thawed in the 35-37°C water bath prior to use.